Summary
Vi presentiamo un test di scelta per rivelare l'influenza di odoranti sul comportamento Drosophila utilizzando un test Y-labirinto.
Abstract
Rilevare i segnali dall'ambiente è essenziale per gli animali per garantire la loro sopravvivenza. A questo scopo, usano stimoli ambientali come la visione, mechanoreception, l'udito, e chemoperception attraverso il gusto, attraverso il contatto diretto o attraverso l'olfatto, che rappresenta la risposta ad una molecola instabile che agisce a lungo raggio. Molecole chimiche volatili sono segnali molto importanti per la maggior parte degli animali nella rilevazione di pericolo, una fonte di cibo, o per comunicare tra gli individui. Drosophila melanogaster è uno dei modelli biologici più comuni per gli scienziati di esplorare le basi cellulari e molecolari di olfatto. Al fine di evidenziare le capacità olfattive di questo piccolo insetto, descriviamo un protocollo scelta modificato in base al test Y-maze usato classico con i topi. I dati ottenuti con Y-labirinti forniscono informazioni preziose per comprendere meglio come gli animali che fare con il loro ambiente in perenne mutazione. Introduciamo un protocollo passo-passo per studiare laimpatto della odoranti sul fly risposta esplorativo da questo test Y-labirinto.
Introduction
Chemoreception attraverso il gusto e l'olfatto è una modalità sensoriale fondamentale per la sopravvivenza degli animali. Dà segnali vitali necessarie per la rivelazione di un pericolo o fonti di cibo, così come per le interazioni sociali. Essa aiuta anche gli animali di trovare un partner sessuale necessaria per la loro riproduzione. Per più di 20 anni, un'intensa attività di ricerca, comprese Nobel vincitore del premio opera di Richard Axel e Linda Buck nel 2004 "per le loro scoperte di recettori olfattivi e l'organizzazione del sistema olfattivo", è stata effettuata per rivelare le basi molecolari e cellulari della olfatto 1,2.
Uno dei modelli animali preferiti per gli scienziati per analizzare la percezione olfattiva è D. melanogaster. Questo insetto condivide una strategia simile odore di codifica cellulari e molecolari con i mammiferi. La comunità scientifica utilizza diversi paradigmi comportamentali per studiare il ruolo di odoranti in questa mosca della frutta. Questi test includono test multimodali come courtshitest p dove le varie modalità sensoriali, tra cui l'olfatto, sono importanti per suscitare corteggiamento maschile 3. Altri saggi sono stati sviluppati anche per affrontare il ruolo di odoranti più specificamente; questi includono T-labirinti, Y-labirinti, saggi trappola, arene quattro campo e wind-tunnel 4,5,6,7,8.
In questo articolo vi presentiamo un semplice modificata test Y-labirinto, che fornisce risposte olfattive robuste con D. melanogaster. Il nostro set-up usi finali suggerimenti in contrasto con un metodo descritto in precedenza 9. Così, la nostra Y-labirinto ha due vantaggi. In primo luogo, evita qualsiasi ritorno nel sistema una volta la mosca ha fatto la sua scelta. In secondo luogo, essa limita lo scambio di odoranti in tutte le aree del Y-labirinto. Quest'ultimo vantaggio è importante poiché Drosophila sono molto sensibili al flusso d'aria che viene spesso utilizzato per evitare la saturazione odorizzante. Per regolare il set-up sperimentale con un flusso d'aria sarebbe tempo e costo consumo. Pertanto, il nostro test Y-labirinto rappresenta un efciente e veloce per testare le prestazioni olfattiva di Drosophila.
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Protocol
1. Prima di iniziare
- Utilizzare un archivio di riferimento isogenized cuscinetto fenotipi comportamentali stabili e robusti. Non esiste una regola generale per la scelta di questa azione, dal momento che tutti i controlli possibili possono portare sfondo eterogenei alleli.
