Summary
Dette arbeid beskriver en ny fremgangsmåte for selektiv målretting subcellulære organeller i planter, analysert ved hjelp av BioRad Gene våpenet.
Abstract
For å målrette en enkelt protein på flere subcellulære organeller, planter vanligvis duplisere de aktuelle gener, og hver uttrykker genet for seg ved hjelp av kompliserte regulerings strategier inkludert differensial promotere og / eller signalsekvenser. Metabolske ingeniører og syntetiske biologer som er interessert i målretting enzymer til en bestemt organell står overfor en utfordring: for et protein som er til å være lokalisert til flere organelle, må ingeniøren å klone det samme genet flere ganger. Dette arbeidet presenterer en løsning på denne strategien: utnytte alternativ spleising av mRNA. Denne teknologien utnytter etablerte kloroplast og peroksisom målretting sekvenser og kombinerer dem til ett enkelt mRNA som er alternativt skjøtes. Noen spleisevarianter blir sendt til kloroplasten, noen av peroksisom, og noen til cytosol. Her systemet er beregnet for multiple-organelle målretting med alternativ spleising. I dette arbeidet ble GFP forventet å være uttressed i kloroplast, cytosol, og peroxisome av en rekke rasjonelt utformet 5 'mRNA koder. Disse kodene har potensial til å redusere mengden av klonings nødvendig når heterologe gener som skal uttrykkes i flere subcellulære organeller. De konstruksjoner som er utformet i tidligere arbeider 11, og ble klonet ved hjelp av Gibson montering, en ligering uavhengig kloningsmetode som ikke krever restriksjonsenzymer. De resulterende plasmider ble innført i Nicotiana benthamiana epidermal bladceller med en modifisert Gene Gun protokollen. Til slutt ble forvandlet blader observert med konfokalmikroskopi.
Introduction
Dette arbeidet er en metabolsk ingeniør / syntetisk biologi prosjekt der planteceller er konstruert for å uttrykke en reporter protein i flere organeller, men med bare en enkelt DNA-konstruksjon.
En tilnærming for å målrette proteiner til mer enn ett sted innebærer kloning flere genetiske eksemplarer, hvert inneholdende en annen lokalisering peptid. Hvert eksemplar må være introdusert av suksessive retransformation, eller alternativt, ved tilbakekryssing enkelt forvandler en. Dette innebærer ytterligere kloning, og er begrenset av en lokaliseringssignal per terminus.
En annen måte til å lokalisere et protein til flere steder er gjennom alternativ spleising 2-5. RNA blir transkribert fra et enkelt gen, men forskjellige eksemplarer av transkripsjon blir behandlet på en annen måte, ofte i mer enn en måte per celle. Dette kan resultere i mer enn en messenger-RNA i celler transkribert fra et enkelt gen. Disse forskjellige Messenger RNA kan kode for forskjellige isoformer av det samme protein, eller i tilfelle av en frameshift, en annen protein helt. Selv om alternative spleising er blitt beskrevet i litteraturen for mange år, er de virkningsmekanismer og konservert donor-og reseptor-spleisesetene bare blir belyst mer nylig 6. Ettersom disse nettstedene blir bedre beskrevet, de åpner opp muligheter for engineering.
Plant metabolske ingeniører står overfor en utfordring når de uttrykker et protein i flere organeller. For et protein som er til å være lokalisert til flere organelle, må ingeniøren å klone det samme genet flere ganger, hver med en egen signalsekvens dirigere det til organeller av interesse. For et enkelt gen i tre organeller, er dette bare tre gener. Men for en seks-genet metabolismevei, utvides dette til 18 gener, en betydelig kloning innsats. Kombinere flere lokaliserings sekvenser i en enkelt, alternativt-skjøtes genet tegnreduserer ificantly dette arbeidet. For eksempel, re-engineering fotorespirasjon 7,8 og isoprenoid syntese 9,10 innebærer både kloroplaster og peroxisomes. I vårt tilfelle tok vi nytte av skjøtesteder som observert i en naturlig Arabidopsis thaliana system beskrevet tidligere seks. Vi rasjonelt redesignet mRNA sekvens forlater de naturlige spleisesetene alene, men plassert sekvenser som ville koder kloroplast-eller peroksisom målretting koder innenfor alternativt-skjøtes introner (figur 1). Det uttrykte protein kan eller ikke kan ha en kode, avhengig av hvorvidt pre-mRNA som kodet for det ble skåret ut som et intron (figurene 1g og 1t). For mer informasjon om design av konstruksjoner som presenteres i dette arbeidet, kan du se den ledsagende artikkel 11.
