Summary
Мы представляем тест выбор, чтобы выявить влияние пахучих веществ на Drosophila поведения с помощью Y-лабиринт анализа.
Abstract
Обнаружение сигналов из окружающей среды имеет важное значение для животных, чтобы обеспечить их выживание. С этой целью они используют экологические сигналы, такие как видение, mechanoreception, слуха и chemoperception через вкус, через прямой контакт или через обоняния, который представляет ответ на летучих молекулы действующего на большей дальности. Летучие химические молекулы очень важные сигналы для большинства животных в обнаружении опасности, источник питания, или для обмена данными между физическими лицами. Дрозофилы является одним из наиболее распространенных биологических моделей для ученых, чтобы исследовать клеточные и молекулярные основы обоняния. Чтобы подчеркнуть обонятельные способности этого маленького насекомого, мы описываем модифицированный выбор протокол, основанный на тесте на Y-лабиринт классически используется с мышами. Данные, полученные с Y-лабиринты дать ценную информацию, чтобы лучше понять, как животные иметь дело с их постоянно меняющихся условиях. Введем протокол шаг за шагом изучатьВоздействие пахучих веществ на лету разведочного ответ, используя эту Y-лабиринт анализа.
Introduction
Хеморецепция через вкуса или обоняния является ключевым сенсорные модальности для выживания животных. Это дает жизненные сигналы, необходимые для обнаружения опасности или источников питания, а также для социальных взаимодействий. Он также помогает животным, чтобы найти партнера необходимую секс для их воспроизводства. На протяжении более 20 лет, интенсивные исследования, в том числе лауреат Нобелевской премии работы Ричард Аксель и Линда Бак в 2004 году "за открытия, одоранта рецепторов и организации обонятельной системы", была проведена выявить молекулярные и клеточные основы обоняние 1,2.
Один из любимых животных моделях для ученых рассекать обонятельный восприятие является Д. MELANOGASTER. Это насекомое похожая клеточной и молекулярной запах кодирования стратегию с млекопитающих. Научное сообщество использует различные поведенческие парадигмы, чтобы изучить роль отдушек в этой плодовой мухи. Эти тесты включают мультимодальные анализы, такие как courtshiр Тесты, где различные сенсорные модальности, в том числе обоняния, которые важны для выявления мужского ухаживания 3. Другие анализы также были разработаны для решения роль одорантов более конкретно; к ним относятся Т-лабиринты, Y-лабиринты, ловушки анализы, четыре полевых арен и аэродинамических трубах 4,5,6,7,8.
В этой статье мы приведем простой модифицированный Y-лабиринт анализа, которая обеспечивает надежные обонятельные ответы с помощью D. MELANOGASTER. Наш набор использует конечных советы в отличие от ранее описанного метода 9. Таким образом, наше Y-лабиринт имеет два преимущества. Во-первых, он позволяет избежать возвращения в системе после того, как муха сделала свой выбор. Во-вторых, это ограничивает обмен пахучих веществ во всех областях Y-образном лабиринте. Этот последний преимуществом является важным, поскольку Drosophila очень чувствительны к воздушным потоком, которая часто используется, чтобы избежать одоранта насыщенность. Для регулировки экспериментальной установки с воздушным потоком будет время и стоимость трудоемким. Таким образом, наша Y-лабиринт анализ представляет собой эффициента и быстрый способ проверить обонятельный производительность дрозофилы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Перед началом
- Используйте isogenized опорный запас подшипник в стабильных и надежных поведенческих фенотипов. Там не существует общего правила для выбора этого запаса, поскольку все потенциальные управления может нести неоднородного фона аллели.
- Используйте этот штамм управления для обратного скрещивания все остальные акции, необходимые для более поздних стадий. Этот шаг возвратное скрещивание обычно представляется, по крайней мере 5 последовательных скрещиваний одной девственной самки (чтобы можно кроссинговер между гомологичными хромосомами) до 2-3 изогенных справочных мужчин 5. Этот шаг важен для гомогенизации генетический фон между различными акциями лету.
