Summary
हम एक वाई भूलभुलैया परख का उपयोग ड्रोसोफिला व्यवहार पर odorants के प्रभाव प्रकट करने के लिए एक विकल्प परीक्षण प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
जानवरों को अपने अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए पर्यावरण से संकेतों का पता लगाने के लिए आवश्यक है. इस उद्देश्य के लिए, वे सीधे संपर्क के माध्यम से या लंबी दूरी तक मार में अभिनय एक अस्थिर अणु के जवाब का प्रतिनिधित्व करता है जो गंध, के माध्यम से, ऐसी दृष्टि, mechanoreception, सुनवाई, और स्वाद के माध्यम से chemoperception के रूप में पर्यावरण cues का उपयोग करें. अस्थिर रासायनिक अणुओं खतरा, भोजन के स्रोत, या व्यक्तियों के बीच संवाद करने का पता लगाने में सबसे जानवरों के लिए बहुत महत्वपूर्ण संकेत हैं. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर महक के सेलुलर और आणविक आधार का पता लगाने के लिए वैज्ञानिकों के लिए सबसे आम जैविक मॉडलों में से एक है. इस छोटे से कीट की घ्राण क्षमताओं को उजागर करने के लिए, हम प्रतिष्ठित चूहों के साथ प्रयोग किया जाता वाई भूलभुलैया परीक्षण के आधार पर एक संशोधित चुनाव प्रोटोकॉल का वर्णन. वाई mazes के साथ प्राप्त आंकड़ों बेहतर जानवरों को उनके सदा बदलते माहौल से निपटने के लिए समझने की बहुमूल्य जानकारी दे. हम अध्ययन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का परिचयइस वाई भूलभुलैया परख का उपयोग कर मक्खी खोजपूर्ण प्रतिक्रिया पर odorants का प्रभाव.
Introduction
स्वाद या गंध के माध्यम से Chemoreception पशु अस्तित्व के लिए एक प्रमुख संवेदी साधन है. यह महत्वपूर्ण एक खतरा है या खाद्य स्रोतों का पता लगाने के लिए आवश्यक संकेत, साथ ही साथ सामाजिक संबंधों के लिए देता है. यह भी उनके प्रजनन के लिए आवश्यक एक सेक्स पार्टनर खोजने के लिए जानवरों में मदद करता है. 20 से अधिक वर्षों के लिए, नोबेल पुरस्कार "odorant रिसेप्टर्स और घ्राण प्रणाली के संगठन की अपनी खोजों के लिए" 2004 में रिचर्ड एक्सल और लिंडा बक से काम जीतने सहित गहन अनुसंधान, आणविक और सेलुलर अड्डों प्रकट करने के लिए किया गया है बाहर महक 1,2.
घ्राण धारणा टुकड़े करना वैज्ञानिकों के लिए पसंदीदा जानवर मॉडलों में से एक डी. है मेलानोगास्टर. इस कीट स्तनधारियों के साथ एक समान सेलुलर और आणविक गंध कोडिंग रणनीति शेयरों. वैज्ञानिक समुदाय इस फल मक्खी में odorants की भूमिका का अध्ययन करने के लिए विविध व्यवहार मानदंड का उपयोग करता है. इन परीक्षणों में इस तरह courtshi रूप बहुविध assays शामिलमहक सहित विभिन्न संवेदी तौर तरीकों,, पुरुष प्रेमालाप 3 बटोर लिए महत्वपूर्ण हैं जहां पी परीक्षण. अन्य assays भी अधिक विशेष रूप से odorants की भूमिका से निपटने के लिए विकसित किया गया है; इन टी mazes, वाई mazes, जाल assays, चार क्षेत्र एरेनास और पवन सुरंगों 4,5,6,7,8 शामिल हैं.