Fordi dette er fortsatt en betydelig kloning innsats, Gibson forsamlingen, en ny metode for kloning av DNA-konstruksjoner, er used i konstruksjonen. Den Gibson metode kan anvendes for en hvilken som helst sekvens, uavhengig av restriksjonsseter (Figur 2) 12-14. Den spesifikke blandingen av enzymer som gjør det mulig for en ett-trinns, isotermisk montering. I denne metoden, blir flere dobbelt-strengede DNA-lineære deler utformet slik at de har overlappende sekvenser av ~ 50 bp. The Gibson forsamlingen enzym blanding delvis fordøyer de lineære DNA deler, utsette enkelt tråder av homologe sekvenser. Disse partielle enkelt-trådede sekvenser er re-glødet i reaksjonsblandingen, noe som resulterer i en hurtig, ett-trinns, sekvensuavhengig, ligering fritt subkloning reaksjon.
Dette arbeidet beskriver en) rasjonell utforming alternativt skjøtes konstruksjoner for uttrykk i plante kloroplaster, peroxisomes og cytosols, 2) deres kloning ved hjelp av den nye ligation-fri metode for Gibson montering, 3) deres leveranse i tobakk blad celler med Gene Gun, og 4) resultater som viser organelle målretting, som observert med GFPog konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Design av Alternativt-skjøtes Sekvenser for Multiple Organelle målretting
- Bestem nettstedene for slutt protein uttrykk. For dette arbeidet, er interessen i målretting kloroplast, peroxisome, og cytosol.
- Bruk litteraturen for å identifisere protein-og DNA-sekvenser som er kjent for å målrette proteiner til organeller av interesse. I dette tilfellet en kloroplast målretting sekvens fra Arabidopsis thaliana L-isoaspartate methyltransferase 6,15, og en peroksisom målretting sekvens fra Arabidopsis thaliana transthyretin lignende S-allantoin synthase 16,17 ble bestemt.
- Identifisere en alternativ-skjøting regime som bør målrette proteiner av interesse til riktige organeller. For dette arbeidet, spleise nettsider som observert i en naturlig Arabidopsis system seks. MRNA sekvensen ble redesignet slik at den naturlige spleisesetene, men sekvenser ble plassert koding chloroplast-eller peroxisome-targeting koder innenfor alternativt-skjøtes introner (figur 1).
2. Gibson Montering av DNA deler
Se også figur 2.
Den Gibson Monteringsmetoden er avhengig av virkningen av flere enzymer i en ferdiglaget blanding til 1) delvis fordøye endene av dobbelt-trådet DNA er å lage enkelt-tråder og 2) anneal frie basepar av DNA nabodeler. Dette gjør det mulig for kloning av DNA-fragmenter uten begrensninger av restriksjonsseter.
- Velg en ordre for elementene i DNA plasmidkonstruksjonen. Som et eksempel TriTag-1 har elementer av: a) en plasmidvektor (Pore, inneholdende et GFP konstruksjon er kjent å arbeide i planter, en kanamycin resistens markør, og opprinnelsen av replikasjon av E. coli and Agrobacterium tumefaciens verter), b) et promoter-sekvens, (P ENTCUP2, vist seg å være konstitutivt i planter), C) en målsøkende sekvens kloroplast (CTS), c) en peroksisom målsøkende sekvens (PTS), og d) en serie av spleisesetene som beskrevet tidligere 6..
- Design konstruere basen-for-base med i silico design software. APE er en åpen kildekode freeware pakke nyttig for dette arbeidet.
