Summary
私たちは、Y字型迷路アッセイを用いてショウジョウバエの行動上の匂い物質の影響を明らかにするために選択試験を提示する。
Abstract
環境からのシグナルを検出することは、それらの生存を確保するための動物のために必須である。この目的のために、彼らは直接接触を介して、またはより長い範囲で作用する揮発性分子に対する応答を表し嗅覚を通じて、このようなビジョン、機械刺激受容、聴覚、味覚を通じてchemoperception、環境手がかりを使用しています。揮発性の化学分子が危険、食料の供給源、または個人の間で通信するための検出にほとんどの動物のために非常に重要なシグナルである。 キイロショウジョウバエの嗅覚の細胞および分子基盤を探る科学者のための最も一般的な生物学的なモデルの一つです。この小さな昆虫の嗅覚能力を強調するために、我々は古典的にマウスで使用Y字迷路試験に基づいて修正された選択肢のプロトコルを記述します。 Y字型迷路を用いて得られたデータは、より良い動物が彼らの絶え間なく変化する環境に対処する方法を理解するための貴重な情報を提供します。私たちは、勉強するステップバイステップのプロトコルを導入このY字迷路アッセイを使用してその場探索応答に匂い物質の影響。
Introduction
味や嗅覚を通して化学受容は動物の生存のための重要な感覚モダリティである。これは、危険や食料源を検出するためだけでなく、社会的相互作用のために必要不可欠な手がかりを提供します。また、その再生に必要なのセックスパートナーを見つけるために、動物に役立ちます。 20年以上にわたり、「嗅覚受容体と嗅覚系の組織の彼らの発見のための「2004年のリチャード·アクセルとリンダ·バックして、作業を受賞ノーベル賞を含む集中的な研究では、分子および細胞の基盤を明らかにするために行われている嗅覚1,2。
嗅覚を分析する科学者のための好みの動物モデルの一つは、Dであるキイロ 。この昆虫は、哺乳類で同様の細胞および分子匂いコーディング戦略を共有しています。科学界は、このショウジョウバエにおける匂い物質の役割を研究するために、多様な行動パラダイムを使用しています。これらのテストは、courtshiなどのマルチモーダルアッセイが含まれる嗅覚を含む様々な感覚モダリティは、男性の求愛3を引き出すために重要であるPをテストします。他のアッセイはまた、より具体的には臭気物質の役割に取り組むために開発されてきた;これらは、T-迷路、Y字迷路、トラップアッセイ、4フィールドアリーナと風のトンネルの4,5,6,7,8が含まれています。
この記事では、Dを使用して堅牢な嗅覚応答を提供する単純な修正Y字迷路アッセイを提示キイロ 。私たちのセットアップは、前述した方法9とは逆に、エンドチップを使用しています。したがって、我々のY字型迷路は2つの利点がある。ハエが彼女の選択をした後は第一に、それは、システム内の任意のリターンを避けることができます。第二に、Y字迷路のすべての分野で匂い物質の交換に制限されます。 ショウジョウバエは 、多くの場合、付臭飽和を回避するために使用される空気流に非常に敏感であるので、この最後の利点は重要である。空気流と実験設定を調整するには時間とコストを消費するであろう。そのため、私たちのY字迷路アッセイは、EFを表しficientやショウジョウバエの嗅覚の性能をテストするための高速な方法。
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Protocol
1。始める前に
- 安定した強固な行動の表現型を持つisogenized参照ストックを使用してください。すべての潜在的なコントロールは、異種背景対立遺伝子を運ぶことができるので、この株を選択するための一般的な規則はありません。
- 後の工程のために必要な他のすべての株式を戻し交配するために、この対照株を使用してください。この戻し交配工程は、通常、2〜3同質遺伝子リファレンス男性5に（相同染色体間の可能な交差を可能にするために）単一の処女の女性の少なくとも5連続した×印で表されます。この手順は異なるフライ銘柄間の遺伝的背景を均一化することが重要です。
- 25℃で12時間の明/暗サイクルで、標準的なコーンフラワー（9％）、酵母（10％）、および寒天培地（1.5％）、抗生物質（0.4％メチルパラヒドロキシベンゾエート）で補完上ショウジョウバエストックを維持する℃、
- 遠赤色光の下で恒温室（25℃）での化学感覚の実験を実現（視覚的な手がかりの寄与を排除するため、および化学感覚信号に集中する）。定期的に各実験の間に十分な換気をお部屋の空気を更新。
Y字迷路アッセイを使用して2。嗅覚応答
- 試験前に湿ったペーパータオルを含むガラス管中で25℃で16〜18時間のためにハエを飢え。
- 2ガラスバイアルに小さいプラスチックバイアル（積載バイアル）にY字コネクターに参加。 3バイアルにコネクタをリンクするために、しっかりと密封されたY字型迷路を取得するために、発泡栓を通過する1ミリリットルピペットチップを使用してください。 「読み込み」を形成するために、二つの "罠"のバイアルを形成するために、（それがその決定をした後にその場のいずれかのリターンを避けるために〜2ミリメートルの直径）2ピペットチップの狭い端をカットし、1ピペットチップの大端チューブ（ 図1A）。
- 単に「トラップ」バイアル（ 図1B）を接続する前に、1個〜直径6mmの濾紙を置き各バイアル。 1濾紙上の着臭剤溶液40μlを追加し、第二の濾紙上の対応する溶媒を40μl。
- 「ローディング」バイアルに10 4から9日齢のハエをご紹介します。それは行動10に強い影響を持つため、この転送中のCO 2の麻酔を使用しないでください。むしろ氷の上に簡単な冷却を使用しています。麻酔ハエの適切な操作は、可能な限り多くの対象者へのストレスを制限することが重要である。
- 視覚刺激を極力回避すること（可能な加熱源を制限するためにLED電球を使用）遠赤色光下で25°CでY字型迷路一連のテストを実行する。 （; 図1C左の、または右の匂い物質の入ったチューブおよびロードチューブフロントや背面に）Y字迷路の向きを交互にするように注意してください。