- Поддержание Drosophila запасов на стандартную кукурузной муки (9%), дрожжи (10%), а также агаровой среде (1,5%), дополненной антибиотиками (0,4% метил пара-гидрокси-бензоат) в 12-час цикле свет / темнота в 25 ° C.
- Достижение хемосенсорных экспериментов в контролируемой температурой комнаты (25 ° C) под дальнего красного света(Для устранения вклад визуальные подсказки, и сосредоточиться на хемосенсорных сигналов). Регулярно обновить воздух в помещении, чтобы проветрить помещение между каждого эксперимента.
2. Обонятельная отклика с помощью Y-лабиринт Пробирной
- Голодать в течение 16-18 мух ч при 25 ° С в стеклянных трубках, содержащих влажное бумажное полотенце перед испытанием.
- Присоединяйтесь разъем Y-образный для двух стеклянных флаконах и в меньшей пластической флакона (загрузка флаконе). Используйте 1 мл пипетки советы, которые проходят через пены пробками связать разъем с тремя флаконах, и получить плотно закрытой Y-лабиринт. Обрежьте узкие концы двух наконечников пипеток (~ диаметр 2 мм, чтобы избежать любого возвращение лету, когда он сделал свое решение) с образованием двух "ловушки" флаконов, и большой конец одного наконечника пипетки, чтобы сформировать "загрузка" Трубка (фиг. 1A).
- Просто перед подключением «ловушка» ампул (Рисунок 1б), поместите одну ~ 6 мм Диаметр фильтровальную бумагу вкаждый флакон. Добавить 40 мкл одоранта решения на одном фильтровальной бумаги, и 40 мкл соответствующий растворитель на втором фильтровальную бумагу.
- Представьте десяти от 4 до 9 однодневных мух в "загрузки" флаконе. Не используйте CO 2 анестезии во время этого переноса, так как он оказывает сильное влияние на поведение 10. Скорее использовать краткое охлаждении на льду. Правильное манипулирование анестезированных мух важно ограничить нагрузку на субъектов, насколько это возможно.
- Выполните серию Y-лабиринт испытаний при 25 ° С под дальним красным светом (с использованием светодиодных ламп, чтобы ограничить возможный источник отопления), чтобы избежать визуальных стимулов как можно больше. Будьте осторожны, чтобы чередовать ориентацию на Y-лабиринты (одоранта, содержащий труб слева, или справа, и загрузочной трубы в передней или в задней части; Рисунок 1C).
- Разрешить несколько часов для мух, чтобы войти в ловушки флакон, содержащий одоранта или растворитель. Всего мух после 24 часов, чтобы увеличить participatiна до более чем 80% и обеспечить максимальную обонятельный значение индекса (Симонне, личное сообщение).
- Рассчитайте результате обонятельный индекс по следующей формуле: (количество в запаха трубки - число в трубке растворителя) / общее количество загруженных мух.
- Вымойте Y-лабиринт настройки следующим образом: смочите демонтированы настройку в RBS 35 MD ночь. Тщательно промыть проточной водой. Наконец промыть деионизированной водой и дайте высохнуть.
3. Статистический анализ данных
- Выполните т-тест, односторонний ANOVA или двусторонний ANOVA в зависимости от данных и переменных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1D показывает два представительства ответы с помощью этой Y-лабиринт анализа. Canton-S самцы сильно избежать 10% уксусной кислоты, разбавленного дистиллированной водой, в то время как они существенно не избежать 10% фенилуксусной кислоты. Эти анализы основаны на 10 мужчинах в репликации, помещенных вместе в загрузочном флаконах. Этот протокол может иногда привести к большой стандартной ошибки среднего. Если необходимо, то можно уменьшить этот недостаток при помощи 20 мужчин на повторах вместо всего 10. Математически выбор одного индивидуума имеет меньший вес по значению индекса для большего размера образца.