Merk: TriTag-en, har rekkefølgen: plasmidvektor, promoter, ATG, spleise donor området, kloroplast target-sekvensen, spleise donor området, nøytralt område, spleise akseptorsete, peroxisome target-sekvensen, spleise akseptorsete, GFP som finnes i plasmidvektor .- Utform in silico DNA-konstruksjon, for eksempel at det er en 50-bp overlapping mellom hvert stykke ved bestilling av primere for PCR. Det er mulig å benytte den 50 bp overlapping som primere: 25 bp hver retning.
- Sørg for å holde oversikt over opprinnelsen til hver av de sekvens stykker. Er det som: et plasmid som skal dyrkes og minipreparerte; en lineær sekvens som kan brukes som en PCR-mal; eller en sekvens som vil trenge å blisyntetisert kommersielt? Flere selskaper tilbyr lavkost DNA syntese tjenester for fragmenter <500 bp. I dette tilfellet, den TriTag selv er 437 bp, så det var en fordel å bestille den kommersielt.
- De beste resultatene kommer hvis alle fragmentene er PCR-forsterket og renset fra sin mal DNA. Motstanden markør er et bra sted for å dele denne store DNA i to mindre maler som er lettere PCR-forsterket.
- Begrensning Restriksjonsenzym DpnI kutter denaturert DNA. Hvis PCR malen var en miniprep fra E. coli, vil DpnI behandling fjerne forurensende mal DNA.
- Utform in silico DNA-konstruksjon, for eksempel at det er en 50-bp overlapping mellom hvert stykke ved bestilling av primere for PCR. Det er mulig å benytte den 50 bp overlapping som primere: 25 bp hver retning.
- Rens alle DNA-sekvenser hver for seg, og elueres med vann, TE eller buffer EB.
- Pore vektor del 1, ~ 3000 bp (grønne piler). PCR forsterket og DpnI behandlet.
- Pore vektor del 2, ~ 3000 bp (svarte piler). PCR forsterket og DpnI behandlet.
- TriTag innsats, 437 bp (blå piler). Bestilt kommersielt. Resuspend i DDH 2 O.
- P ENTCUP promoter, ~ 750 bp (oransje piler). PCR-forsterket og DpnI behandlet.
- Måle konsentrasjonen av hver av de DNA-stykker. Sikt på 150 ng / mL av vektor stykker.
- Ta en delmengde av Gibson forsamlingen blanding ut av fryseren og tine på is. Dette er kommersielt tilgjengelig, men også lett å foreta i laboratoriet 12-14.
- Det er to trinn til denne oppskriften: en tyktflytende 5x mester mix og 15 mL reaksjon størrelse 1.33x mengdene. Den 5x konsentrat-blanding inneholder 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 pl 1 M MgCl2, 600 ul 10 mM av hver dNTP, 300 pl 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD og DDH 2 O til 6 ml. Forbered 320 mL alikvoter (18) og fryse alle unntatt en ved -20 ° C. Løsningen vil være ganske tyktflytende. Merke disse "5X isotermen buffer"
- Til den ene gjenværende (320 mL), tilsett 1,2 mL T5 Exonuklease, 20 mL Phusion Høy Fidelity DNA Polymerase, 160 mL Taq DNA Ligase og 700 mL DDH 2 O. Forbered 15 ul delprøver (~ 80) på isen i PCR-rør og oppbevar ved -20 ° C.
- Bestem volumer for ekvimolare mengder av hvert av fragmentene. Det er noen online kalkulatorer, inkludert Gibthon.org. Det bør være i alt 5 pl av alle DNA-stykker. Legg dem til 15 mL Gibson blande delmengde. Hvis dette krever volum for lite til pipette, fortynne DNA-fragmenter og / eller bruke mer enn én porsjon.
- Husk å forberede en kontroll av vektor-DNA alene (for eksempel DNA-delen som inneholder den antibiotiske resistens markør), og utgjør volumet med vann.
- Inkuber rørene i en termosykler ved 50-55 ° C i 30-60 minutter. Bytt ut på isen og forvandle seg til E. coli via varme-sjokk kjemisk kompetente celler. Ikke bruk electrocompetent celler. Den høye saltkonsentrasjon og den relativt lave DNA-konsentrasjonkan føre til at cellene å bue.
- Påfør alle 20 ul til en kommersiell fremstilling av 200 pl kalsium-klorid kompetent E. coli.
