Summary
Se presenta una prueba de elección para revelar la influencia de sustancias odoríferas en el comportamiento de Drosophila utilizando un ensayo del laberinto.
Abstract
La detección de las señales del medio ambiente es esencial para los animales para asegurar su supervivencia. Para ello, utilizan señales ambientales tales como la visión, mecanorrecepción, el oído y chemoperception a través del gusto, por contacto directo oa través del olfato, el cual representa la respuesta a una molécula volátil que actúa en un mayor alcance. Moléculas químicas volátiles son señales muy importantes para la mayoría de los animales en la detección de peligro, una fuente de alimento, o para la comunicación entre individuos. Drosophila melanogaster es uno de los modelos biológicos más comunes para los científicos a explorar la base celular y molecular del olfato. Con el fin de resaltar las habilidades olfativas de este pequeño insecto, se describe un protocolo elección modificado basada en la prueba del laberinto en clásicamente utilizado con ratones. Los datos obtenidos con Y-laberintos dan información valiosa para comprender mejor cómo tratan los animales con su entorno permanentemente cambiante. Introducimos un protocolo paso a paso para estudiar laimpacto de los olores en mosca respuesta exploratorio utilizando este ensayo del laberinto.
Introduction
Quimiorrecepción a través del gusto o el olfato es una modalidad sensorial clave para la supervivencia de los animales. Se da señales vitales necesarias para la detección de un peligro o de las fuentes de alimentos, así como para las interacciones sociales. También ayuda a los animales a encontrar un socio necesario el sexo para su reproducción. Durante más de 20 años, la investigación intensiva, incluyendo el premio Nobel de obra de Richard Axel y Linda Buck en 2004 "por sus descubrimientos de los receptores odorantes y la organización del sistema olfativo", se ha llevado a cabo para revelar las bases moleculares y celulares de la olfacción 1,2.
Uno de los modelos animales preferidos por los científicos para diseccionar la percepción olfativa es D. melanogaster. Este insecto comparte una estrategia de codificación de olor celular y molecular similar con mamíferos. La comunidad científica utiliza diversos paradigmas de comportamiento para estudiar el papel de los odorantes en esta mosca de la fruta. Estas pruebas incluyen ensayos multimodales como courtshipruebas p donde diversas modalidades sensoriales, incluyendo el olfato, son importantes para obtener el cortejo masculino 3. Otros ensayos también se han desarrollado para abordar el papel de los odorantes más específicamente; estos incluyen T-laberintos, Y-laberintos, ensayos de trampa, arenas de cuatro de campo y 4.5.6.7.8 viento túneles.
En este artículo se presenta un ensayo del laberinto sencillo modificado, que proporciona respuestas olfativas robustas usando D. melanogaster. Nuestra puesta a punto utiliza-tips finales en contra de un método descrito anteriormente 9. Por lo tanto, nuestra laberinto Y tiene dos ventajas. En primer lugar, evita las subidas en el sistema una vez que la marcha ha hecho su elección. En segundo lugar, limita el intercambio de olores en todas las áreas de el laberinto. Esta última ventaja es importante, ya que de Drosophila son muy sensibles al flujo de aire que se utiliza a menudo para evitar la saturación odorante. Para ajustar el montaje experimental con un flujo de aire sería consume tiempo y costo. Por lo tanto, nuestro ensayo del laberinto representa un efciente y rápida para poner a prueba el rendimiento olfativo de Drosophila.
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Protocol
1. Antes de empezar
- Utilizar una referencia de valores isogenized teniendo fenotipos conductuales estables y robustas. No existe una regla general para la elección de esta población, ya que todos los controles posibles pueden llevar heterogéneos alelos de fondo.
- Utilice esta cepa de control para retrocruzar cada dos valores necesarios para los pasos posteriores. Este paso retrocruzamiento se representa típicamente por lo menos 5 cruces sucesivos de una sola hembra virgen (para permitir que sea posible entrecruzamiento entre cromosomas homólogos) a 2-3 machos de referencia isogénicas 5. Este paso es importante para homogeneizar el fondo genético entre las diferentes poblaciones de la mosca.