- Utilizzare questo ceppo di controllo per backcross ogni altra azione necessaria per le fasi successive. Questo passo backcrossing è tipicamente rappresentato da almeno cinque croci successivi di una singola femmina vergine (per permettere possibile crossing-over tra cromosomi omologhi) per 2-3 isogeni maschi di riferimento 5. Questo passo è importante per omogeneizzare il background genetico tra le diverse popolazioni della mosca.
- Mantenere scorte Drosophila su una farina di mais normale (9%), lievito (10%), e agar (1,5%) integrato con antibiotico (0,4% di metile para-idrossi-benzoato) in un ciclo luce / buio di 12 ore a 25 ° C.
- Raggiungere esperimenti chemiosensoriali in una stanza a temperatura controllata (25 ° C) sotto la luce rosso lontano(Per eliminare il contributo dei riferimenti visivi, e di concentrarsi sui segnali chemosensoriali). Rinnovare regolarmente l'aria della camera di ventilare l'area tra ogni esperimento.
2. Risposta olfattiva utilizzando un test Y-maze
- Morire di fame in linea per 16-18 ore a 25 ° C in tubi di vetro contenenti carta asciugamano bagnato prima del test.
- Partecipa a un connettore a forma di Y a due fiale di vetro e una fiala di plastica più piccolo (carico flaconcino). Utilizzare 1 ml punte di pipetta che passano attraverso i tappi di schiuma per collegare il connettore al tre fiale, e avere un Y-labirinto ermeticamente chiusi. Tagliate le estremità strette di due punte per pipette (~ 2 mm di diametro, per evitare qualsiasi ritorno della mosca una volta che ha preso la sua decisione) per formare due fiale "trappola", e un grande fine di un puntale per formare il "loading" tubo (Figura 1A).
- Appena prima di collegare i flaconi "trappola" (Figura 1B), mettere un ~ 6 millimetri carta filtro diametroogni flacone. Aggiungere 40 ml di soluzione di odorizzante su una carta da filtro, e 40 ml di solvente corrispondente sulla seconda carta da filtro.
- Introdurre dieci 4-9 linea di un giorno nel flaconcino "loading". Non utilizzare CO 2 anestesia durante questo trasferimento, poiché ha un forte effetto sul comportamento 10. Piuttosto usare breve raffreddamento sul ghiaccio. Manipolazione corretta di mosche anestetizzati è importante limitare lo stress sugli argomenti più possibile.
- Eseguire una serie di test Y-maze a 25 ° C sotto luce rosso lontano (utilizzando lampadine a LED per limitare possibile fonte di riscaldamento) per evitare stimoli visivi per quanto possibile. Prestare attenzione ad alternare gli orientamenti delle Y-labirinti (odorizzante contenente tubo sulla sinistra o sulla destra, e il tubo di carico nella parte anteriore o sul retro; la figura 1C).
- Consentire diverse ore per le mosche di entrare nel flaconcino trappola contenente l'odorizzante o il solvente. Conte vola dopo 24 ore di aumentare la participativia fino a più di 80% e fornire il valore di indice olfattivo massimo (Simonnet, comunicazione personale).
- Calcolare l'indice olfattivo risultante utilizzando la seguente formula: (numero nel tubo odore - Codice nel tubo solvente) / numero totale di mosche caricati.
- Wash Y-maze set-up come segue: immergere la smontato set-up in RBS 35 MD durante la notte. Sciacquare accuratamente con acqua del rubinetto. Infine sciacquare con acqua deionizzata e lasciare asciugare.
3. Analisi statistica dei dati
- Eseguire un t-test, un one-way ANOVA o una ANOVA a due vie a seconda dei dati e variabili.
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Representative Results
Figura 1D mostra due risposte di rappresentanza di questo test Y-labirinto. Maschi Canton-S evitare fortemente 10% di acido acetico diluito in acqua distillata, mentre non evitano significativamente il 10% di acido fenilacetico. Questi test sono basati su 10 maschi per replica messi insieme nelle fiale di carico. Questo protocollo volte può portare a un notevole errore standard della media. Se necessario, è possibile ridurre questo inconveniente utilizzando 20 maschi per replicati anziché soltanto 10. Matematicamente, la scelta di un individuo ha un peso inferiore al valore dell'indice per un campione più grande.