Inkuber på is i 30 minutter og varmesjokk 60 sek ved 42 ° C - Tilbake til is 2 min, anvende 750 pl SOC-eller LB medium og gjenopprette rysting i et mikrosentrifugerør i 30 minutter ved 37 ° C. Plate blandingen og passende fortynninger på LB + Kan (eller andre passende antibiotika). Dette kan resultere i høyere bakgrunn (og et høyere antall ikke-target rekombinasjon hendelser) enn tradisjonelle ligation basert kloning, men det er verdt å skjerme ca 10 kolonier.
- Påfør alle 20 ul til en kommersiell fremstilling av 200 pl kalsium-klorid kompetent E. coli.
- Bekreft klon via sekvens og lagre en aliquot ved -80 ° C
Tre. Biolistic Transfection av tobakk med Gene Gun
Dette er en teknikk som er etablert i Jove 18,19. Viktige skritt og forskjeller er beskrevet nedenfor.
- Grow 50-100 ml E. coli eller 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep kulturen. En konsentrasjon på 1500 ng / mL er nødvendig for å fortsette.
- Forbered genet pistol kuler som beskrevet tidligere. Legg dem inn i Gene Gun.
- For transfeksjon av Nicotiana benthamiana tobakk blad epidermal vev, velge et stort blad nær bunnen av en tre måneder gammel plante. Klippe den forsiktig og legg den opp ned på vått tørkepapir i en 15 cm petriskål.
- Still Han press for Gene Gun til 200-250 psi.
- Nøye mål Gene Gun mellom ribbene på undersiden av et blad, ca 3-5 cm over den. Slipp sikkerhets og levere partiklene til bladet. Hver kule kan anvendes to ganger på samme sted på bladet. Hvis bladet eksploderer, kast og starte et nytt blad-det er noe variasjon i blad seighet pga vekstforhold som alder, fuktighet, etc. For en 12-cm blad, forventer å passe ca seks skudd.
- Oppbevar blad, dekket med toppen av enPetriskål for 2-3 dager i dårlig lys på benken.
- Undersøk blad i en dissekere mikroskop utstyrt med UV-fluorescens, og søke etter individuelle celler som uttrykker GFP. Dissekere 5-10 mm seksjoner av blad.
- Senk bladet i en dyp brønn objektglass i henhold til ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Vaskemiddelet hindrer luftbobler fra å danne på overflaten, og det dyp brønn objektglass gjør det mulig for et større vev avbildningsområde.
4. Konfokalmikroskopi av transfektert Tissue
Disse instruksjonene variere for hvert instrument, så er det viktig å få skikkelig trent.
- For eksperimenter fluorescens deteksjon, sette eksitasjon laser til 489 nm, og sette fotomultiplika detektorer til 500-569 nm for GFP fluorescens og 630-700 nm for klorofyll auto-fluorescens. Bilde celler ved hjelp av en 40x vann-nedsenking objektiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design innsats var et resultat av betydelig planlegging. Novel i dette prosjektet er bruk av alternativ spleising for å lage en pre-mRNA som er omregnet til differensielt uttrykte proteiner. Disse proteiner blir uttrykt i forskjellige organeller, i dette tilfellet kloroplast, peroksisom og / eller cytosol. Vi innrettet naturlig Arabidopsis gen som er alternativt spleiset til 6, og plassert kjent kloroplast 6 og peroksisom 17 rettet sekvenser i alternative eksoner (TriTag-1 og TriTag-2). TriTag-3 består av en peroksisom-signal integrert i en lav kompleksitet region av kloroplast-sekvensen. Disse ble plassert i ramme med GFP (figur 1).
De plasmider som ble anvendt i denne studien, inneholdt således flere elementer: native alternativ spleising regime fra PIMT2 gene 6, kloroplast og peroksisom rettet sekvenser, GFP, og et plasmid ryggrad. Siden de har svært specific påkrevet sekvens er en sekvens uavhengig fremgangsmåte nødvendig. Den Gibson montering protokoll 12,13 kan brukes på alle sekvenser så lenge som de konstituerende deler er utformet med sekvenslikhet med hverandre, og ikke inneholder gjentatte sekvenser. I korte trekk, blir lineære DNA-fragmenter bygget (enten via PCR amplifikasjon, kommersiell syntese eller nedbrytning av et pre-laget plasmid), slik at de har ~ 50 bp av overlappende homologe sekvensen (figur 2). Ekvimolare mengder av hver av de DNA-fragmenter som er kombinert i et enkelt rør som inneholder Gibson montering blanding, inkubert ved 50 ° C i en time, og transformeres i E. coli. De plasmider som følge av Gibson montering protokollen ble bekreftet av Sanger-sekvensering.