- Mantener las poblaciones de Drosophila en una harina de maíz estándar (9%), levadura (10%), y el medio de agar (1,5%) complementado con antibióticos (0,4% de metil para-hidroxi-benzoato) en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas a 25 ° C.
- Lograr experimentos quimiosensoriales en una habitación con temperatura controlada (25 º C) con luz roja lejana(Para eliminar la contribución de las señales visuales, y centrarse en las señales quimiosensoriales). Regularmente renovar el aire de la habitación a ventilar el área entre cada experimento.
2. Respuesta olfativa mediante un ensayo del laberinto
- Morir de hambre a las moscas de 16-18 horas a 25 ° C en tubos de vidrio que contienen una toalla de papel húmeda antes de la prueba.
- Únase a un conector en forma de Y a dos viales de vidrio y un vial de plástico pequeña (carga vial). Utilice 1 ml puntas de pipeta que pasan a través de los tapones de espuma para unir el conector a los tres viales, y para obtener un laberinto Y cerrado herméticamente. Cortar los extremos estrechos de dos puntas de pipeta (~ 2 mm de diámetro, para evitar cualquier retorno de la marcha una vez que ha tomado su decisión) para formar dos viales "atrapar", y un gran final de una punta de la pipeta para formar la "carga" tubo (Figura 1A).
- Justo antes de la conexión de los viales "atrapar" (fig. 1B), coloque una ~ 6 mm de diámetro en el papel de filtrocada vial. Añadir 40 l de solución de odorante en una de papel de filtro, y 40 l de la correspondiente disolvente en el segundo papel de filtro.
- Introducir diez 4-9 moscas de un día en el vial de "carga". No utilice CO 2 anestesia durante esta transferencia, ya que tiene un fuerte efecto sobre el comportamiento 10. Más bien utilizar breve enfriamiento en hielo. La manipulación adecuada de las moscas anestesiadas es importante limitar el estrés en los temas tanto como sea posible.
- Lleve a cabo una serie de pruebas del laberinto a 25 ° C bajo luz roja lejana (el uso de bombillas LED para limitar la posible fuente de calor) para evitar los estímulos visuales tanto como sea posible. Tenga cuidado de alternar las orientaciones de los Y-laberintos (tubo odorante que contiene a la izquierda, oa la derecha, y el tubo de carga en el frente o en la espalda; Figura 1C).
- Permita que transcurran varias horas para que las moscas entren en el vial que contiene la trampa odorizante o el disolvente. Cuente moscas después de 24 horas para aumentar la participatien un máximo de más de 80% y proporcionar el valor de índice olfativa máxima (Simonnet, comunicación personal).
- Calcular el índice olfativa resultante usando la siguiente fórmula: (número en el tubo de olor - número en el tubo de disolvente) / número total de moscas cargados.
- Lave laberinto Y puesta a punto de la siguiente manera: remoje la desmantelado configuración en RBS 35 MD durante la noche. Enjuagar bien con agua del grifo. Por último, enjuagar con agua desionizada y dejar que se seque.
3. Análisis Estadístico de los Datos
- Lleve a cabo una prueba t, un ANOVA de una vía o un ANOVA de dos vías en función de los datos y variables.
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Representative Results
Figura 1D muestra dos respuestas representativas utilizando este ensayo del laberinto. Cantón-S machos evitan fuertemente 10% de ácido acético diluido en agua destilada, mientras que no evitan significativamente ácido fenilacético 10%. Estos ensayos se basan en 10 varones por réplica colocados juntos en los viales de carga. Este protocolo a veces puede conducir a grandes errores estándar de la media. Si es necesario, es posible reducir este inconveniente mediante el uso de 20 hombres por repeticiones en lugar de sólo 10. Matemáticamente, la elección de un individuo tiene un peso inferior en el valor de índice para un tamaño de muestra más grande.
