Transient genuttryck i Tobaks använder Gibson församling och Gene Gun
Summary
Detta arbete beskriver en ny metod för att selektivt rikta subcellulära organeller i växterna, analyserades med användning av BioRad Gene Gun.
Abstract
För att rikta ett enda protein till flera subcellulära organeller, växter duplicera vanligtvis relevanta generna, och uttrycka varje gen för sig med hjälp av komplexa regulatoriska strategier inklusive differentialtagare och / eller signalsekvenser. Metabola ingenjörer och syntetiska biologer som är intresserade av att rikta enzymer till en särskild organell står inför en utmaning: För ett protein som är att vara lokaliserad till mer än en organell, måste ingenjören klona samma gen flera gånger. Detta arbete presenterar en lösning på denna strategi: att utnyttja alternativ splitsning av mRNA. Denna teknik utnyttjar etablerade kloroplast och peroxisome inriktning sekvenser och kombinerar dem till en enda mRNA som alternativt skarvas. Vissa splitsningsvarianter skickas till kloroplasten, en del till den peroxisom, och en del till cytosolen. Här är systemet utformat för flerorganellriktad med alternativ splitsning. I detta arbete var GFP förväntas vara uttryckEssed i kloroplasten, cytosolen, och peroxisome genom en serie av rationellt utformade 5 'mRNA-taggar. Dessa taggar har potential att minska mängden kloning krävs när heterologa gener behöver uttryckas i flera subcellulära organeller. Konstruktionerna utformades i tidigare arbeten 11, och klonades med användning av Gibson montering, en ligering oberoende kloningsmetod som inte kräver restriktionsenzymer. De resulterande plasmiderna infördes i Nicotiana benthamiana epidermal bladceller med en modifierad Gene Gun-protokollet. Slutligen har transformerade blad observeras med konfokalmikroskopi.
Introduction
Detta arbete är en metabolisk ingenjörs / syntetisk biologi projekt där växtceller för att uttrycka en reporter protein i flera organeller, men med bara en enda DNA-konstruktion.
Ett tillvägagångssätt till målproteiner till mer än ett läge innebär klonings flera genetiska kopior, var och en innehållande en annan lokalisering peptid. Varje kopia måste införas genom successiv återtransformation eller alternativt genom tillbakakorsning enstaka transformer 1. Detta innebär ytterligare kloning, och begränsas av en lokalisering tagg per terminal.
Ett annat sätt att lokalisera ett protein till flera platser är genom alternativ splitsning 2-5. RNA transkriberad från en enda gen, men olika exemplar av transkriptet bearbetas på olika sätt, ofta i mer än ett sätt per cell. Detta kan resultera i mer än en budbärar-RNA i cellen som transkriberats från en enda gen. Dessa olika väR-RNA kan koda för olika isoformer av samma protein, eller i fallet med en läsramsförskjutning, ett annat protein helt och hållet. Trots att alternativ splitsning har beskrivits i litteraturen under många år, är de verkningsmekanismer och bevarad donator och receptor-splitsningsställen bara att belysas senare 6. Eftersom dessa platser håller bättre beskrivas, de öppnar upp möjligheter för teknik.
Växt metabola ingenjörer står inför en utmaning när man uttrycker ett protein i flera organeller. För ett protein som ska lokaliseras till fler än en organell bör installatören klona samma gen flera gånger, var och en med en separat signalsekvensen att rikta den till organellen är av intresse. För en enda gen i tre organeller, detta är helt enkelt tre gener. Men för en sex-gen metaboliska väg, utvidgar detta till 18 gener, en betydande kloning ansträngning. Kombinera flera lokaliseringssekvenser till en enda, alternativt skarvade gen teckenificantly minskar denna insats. Till exempel, re-engineering photorespiration 7,8 och isoprenoid syntes 9,10 involverar både kloroplaster och peroxisomerna. I vårt fall tog vi fördel av splitsningsställen som observerats i en naturlig Arabidopsis thaliana systemet beskrivits tidigare 6. Vi omgjorda rationellt den mRNA-sekvens som lämnar de naturliga splitsningsställen ensam, men placeras sekvenser som skulle koda kloroplast-eller peroxisom-targeting tags inom de alternativt-splitsade intron (Figur 1). Det uttryckta proteinet kan eller kan inte ha en etikett, beroende på om den pre-mRNA som kodade för det skars ut som ett intron (fig. 1g och 1h). För mer information om utformningen av konstruktioner som presenteras i detta arbete, se följeslagare artikel 11.