I denne studien de tre forskjellige GFP organelle-targeting konstruerer ble sammenlignet med untagged GFP og en Rubisco-merket GFP. Konfokalmikroskopi ble brukt til å oppdage GFP fluorescens i SIngle celler forbigående forvandlet. I kontrollforsøk ble den forbigående ekspresjon observert korrelert til kloroplastene (lett identifiserbare ved den røde autofluorescens av klorofyll), kjernen (store organelle som ikke er en kloroplast og har bare en per celle), og / eller små organ antas å bli peroxisomes. Grønn (GFP) og røde (klorofyll autofluorescence) kanaler ble kledde å studere intracellulær lokalisering (figur 3). For en mer utfyllende drøfting av disse resultatene, vennligst se vår følgesvenn artikkel 11.
Som spådd, i alle tre doble målretting konstruerer, ble GFP observert i kloroplaster (figur 4) i overlay confocal mikrografer. TriTag-1 og TriTag-2 target GFP også til cytosol og den lille organ antas å være den peroksisom (figurene 4a og 4b, henholdsvis). TriTag-tre mål GFP til bare kloroplast og peroksisom, men ikkecytosol (figur 4c). En oppsummering av resultatene er vist skjematisk (Figur 5).
Figur 1. Utforming av alternativ spleising konstruerer for differensial organelle uttrykk i Nicotiana benthamiana. Splice diagrammer av (a) TriTag-en, (b) TriTag-2, og (c) TriTag-3 som viser ikke-targeting sekvenser (grå), kloroplast målretting sekvenser (lys grønn), peroksisom rettet sekvenser (oransje), og GFP kodende sekvens som brukes i gående uttrykk eksperimenter. TriTag-en og TriTag-2 består av alternativ spleising konstruksjoner; TriTag-3 består av en peroksisom-signal integrert i en lav kompleksitet region av kloroplast-sekvensen. Sekvenser av
Figur 2 Skjematisk for Gibson montering:.. En ny metode for montering av overlappende DNA-fragmenter The Gibson forsamlingen metode for plasmid konstruksjon 12,13 er raskt erstattet tradisjonell begrensning-ligation kloning i mange laboratorier. I hovedsak kan man designe en konstruksjon i silikon som inneholder DNA av interesse akkurat, sammensatt av PCR produktene forsterket fra ulike kilder. Utforme primere som er komplementær til hverandre, og PCR-forsterke hvert fragment med de fargede primere. Til alle bitene i et enkelt rør med enzymblandingen, og å transformere E. coli kompetente celler. Klikk her for å vise lArger image.
Figur 3. Kontroll behandlinger bombardert inn N. benthamiana blad epidermal cellene. (ac) ukodede GFP. (a) Green kanalen. Ukodede GFP er uttrykt i kjernen og rundt cellens omkrets, svarende til cytosol, men ikke vakuole. (B) Red kloroplaster indikerer autofluorescens av klorofyll. (C) overlegget. I denne konstruksjon fluorescens observert i kjernen og cytosol bare, men ikke de kloroplaster. (Df) Kloroplast-merket GFP kontroll. (D) Grønn kanal. GFP er uttrykt i de store organeller, med en celle som skissert. (E) Røde kloroplaster indikerer autofluorescence av klorophyll. (f) overlegg. I dette tilfellet gule kloroplaster er observert, noe som indikerer at GFP (grønt) er rettet til kloroplast. Gjengitt med tillatelse 11. Klikk her for å se større bilde.