इस लेख में हम डी. का उपयोग कर मजबूत घ्राण प्रतिक्रियाओं प्रदान करता है जो एक साधारण संशोधित वाई भूलभुलैया परख, पेश मेलानोगास्टर. हमारे सेट अप एक पहले से वर्णित विधि 9 के विपरीत अंत सुझावों का उपयोग करता है. इस प्रकार, हमारी वाई भूलभुलैया दो फायदे हैं. मक्खी उसकी पसंद बना दिया है एक बार सबसे पहले, यह प्रणाली में किसी भी वापसी से बचा जाता है. दूसरा, यह वाई भूलभुलैया के सभी क्षेत्रों में odorants के आदान प्रदान को सीमित करता है. ड्रोसोफिला अक्सर odorant संतृप्ति से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो हवा का प्रवाह करने के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं क्योंकि यह पिछले लाभ महत्वपूर्ण है. एक हवा का प्रवाह के साथ प्रयोगात्मक सेट अप को समायोजित करने के लिए समय और लागत लगता होगा. इसलिए, हमारे वाई भूलभुलैया परख एक एफई का प्रतिनिधित्व करता हैficient और ड्रोसोफिला की घ्राण प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए तेजी से रास्ता.
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Protocol
1. शुरू करने से पहले
- स्थिर और मजबूत व्यवहार phenotypes असर एक isogenized संदर्भ शेयर करें. सभी संभावित नियंत्रण विषम पृष्ठभूमि alleles ले सकता है, के बाद से इस शेयर को चुनने के लिए कोई सामान्य नियम नहीं है.
- बाद के चरणों के लिए आवश्यक हर दूसरे शेयर backcross को इस पर नियंत्रण तनाव का प्रयोग करें. इस backcrossing कदम आम तौर पर 2-3 isogenic संदर्भ पुरुषों से 5 (संभव क्रॉसिंग ओवर के मुताबिक़ क्रोमोसोम के बीच की अनुमति के लिए) एक भी कुंवारी महिला की कम से कम 5 लगातार पार का प्रतिनिधित्व करती है. यह कदम विभिन्न मक्खी शेयरों के बीच आनुवंशिक पृष्ठभूमि homogenize करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- 25 में एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र में एंटीबायोटिक (0.4% मिथाइल पैरा हाइड्रोक्सी बेंजोएट) के साथ पूरक एक मानक मकई का आटा (9%), खमीर (10%), और अगर मध्यम (1.5%) पर ड्रोसोफिला शेयरों को बनाए रखने डिग्री सेल्सियस
- एक तापमान नियंत्रित कक्ष दूर लाल बत्ती के तहत (25 डिग्री सेल्सियस) में chemosensory प्रयोगों पाना(दृश्य cues के योगदान को समाप्त करने के लिए, और chemosensory संकेतों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए). नियमित रूप से प्रत्येक प्रयोग के बीच क्षेत्र हवादार कमरे की हवा को नवीनीकृत.
एक वाई भूलभुलैया परख का उपयोग 2. घ्राण रिस्पांस
- परीक्षण से पहले गीला कागज तौलिया युक्त ग्लास ट्यूब में 25 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए मक्खियों को भूखा.
- दो कांच की शीशियों के लिए और एक छोटे प्लास्टिक की शीशी (लोडिंग शीशी) को एक वाई आकार योजक में शामिल हों. तीन शीशियों को कनेक्टर से जोड़ने के लिए, और एक कसकर मोहरबंद वाई भूलभुलैया प्राप्त करने के लिए फोम stoppers के माध्यम से पारित है कि 1 एमएल पिपेट युक्तियों का उपयोग करें. दो "जाल" शीशियों के लिए फार्म, और एक विंदुक टिप का एक बड़ा अंत "लोड" के लिए फार्म (यह अपने निर्णय बना दिया है एक बार मक्खी के किसी भी वापसी से बचने के लिए ~ 2 मिमी व्यास,) दो पिपेट सुझावों की संकीर्ण समाप्त होता है कट ट्यूब (चित्रा 1 ए).
- बस "जाल" शीशियों (चित्रा 1 बी) को जोड़ने से पहले, में एक ~ 6 मिमी व्यास फिल्टर पेपर जगहप्रत्येक शीशी. एक फिल्टर पेपर पर odorant समाधान के 40 μl, और दूसरा फिल्टर पेपर पर इसी विलायक के 40 μl जोड़ें.