Figura 1. Respuesta olfativa Male evaluado con un laberinto Y puesta a punto. A) dispositivo de Split. B) Montadodispositivo. C) Puesta en marcha en condiciones de trabajo bajo la luz roja lejana. D) La cuantificación de las respuestas olfativas masculinas hacia el ácido acético (AA) o ácido fenilacético (PAA), tanto diluido en agua destilada (10% v / v) (N = 11, lo que representa un total de 110 moscas). Se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba t de comparar los datos en 0. 0 significa que no hay preferencia. Un valor negativo indica una aversión al odorante, y un valor positivo una atracción. ****: P <0,0001; ns:. no significativa (p = 0,1680) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nuestro protocolo laberinto Y se basa en un protocolo previamente descrito 9. Sin embargo, se introducen dos grandes diferencias. En primer lugar, utilizamos puntas de pipeta estrechos para evitar que las moscas de regresar una vez que deciden entrar en el vial que contiene el disolvente o el disolvente más el odorante. Estos consejos estrechos también son útiles para limitar la difusión de aroma en el laberinto. En segundo lugar, se utiliza un vial de carga menor a la fuerza a las moscas para entrar en el laberinto. Es importante tener una alta participación de estas moscas (80% a 100% después de 24 h; Simonnet, comunicación personal).
Este ensayo del laberinto representa una prueba eficiente para evaluar las respuestas quimiosensoriales en Drosophila. El contexto de la prueba, incluyendo el estrés en las moscas (de flujo de aire, la manipulación de las moscas durante la etapa de carga, etc) es que pueden influir en sus respuestas olfativas. Estos problemas ambientales son críticas y podrían explicar, al menos parcialmente, por qué diferentesestudios podrían tener diferentes resultados conductuales. Por ejemplo se muestra el ácido acético para ser repulsiva en algunas condiciones 4,11, mientras que es atractivo en otros 12. Por lo tanto es crítico para controlar todos estos parámetros tanto como sea posible.
Una posible limitación de este ensayo del laberinto es su contexto artificial para las moscas, ya que se llevan a cabo en un diseño de bloqueo. Además, las moscas tienen que entrar en pasos estrechos, que puede ser estresante para ellos. El experimentador tiene que recordar esto cuando se interpretan los datos.
Para pasar por alto estas posibles limitaciones, otras pruebas olfativas complementarias podrían realizarse para confirmar el impacto de los olores en el comportamiento. Estas pruebas incluyen T-laberinto 4, 4 ensayos de campo-arena 7 u 8 túneles de viento. Sin embargo, estas pruebas también utilizan entornos artificiales para las moscas, que podría ser más o menos estresante. Por ejemplo, durante las pruebas de T-laberinto moscas son highly estresado, ya que se agitan durante la etapa de carga 4. Sin embargo, una ventaja de un laberinto en T en comparación con este ensayo laberinto Y es que las moscas tienen que elegir dentro de minutos a dónde ir (a la odorante o al disolvente). Por lo tanto la respuesta del laberinto representa una opción "reflexivo", mientras que los resultados obtenidos con un laberinto en T representan una elección refleja en una condición altamente estresante.
Finalmente una posible mejora de este ensayo laberinto Y sería el uso de tubos de vidrio a lo largo de la puesta en marcha en lugar de plástico para algunos componentes (tubo de carga, conector, puntas de pipeta). Estas piezas de plástico pueden, en teoría, tener un olor, ya que están hechas de gasolina.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos 4 evaluadores anónimos por su trabajo para mejorar el manuscrito. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Científica por su apoyo financiero a MBG y YG, y la Université de Bourgogne y el Ministerio francés de Investigación para MMS. La investigación en laboratorio YG es financiado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting Grant, GliSFCo-311403), la Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), el Conseil Régional de Bourgogne (Faber) y el CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
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