Fig. 4. Tri-Tag-1, 2, 3 tagget GFP fusjonert bilder. (A) Tri-Tag1. I dette tilfellet gul chloroplast periferier er observert, noe som indikerer at GFP er rettet til kloroplast. GFP er også observert i cytosol samt små punctate organeller som kan være peroxisomes. (B) Tri-Tag2. I dette tilfellet gul chloroplast periferier er observert, noe som indikerer at GFP er rettet til c hloroplast. GFP er også observert i cytosol, samt små punctate organeller som kan være peroxisomes. (C) Tri-Tag3. I dette tilfelle gule kloroplaster er observert, så vel som små punctate organeller som kan være peroxisomes. Men GFP ikke er observert i cytosol. Gjengitt med tillatelse 11. Klikk her for å se større bilde.
Figur 5. Avdelinger av en typisk tobakkblad epidermal celler. Her deres relative størrelser og plasseringer innenfor cellen er vist, og de relative uttrykk nivåer observert via konfokal mikroskopi. Gjengitt med tillatelse 11./ 51234/51234fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien, er enkle strategier er beskrevet for å lokalisere en enkelt transgene proteiner til flere cellene i planter. Målet var å designe konstruksjon som ville uttrykke et enkelt gen i mer enn ett organelle i Nicotiana benthamiana. Strategier inkluderer rasjonell utforming av GFP-basert DNA-konstruksjoner, Gibson montering, levering av plasmidene til bladceller med Gene Gun, og observasjon av resultatene med konfokalmikroskopi.
Tre forskjellige korte, N-terminal kodene ble designet for samtidig kloroplast, peroxisome og cytosol målretting 11. Disse "TriTags" ble designet ved å kombinere naturlig forekommende DNA'er koder alternativt skjøtes mRNA som direkte kodede proteiner til enten kloroplast pluss cytoplasma 6 eller peroksisom pluss cytoplasma 17. TriTag-3 ikke er avhengig av alternativ spleising og består av en kloroplast målretting sekvens der en naturally ustrukturert del har blitt erstattet med en peroksisomal targeting sekvens 15,17. Den TriTags funksjon in vivo for å målrette GFP i Nicotiana benthamiana blad epidermal cellene (Figur 5).
Confocal mikrografer viser at TriTag-1 og TriTag-2 target GFP til kloroplasten, peroksisom, og cytosol effektivt, men med preferanse for kloroplast og peroksisom, henholdsvis (figurene 4a og 4b). TriTag-3-mål GFP bare til kloroplasten og peroksisom, men ikke cytosol (figur 4c). I det hele tatt, kan disse kodene redusere tid og ressurser brukt på kloning for anleggs metabolske engineering, spesielt for de som trenger spesifikke uttrykk i kloroplaster og peroxisomes.
Modifikasjoner og feilsøking
De TriTags som for tiden bygget er ganske statisk. Men underlying-teknologi, alternativ spleising å tillate oversettelse av ulike stedsspesifikke koder, er fleksibel. De eksisterende chloroplast og / eller peroksisom spesifikke koder kan endres til noe annet organelle, det være seg utskillelsen pathway, mitokondrie, en ER bolig tag, vakuole. Disse kan også kombineres med vev-spesifikke arrangører, for eksempel for frøene, blomstene, røtter, blader, stengler, etc.
For et prosjekt som dette, Gibson forsamlingen metoden 12-14 for kloning av konstruksjoner er ideelt. Det er en enkel, kraftig verktøy for å subclone enhver sekvens uten begrensningene til restriksjonsseter. I ett-trinns reaksjoner, Gibson forsamlingen raskt skapte konstruerer og kontroller med minimal innsats i kloning. Den Gibson montering teknikk er nesten uendelig modifiserbare for en hvilken som helst ønsket sekvens, så lenge malen sekvenser kan PCR-amplifisert. Selv om i dette eksempel Gibson montasje ble vist med et fordøyd plasmid, PCR-forsterke vektoren har en tendens til å fungere bedre enn å bruke en fordøyd miniprep.
The Gene Gun er en rask, effektiv metode for transient transfeksjon av celler, som har blitt etablert av dette tidsskriftet 18,19. Nicotiana benthamiana har store, lobate blad epidermal cellene, som begge er ideelle for transfeksjon med Gene Gun, men også for observere med konfokalmikroskopi. Protokollen for å lage kuler er godt etablert. Gull har vært brukt som en mikrobærer i de fleste eksperimenter i litteraturen hittil, men nylig wolfram mikrobærere er tilgjengelig til lav pris.