- "लोड" शीशी में दस 4-9 दिन पुरानी मक्खियों का परिचय. यह व्यवहार 10 पर एक मजबूत प्रभाव है, के बाद से इस हस्तांतरण के दौरान सीओ 2 संज्ञाहरण का उपयोग न करें. बल्कि बर्फ पर संक्षिप्त ठंडा का उपयोग करें. Anaesthetized मक्खियों की समुचित हेरफेर जितना संभव विषयों पर तनाव को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- दृश्य उत्तेजनाओं जितना संभव से बचने के लिए (संभव हीटिंग स्रोत सीमित करने के लिए एलईडी बल्बों का प्रयोग करके) दूर की लाल बत्ती के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर वाई भूलभुलैया परीक्षण की एक श्रृंखला प्रदर्शन. (चित्रा 1C बाईं तरफ, या सही पर odorant युक्त ट्यूब, और लदान ट्यूब सामने या पीठ में) वाई mazes के झुकाव वैकल्पिक करने के लिए सावधान रहें.
- मक्खियों के लिए कई घंटे odorant या विलायक युक्त जाल शीशी में प्रवेश करने की अनुमति. Participati बढ़ाने के लिए 24 घंटे के बाद मक्खियों गणनापर अधिक से अधिक 80% करने के लिए और अधिकतम घ्राण मूल्य सूचकांक (Simonnet, व्यक्तिगत संचार) प्रदान करते हैं.
- - / भरी हुई मक्खियों की कुल संख्या (विलायक ट्यूब में नंबर गंध ट्यूब में संख्या): निम्न सूत्र का उपयोग परिणामस्वरूप घ्राण सूचकांक की गणना.
- धो वाई भूलभुलैया सेट अप इस प्रकार है: रातोंरात आरबीएस 35 एमडी में ध्वस्त सेट अप लेना. अच्छी तरह से नल के पानी के साथ बाहर कुल्ला. अंत में विआयनीकृत पानी से कुल्ला और बाहर सूखी हैं.
डाटा के 3. सांख्यिकीय विश्लेषण
- डेटा और चर के आधार पर एक टी परीक्षण, एक तरह से एनोवा या एक दो तरह एनोवा प्रदर्शन करना.
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Representative Results
चित्रा -1 यह वाई भूलभुलैया परख का उपयोग दो प्रतिनिधि प्रतिक्रियाओं से पता चलता है. वे काफी 10% phenylacetic एसिड से बचने नहीं है, जबकि गुआंगज़ौ-S पुरुषों दृढ़ता, आसुत जल में पतला 10% एसिटिक एसिड से बचें. ये assays लोड हो रहा है शीशियों में एक साथ रखा दोहराने के प्रति 10 पुरुषों पर आधारित हैं. इस प्रोटोकॉल कभी कभी मतलब के बड़े मानक त्रुटि हो सकती है. यदि आवश्यक हो, यह बजाय केवल 10. गणितीय, एक व्यक्ति की पसंद एक बड़ा नमूना आकार के सूचकांक मूल्य पर एक कम वजन के replicates प्रति 20 पुरुषों का उपयोग कर इस दोष को कम करने के लिए संभव है.
चित्रा 1. एक वाई भूलभुलैया सेट अप के साथ मूल्यांकन नर घ्राण प्रतिक्रिया. ए) स्प्लिट डिवाइस. बी) इकट्ठेएसिटिक एसिड (एए) या phenylacetic एसिड (PAA) की ओर पुरुष घ्राण प्रतिक्रियाओं की दूर की लाल बत्ती के तहत काम कर हालत में डिवाइस. सी) सेट अप. डी) मात्रा (आसुत पानी में पतला दोनों 10% v / v) (एन = 11) 110 मक्खियों की कुल का प्रतिनिधित्व. सांख्यिकीय विश्लेषण 0 करने के लिए डेटा की तुलना एक टी परीक्षण का उपयोग किया गया था. 0 कोई पसंद का मतलब है. नकारात्मक मान odorant के लिए एक घृणा, और एक सकारात्मक मूल्य एक आकर्षण इंगित करता है. ****: पी <0.0001; एनएस. गैर महत्वपूर्ण (पी = 0.1680) इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
हमारी वाई भूलभुलैया प्रोटोकॉल एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 9 पर आधारित है. हालांकि, हम दो प्रमुख मतभेद परिचय. सबसे पहले, हम वे विलायक या विलायक प्लस odorant युक्त शीशी में प्रवेश करने का फैसला एक बार लौटने से मक्खियों को रोकने के लिए संकीर्ण पिपेट सुझावों का उपयोग करें. इन संकीर्ण सुझावों को भी वाई भूलभुलैया में odorant प्रसार को सीमित करने के लिए उपयोगी होते हैं. दूसरा, हम वाई भूलभुलैया में प्रवेश करने के लिए मक्खियों के लिए मजबूर करने के लिए एक छोटे लोडिंग शीशी का उपयोग करें. यह इन मक्खियों की एक उच्च भागीदारी के लिए महत्वपूर्ण है (24 घंटे के बाद 100% से 80%; Simonnet, व्यक्तिगत संचार).