Figura 1. Maschio risposta olfattiva valutata con Y-labirinto di set-up. A) Dispositivo Spalato. B) Assemblatodispositivo. C) Preparazione in condizione di lavoro sotto luce rosso lontano. D) Quantificazione delle risposte olfattive maschili verso acido acetico (AA) o acido fenilacetico (PAA) sia diluito in acqua distillata (10% v / v) (N = 11, per un totale di 110 mosche). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un t-test confrontando i dati su 0. 0 significa nessuna preferenza. Un valore negativo indica una certa avversione per l'odorizzante, e un valore positivo un'attrazione. ****: P <0.0001; ns:. non significativa (p = 0,1680) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il nostro protocollo Y-labirinto è basato su un protocollo precedentemente descritto 9. Tuttavia, introduciamo due importanti differenze. In primo luogo, usiamo puntali delle pipette strette per evitare che le mosche di tornare una volta che decidono di entrare nel flaconcino contenente il solvente o il solvente più l'odorizzante. Questi suggerimenti strette sono utili anche per limitare la diffusione odorizzante in Y-labirinto. In secondo luogo, usiamo un carico flacone più piccolo per costringere le mosche per entrare nel Y-labirinto. E 'importante avere un alto partecipazione di queste mosche (80% al 100% dopo 24 ore; Simonnet, comunicazione personale).
Questo test Y-maze rappresenta un test efficace per valutare le risposte chemiosensoriali in Drosophila. Il contesto del test, tra cui lo stress sulla linea (dal flusso d'aria, la manipolazione di linea durante la fase di caricamento, ecc) è potenzialmente influenzando loro risposte olfattive. Questi problemi ambientali sono critici e possono spiegare, almeno parzialmente, perché differentestudi potrebbero avere esiti comportamentali diverse. Per esempio l'acido acetico è dimostrato di essere repulsiva in alcune condizioni di 4,11, che è attraente in altri 12. Pertanto è importante controllare tutti questi parametri per quanto possibile.
Una possibile limitazione di questo test Y-labirinto è il suo contesto artificiale per mosche in quanto si svolgono in un design chiuso. Inoltre, mosche devono entrare in passaggi stretti, che potrebbe essere stressante per loro. Lo sperimentatore deve ricordare questo quando si interpretano i dati.
Per bypassare queste possibili limitazioni, altri test olfattivi complementari possono essere effettuate per confermare l'impatto di odoranti sul comportamento. Questi test includono T-labirinti 4, 4 saggi campo-arena 7 o 8 gallerie del vento. Tuttavia, questi test utilizzano anche ambienti artificiali per mosche, che potrebbero essere più o meno stressante. Ad esempio, durante le prove di T-labirinto mosche sono highly sottolineato poiché sono agitati durante la fase di carico 4. Tuttavia, un vantaggio di un T-maze rispetto a questo test Y-maze è che le mosche devono scegliere in pochi minuti dove andare (al odorizzante o al solvente). Pertanto, la risposta Y-labirinto rappresenta una scelta "a freddo", mentre i risultati ottenuti con un T-labirinto rappresentano una scelta riflesso in una condizione altamente stressante.
Finalmente un possibile miglioramento di questo test Y-labirinto sarebbe quella di utilizzare tubi di vetro lungo tutto il set up invece di plastica per alcuni componenti (tubo di carico, connettore, puntali). Le parti in plastica possono, in teoria, hanno un odore perché sono fatti da benzina.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo 4 utenti anonimi per il loro lavoro per migliorare il manoscritto. Ringraziamo il Centre National de la Recherche Scientifique per il suo sostegno finanziario alle MBG e YG, e l'Université de Bourgogne e il Ministero della Ricerca francese MMS. La ricerca in laboratorio YG è finanziato dal Consiglio europeo della ricerca (ERC Starting Grant, GliSFCo-311.403), l'Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), il Conseil Régional de Bourgogne (Faber), e il CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
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