Begrensninger av teknikkene
En vesentlig begrensning av Gibson fremgangsmåte er nærværet av gjentatte sekvenser: jo lengre overlappende region er færre biprodukter resultat. Fordøyelse av PCR produktene med DpnI bør fjerne forurensende plasmid maler; som vanligvis er kilden for sideprodukter. Enzymene fordøye DNA-fragmentene fra dobbelt-trådet DNA inn i enkelt-trådet. Tilstedeværelsen av gjentatte sekvenser nær endene (~ 1 kb) av de DNA-fragmenter som i betydelig grad øker muligheten for feilaktig rekombinasjon. I tillegg gjentar innenfor sekvensene også utgjøre en begrensning: det er ikke godt kjent, og vanskelig å kontrollere hvor langt T5 exonuclease tygger sikkerhets enkelttrådet DNA. Den raske aktivitet av exonuclease er varmebehandlet ved høy reaksjonstemperatur (50-55 ° C) til slutt denaturere enzymet, og viskositeten redusere den samlede bevegelse i løsningen. For mer finjustering av reaksjonstrinn, sekvens-og ligering uavhengig kloning (SLIC) 20 er foretrukket.
En større begrensning av genet gun teknikken er at den produserer bare av størrelsesorden 1-10 transient transformerte celler per skudd event.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
The Gibson forsamlingen teknikken er nyter rask adopsjon for sin letthet, fleksibilitet og tilpasningsevne. Det er en raskere protokoll enn tradisjonelle restriksjons / ligering kloning, og som ikke krever spesielle sekvenser slik som dem som kreves for restriksjonsfordøyelse. Det er ikke begrenset til to eller tre fragmenter som skal rekombinerte; de opprinnelige forskere har demonstrert det med hell for opp til 10 deler, om enn med begrenset effektivitet. For mange forskere Gibson montering gjør for et større antall positive kloner.
For flere transformants med Biolistic teknikker, eller for etablering av transform callus vev, bør bruken av et kabinett-stil biolistic enhet (f.eks BioRad PDS-1000) brukes. En alternativ metode er Agrobacterium infiltrasjon.
Fremtidige Applications
Gibson montering tillater større og større klynger av DNA som skal monteres, idet punktet hvor en maksimumsgrense ikke har blitt observert. De opprinnelige forfatterne har brukt det til å sette sammen flere hundre kilobaser DNA 13.
Evnen til å selektivt målrette flere organeller med en enkelt genetisk konstrukt har potensiale til å redusere antall gener som trenger å bli transformert. Levering av større og større DNA-fragmenter (og dermed større metabolske pathways) er en kort sikt mål. Isoprenoid veier har blitt levert til kloroplast av biolistic metoder; andre genet klynger som alternative karbonfiksering trasé er i horisonten.
Kritiske trinnene i protokollen.
I Gibson montering, være sikker på at malen sekvenser har ikke homologi til hverandre, bortsett fra på målet rekombinasjonsseter.
I biolistic transformasjon av Nicotiana planter, være nøye med å holde genet pistolen ca 10-15 cm over bladene ennd holde helium press på 200-250 psi. Nærmere enn det, vil den skjøre blad eksplodere, og lenger enn at de ikke vil være godt forvandlet. To dager etter transfeksjon et blåmerke skal vises på bladet hvis det er riktig forvandlet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Jen Sheen of Massachusetts General Hospital for den generøse donasjonen av Nicotiana benthamiana frøplanter. Jen Bush hjalp oss sterkt i råd i voksende planter, og sette opp et vekstkammer området. Tom Ferrante av Wyss Institute tilbudt avgjørende hjelp med konfokalmikroskopi. Forfatterne ønsker spesielt å takke Don Ingber av Children Hospital Boston og Wyss Institutt for sjenerøs donasjon av en Gene Gun og tilhørende utstyr. Midler til dette prosjektet ble gitt gjennom en samarbeidsavtale med Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000079) for PAS, JCW, og MdM, og gjennom Chimerion Bioteknologi, Inc. for MJV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants - coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