इस वाई भूलभुलैया परख ड्रोसोफिला में chemosensory प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक कुशल परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है. (आदि वायु प्रवाह से, लदान चरण के दौरान मक्खियों की जोड़ - तोड़,) मक्खियों पर तनाव सहित परीक्षण के संदर्भ संभवतः उनके घ्राण प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर रहा है. ये पर्यावरण के मुद्दों महत्वपूर्ण हैं और कम से कम आंशिक रूप से, क्यों अलग, समझा सकता हैपढ़ाई अलग व्यवहार परिणामों हो सकता था. उदाहरण के लिए एसिटिक एसिड यह दूसरों के 12 में आकर्षक है, जबकि कुछ शर्तों 4,11 में प्रतिकारक होना दिखाया गया है. इसलिए यह जितना संभव हो इन मानकों के सभी नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है.
इस वाई भूलभुलैया परख से एक संभव सीमा वे एक बंद डिजाइन में आयोजित कर रहे हैं के बाद से मक्खियों के लिए अपने कृत्रिम संदर्भ है. इसके अतिरिक्त, मक्खियों उनके लिए तनावपूर्ण हो सकता है, जो संकीर्ण मार्ग में प्रवेश किया है. प्रयोगकर्ता डेटा की व्याख्या जब यह याद करना पड़ता है.
इन संभव सीमाओं बाईपास के लिए, अन्य पूरक घ्राण परीक्षण व्यवहार पर odorants के प्रभाव की पुष्टि के लिए किया जा सकता है. इन परीक्षणों टी mazes के 4, 4 क्षेत्र अखाड़ा assays 7, या हवा सुरंगों 8 शामिल हैं. हालांकि, इन परीक्षणों भी कम या ज्यादा तनावपूर्ण हो सकता है, जो मक्खियों के लिए कृत्रिम वातावरण का उपयोग. उदाहरण के लिए, टी भूलभुलैया परीक्षण के दौरान मक्खियों हाय कर रहे हैंवे लदान चरण 4 के दौरान हिल रहे हैं क्योंकि ghly पर बल दिया. बहरहाल, इस y भूलभुलैया परख की तुलना में एक टी भूलभुलैया का एक फायदा मक्खियों (odorant करने या विलायक करने के लिए) जाने के लिए जहां मिनटों भीतर चुनने के लिए किया है. इसलिए Y-भूलभुलैया प्रतिक्रिया एक टी भूलभुलैया से प्राप्त परिणाम एक अत्यधिक तनावपूर्ण स्थिति में पलटा चुनाव का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि "चिंतनशील" चुनाव प्रतिनिधित्व करता है.
अंत में यह वाई भूलभुलैया परख के संभावित सुधार सभी के साथ ग्लास ट्यूब का उपयोग किया जाएगा बजाय कुछ घटकों (लोडिंग ट्यूब, कनेक्टर, विंदुक युक्तियाँ) के लिए प्लास्टिक की स्थापना की. वे पेट्रोल से बना रहे हैं, क्योंकि ये प्लास्टिक भागों, सिद्धांत रूप में, एक गंध हो सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम पांडुलिपि में सुधार करने के लिए अपने काम के लिए 4 अनाम समीक्षक धन्यवाद. हम MBG और YG करने के लिए अपने वित्तीय समर्थन के लिए केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique धन्यवाद, और एमएमएस के लिए विश्वविद्यालयों-de Bourgogne और अनुसंधान के फ्रेंच मंत्रालय. YG प्रयोगशाला में अनुसंधान के लिए यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी अनुदान, GliSFCo-311403 शुरू), एजेंस Nationale डे ला Recherche (ANR-JCJC, GGCB -2010), Conseil क्षेत्रीय de Bourgogne (फैबर), और CNRS द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
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- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
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- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
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