- ハエのための数時間は、付臭剤や溶剤を含むトラップバイアル中に入力することができます。 participatiを高めるために24時間後にハエを数える最大80％以上にし、最大嗅覚インデックス値（シモネ、私信）を提供する。
- - /ロードされたハエの総数（溶媒チューブ内の数字臭気管内の数値）：次の式を使用して結果の嗅覚指標を算出。
- 洗浄Y字迷路は、セットアップを次のように一晩RBS 35 MDに解体セットアップを浸す。徹底的に水道水ですすぎます。最終的に脱イオン水で洗浄し、完全に乾くましょう。
3。データの統計分析を
- データおよび変数に依存してt検定、一元配置ANOVA又は双方向ANOVAを実行する。
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Representative Results
図1Dは、このY字型迷路アッセイを用いて二つの代表的応答を示す。カントン-Sは、それらが有意に10％フェニル酢酸を回避しないのに対して強く、蒸留水で希釈した10％酢酸を避ける男性が。これらのアッセイは、ローディングバイアルに一緒に入れレプリケートごとに10人の男性に基づいている。このプロトコルは、時々、平均値の大きな標準誤差につながることができます。必要に応じて、それだけではなく、10のレプリケートごとに20人の男性を使用することによってこの欠点を軽減することができる。数学的には、一個体の選択は、より大きなサンプルサイズの指標値に低い重量を有する。
図1。Y字迷路のセットアップで評価男性嗅覚応答。A）分割機構。B）組み立て酢酸（AA）またはフェニル酢酸（PAA）に向けて男性の嗅覚応答の遠赤色光の下で労働条件のデバイス。C）設定1。D）の定量化（蒸留水で希釈された両方の10％V / V）（N = 11、）110ハエの合計を表す。統計分析は0にデータを比較するt検定を用いて行った。0は優先順位を意味する。負の値は、匂い物質への嫌悪、および正の値の魅力を示している。 ****：P <0.0001; NS：有意でない（P = 0.1680） 、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
当社のY字迷路プロトコルは、先に説明したプロトコル9に基づいています。しかし、我々は2つの大きな違いをご紹介します。まず、我々は、彼らが溶媒または溶媒を加えた匂い物質を含むバイアル中に入ることを決定したら、戻ってからハエを防ぐために、狭いピペットチップを使用しています。これらの狭い先端には、Y字型迷路における匂い物質の拡散を制限するために有用である。第二に、我々は、Y字型迷路の中で入力するようにハエを強制的に小さく積載バイアルを使用しています。それは、これらのハエの高い参加することが重要である（24時間後に80％〜100％を、シモネ、私信）。
このY字迷路アッセイは、 ショウジョウバエの化学感覚応答を評価するための効率的なテストを表します。 （空気の流れから、などの負荷ステップ、中にハエの操作）ハエのストレスなど、テストのコンテキストは、潜在的に彼らの嗅覚応答に影響を与えている。なぜ異なるこれらの環境問題は、少なくとも部分的に、重要であると説明することができ研究は様々な行動の成果を持っている可能性があります。例えば、酢酸は、それが他の人12に魅力的であるのに対し、いくつかの条件4,11内の反発であることが示されている。したがって、可能な限りこれらのパラメータのすべてを制御することが重要である。
彼らはロックされたデザインに保持されているので、このY字迷路アッセイの1つの可能性の制限は、ハエのための人工的なコンテキストです。さらに、ハエは、彼らのためにストレスになるかもしれない、狭い通路で入力する必要があります。実験者は、データを解釈する際に、これを覚えておく必要があります。
これらの可能性のある制限をバイパスするには、他の補完的な嗅覚のテストは、行動に匂い物質の影響を確認するために行うことができた。これらのテストは、T-迷路4、4フィールドアリーナアッセイ7、または風洞8が含まれています。しかし、これらのテストはまた、多かれ少なかれストレスになる可能性がある、ハエのための人工的な環境を利用している。例えば、T-迷路試験中にハエがハイテクであるこれらは負荷工程4の間、振とうしているためghly強調した。しかし、このY字迷路アッセイに比べて、T-迷路の利点は、ハエが（匂い物質や溶剤に）どこへ行く分以内に選択しなければならないということです。そのため、Y迷路応答は、T-迷路で得られた成果は非常に過酷な状態で反射的な選択を表すのに対し、「反射」の選択肢を表します。
最後に、このY字迷路試験の可能な改善はすべていくつかのコンポーネント（積載チューブ、コネクタ、ピペットチップ）用に設定の代わりに、プラスチックに沿ってガラス管を使用することです。それらは石油から作られているので、これらのプラスチック部品は、理論的には、臭いを有することができる。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、原稿を改善するために自分の仕事のために4の匿名査読に感謝します。我々は、MMSにMBGとYG、および大学·ド·ブルゴーニュ·研究のフランスの省への財政支援のためのセンター国立デラルシェルシュ科学研究に感謝します。 YGの実験室での研究は、欧州研究会議（ERCの開始グラント、GliSFCo-311403）、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR-JCJC、GGCB-2010）、Conseilの地域·ド·ブルゴーニュ（フェーバー）、およびCNRSによって資金を供給される。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
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