Eftersom detta är fortfarande en betydande klonings ansträngning, Gibson församling, en ny metod för kloning av DNA-konstruktioner, är used i byggandet. Den Gibson-metoden kan användas för någon sekvens, oberoende av restriktionsställen (Figur 2) 12-14. Den specifika blandningen av enzymer möjliggör en en-stegs, isotermisk montering. I denna metod är flera dubbelsträngade linjära DNA-delar utformas så att de har överlappande sekvenser av ~ 50 bp. Den Gibson montering enzymblandning smälter delvis de linjära DNA-delar, utsätta enstaka trådar av homologa sekvenser. Dessa partiella enkelsträngade sekvenser åter glödgades i reaktionsblandningen, vilket resulterar i en snabb, en-stegs, sekvensoberoende, ligering fria subkloning reaktion.
Detta arbete beskriver ett) rationella konstruktion alternativt splitsade konstruktioner för uttryck i växt kloroplaster, peroxisomer och cytosols, 2) deras kloning med hjälp av den nya ligation-fri metod för Gibson församling, 3) deras leverans i tobaksbladceller med Gene Gun, och 4) resultat som visar organell inriktning, som observerats med GFPoch konfokalmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie är enkla strategier har beskrivits för att lokalisera en enda transgena proteiner till flera cellulära utrymmen i växter. Målet var att designa konstruktion som skulle uttrycka en enda gen i mer än en organell i Nicotiana benthamiana. Strategier innefattar rationell design av GFP-baserad DNA-konstruktioner, Gibson montering, leverans av plasmiderna till bladceller med Gene Gun, och observation av resultaten med konfokalmikroskopi.
Tre olika korta, N-terminal tag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Jen Sheen i Massachusetts General Hospital för den generösa donationen av Nicotiana benthamiana plantor. Jen Bush hjälpt oss mycket i rådgivning i odling av växter och inrätta en tillväxtkammare område. Tom Ferrante av Wyss Institutet erbjöd avgörande hjälp med konfokalmikroskopi. Författarna vill särskilt tacka Don Ingber av Barnsjukhuset Boston och Wyss Institutet för den generösa donationen av en Gene Gun och tillhörande förbrukningsmaterial. Finansieringen för detta projekt tillfördes genom ett samarbetsavtal med Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E Award # DE-000.079) för PAS, JCW, och MdM, och genom Chimerion Biotechnology, Inc. för MJV.
Materials
| Oligonucleotide primers | IDT | (custom) | Design specifically for construct |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp oligonucleotides |
| ApE software | U Utah | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | Used to purify PCR products |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid |
| Phusion Master Mix with GC Buffer | NEB | M0532S | Used to PCR-amplify gene of interest |
| Gibson assembly reaction mix | NEB | E2611L | Master mix of the following 9 ingredients |
| 1 M Tris-HCl pH7.5 | Teknova | T1075 | Gibson assembly mix |
| 1 M MgCl2 | G Biosiences | 82023-086 | Gibson assembly mix |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | Gibson assembly mix |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson assembly mix |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson assembly mix |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson assembly mix |
| T5 exonuclease | Epicentre | T5E4111K | Gibson assembly mix |
| Phusion polymerase | NEB | F530S | Gibson assembly mix |
| Taq DNA ligase | NEB | M0208L | Gibson assembly mix |
| Gibthon.org | Website to simplify calculations | ||
| Plasmid PLUS Maxi kit | Qiagen | 12963 | Used to prepare DNA for gene gun bullets |
| Gene Gun system | BioRad | 165-2451 | Includes all parts necessary |
| Nicotania benthamiana | (n/a) | (n/a) | Gift of Jen Sheen, MGH |
| Confocal microscope | Leica | SP5 X MP | Imaging of resultant cells |
| Deep well slides | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | Used for confocal imaging |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon:Ligation calculator | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
References
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements. Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).
- Hickey, S. F., et al. Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon. Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).
- Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. Alternative splicing in plants – coming of age. Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).
- Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).
- Dinkins, R. D., et al. Changing transcriptional initiation sites and alternative 5′- and 3′-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).
- Kebeish, R., et al. Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana. Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).
- Maier, A., et al. Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement. Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).
- Kumar, S., et al. Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts. Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).
- Sapir-Mir, M., et al. Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes. Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).
- Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5′ mRNA tags. Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
- Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
- Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).
- Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