Рисунок 1. Мужской обонятельная ответ оценивается с Y-лабиринт настройки.) Сплит устройство. Б) в сбореУстройство. C) Настройка в рабочем состоянии в соответствии с дальним красным светом. D) Количественная оценка мужчин обонятельных ответов по отношению к уксусной кислоты (AA) или фенилуксусной кислоты (ПАК) и разбавляют дистиллированной водой (10% об / об) (N = 11, представляющий в общей сложности 110 мухи). Статистический анализ проводили с использованием критерия Стьюдента сравнения данных в 0. 0 означает отсутствие предпочтения. Отрицательное значение указывает отвращение к одоранта и положительное значение притяжения. ****: Р <0,0001; нс:. без значимой (р = 0,1680) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наш протокол Y-лабиринт основан на описанной выше протоколом 9. Тем не менее, мы вводим два основных отличия. Во-первых, мы используем узкие наконечники для предотвращения мух от возвращения, как только они решили вступить в пробирку, содержащую растворитель или растворитель плюс одоранта. Эти узкие советы также полезны для ограничения одоранта диффузии в Y-образном лабиринте. Во-вторых, мы используем меньший загрузки флакон, чтобы заставить мух, чтобы войти в Y-образном лабиринте. Важно иметь высокую участие этих мух (80% до 100% через 24 ч; Симонне, персональное сообщение).
Это Y-лабиринт анализ является эффективным тест для оценки хемосенсорных ответов у дрозофилы. Контекст теста, в том числе нагрузки на мух (от воздушного потока, манипуляции мух в течение шаге нагружения и т.д.) потенциально влиять на их обонятельные ответы. Эти экологические проблемы имеют решающее значение и может объяснить, по крайней мере частично, почему разныеисследования могут иметь разные поведенческие исходы. Например уксусной кислоты, как показывают, отталкивающим в некоторых условиях 4,11, в то время как она привлекательна в других 12. Поэтому очень важно контролировать все эти параметры, насколько это возможно.
Одним из возможных ограничение этого Y-лабиринт анализа является его искусственная контекст для мух так как они проводятся в закрытом дизайна. Кроме того, мухи должны ввести в узкие проходы, которые могут быть стресс для них. Экспериментатор должен помнить об этом при интерпретации данных.
Чтобы обойти эти возможные ограничения, другие дополнительные обонятельные испытания могут быть выполнены, чтобы подтвердить влияние пахучих веществ на поведение. Эти тесты включают Т-лабиринты 4, 4 поля арене анализов 7 или аэродинамические трубы 8. Тем не менее, эти тесты также использовать искусственные среды для мух, которые могут быть более или менее напряженным. Например, во время T-лабиринт испытаний мухи Приветльное подчеркнул, так как они раскачиваются во время загрузки шаге 4. Однако преимущество Т-образном лабиринте по сравнению с этим Y-лабиринт анализа является то, что мухи должны выбрать в течение нескольких минут, куда идти (в одоранта или к растворителю). Поэтому ответ Y-лабиринт представляет собой "отражающий" выбор, в то время как результаты, полученные с Т-лабиринт представляет собой рефлекторную выбор в очень стрессовом состоянии.
Наконец возможное улучшение этого Y-лабиринт анализа будет использовать стеклянные трубки все время создана вместо пластика для некоторых компонентов (загрузочной трубы, разъемы, наконечники для пипеток). Эти пластиковые детали могут, теоретически, имеют запах, так как они сделаны из бензина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим 4 анонимных рецензентов за их работу, чтобы улучшить рукопись. Мы благодарим Национальный центр Научных Исследований за финансовую поддержку в МБГ и Ю.Г. и Университет Бургундии и французское министерство исследований в MMS. Исследования в лаборатории Ю. Г. финансируется Европейского исследовательского совета (ERC Начиная Грант, GliSFCo-311403), Национальное агентство по де-ла-Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), в Conseil Régional Бургундии (Faber), и CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
