Summary
我们提出了一个选择的测试揭示使用Y型迷宫试验对果蝇行为的气味的影响。
Abstract
从环境探测信号是必不可少的动物，以确保其生存。为了这个目标，他们使用环境线索，如视觉，mechanoreception，听觉和味觉，通过chemoperception，通过直接接触或通过嗅觉，它代表了响应于作用在较长的范围内挥发性分子。挥发性的化学分子是大多数动物非常重要的信号，在危险，食物来源，或个人之间进行通信的检测。 果蝇是最常见的生物模型，科学家探索嗅觉的细胞和分子基础之一。为了突出这种小虫子的嗅觉能力，我们描述的基础上，Y型迷宫测试小鼠用经典修改选择的协议。用Y型迷宫获得的数据提供有价值的信息，以更好地了解动物如何处理他们不断变化着的环境。我们引入了一个一步一步的协议研究增味剂的使用这个Y型迷宫试验探索动态响应的影响。
Introduction
通过味觉或嗅觉化学感受是一个关键的感官方式对动物的生存。它给社会互动所需的危险或食物来源的检测重要线索，以及。它还可以帮助动物找到它们的繁殖需要一个性伴侣。对于超过20年，深入的研究，其中包括诺贝尔文学奖获奖作品由理查德·阿克塞尔和琳达·巴克在2004年“对气味受体和嗅觉系统的组织他们的发现”，已经进行了揭示的分子和细胞基地嗅觉1,2。
其中一个最喜欢的动物模型，科学家解剖嗅觉感知是D。果蝇 。这种昆虫股与哺乳动物类似的细胞和分子的气味编码策略。科学界采用不同的行为范式，研究的气味在这个果蝇的作用。这些测试包括多模态试验，如courtship测试，其中各种感觉方式，包括嗅觉，是重要的诱发雄性求偶3。其它测定法也已经被开发，以更具体的处理的加臭剂的作用;这些包括T型迷宫，Y型迷宫，陷阱检测，四场舞台和风力隧道4,5,6,7,8。
在这篇文章中，我们提出一个简单的改性Y型迷宫试验，其中使用D.提供强大的嗅觉反应果蝇 。我们的设置使用终端提示中违背先前描述的方法9。因此，我们的Y型迷宫有两个好处。首先，它避免了系统中任何的回报，一旦苍蝇作出了她的选择。第二，它限制的气味在Y型迷宫的各个领域的交流。这最后的优点是重要的，因为果蝇是被经常使用，以避免加臭剂的饱和空气流非常敏感。以调整实验装置与空气流动将是时间和成本消耗。因此，我们的Y型迷宫试验表示EFficient和快速的方法来测试果蝇的嗅觉表现。
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Protocol
1。开始之前
- 使用isogenized参考现货供应稳定和强大的行为表型。有选择这个股票，因为所有的潜在控制可以进行异构背景等位基因没有一般的规则。
- 使用这个控制应变必要回交所有其他股票的后续步骤。本回交步骤通常 是由一个单一的处女雌性至少5连续十字表示（以允许可能互换以上同源染色体之间），以2-3等基因参考男性5。这个步骤是重要的，均质的不同蝇种群之间的遗传背景。
- 维持果蝇股上，在25补充有抗生素（0.4％甲基对羟基苯甲酸酯），在12小时光照/黑暗周期的标准玉米粉（9％），酵母（10％），以及琼脂培养基（1.5％） °C。
- 实现在一个恒温室（25℃）下的远红光化学感受实验（消除视觉线索的贡献，并把重点放在化学感应信号）。定期更新的房间进行通风每次实验之间的区域的空气。
采用Y型迷宫测定2。嗅觉反应
- 在包含湿纸巾测试之前玻璃管饿死苍蝇16-18小时，在25°C。
- 加入一个Y形连接器连接到两个玻璃小瓶中，并以一个较小的塑料瓶（装小瓶）。使用通过泡沫塞子传递给连接器链接到三个小瓶中，并得到紧密密封的Y-迷宫1毫升移液器吸头。削减两个移液器吸头的两端窄（〜2个毫米直径，以避免任何回报的苍蝇一旦作出决定），形成两个“陷阱”的小瓶，和一个枪头，一个大底形成的“加载”管（ 图1A）。
- 只要连接了“陷阱”瓶（ 图1B）之前，放置一〜6mm直径的滤纸每个小瓶。加40微升加臭剂溶液在1滤纸，并且将40μl相应的溶剂对第二滤纸。
- 介绍10 4〜9日龄苍蝇进入“加载”的小瓶。这个传输过程中不使用二氧化碳麻醉，因为其对行为10有很强的影响。而使用冰短暂冷却。正确操作麻醉蝇重要的是限制应力尽可能的主题。
- 在25℃下的远红光执行一系列的Y-迷宫测试（使用LED灯泡来限制可能的加热源），以避免视觉刺激尽可能。小心地交替使用Y型迷宫的方向（含气味管在左边，或者右边，并在前面或后面装管; 图1C）。
- 允许几个小时的苍蝇在含有增味剂或溶剂的陷阱小瓶进入。 24小时后计数的苍蝇增加participati上可达80％以上，并提供最大的嗅觉索引值（SIMONNET，个人通讯）。
- - /加载蝇总数（在溶剂管数数的气味管）：使用下列公式计算由此产生的嗅觉指标。
- 洗Y型迷宫设置，如下图：浸泡拆除设置在苏格兰皇家银行35 MD过夜。彻底冲洗用自来水。最后用去离子水冲洗，让干。
该数据3。统计分析
- 进行t检验，单向ANOVA或双向ANOVA取决于数据和变量。
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Representative Results
图1D显示了使用这个Y型迷宫实验两个有代表性的回应。广-S雄性极力避开10％乙酸稀释在蒸馏水中，而它们没有显著避免10％的苯乙酸。这些分析都是基于每个重复10只雄性放在一起装载小瓶。这个协议有时会导致平均值的大的标准偏差。如果需要，可以使用，而不是只有10个。在数学上，一个人的选择对指数值更大的样本量较低的重量每重复20的男性减少这种缺陷。
图1：评估与Y型迷宫设置了男嗅觉反应。A）分割装置B）组装向着乙酸（AA）或苯乙酸（PAA）男性嗅觉反应装置。 三）设置了处于工作状态下的远红光D）既定量稀释于蒸馏水（10％V / V）（N = 11，共计110苍蝇）。采用t检验的数据进行比较，以0进行统计分析。0表示没有偏好。负值表示反感的气味，和正值的吸引力。 ****：P <0.0001; NS：无显著性（P = 0.1680）， 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
我们的Y-迷宫协议是基于一个先前描述的方案9。然而，我们引入两个主要区别。首先，我们使用窄的枪头，以防止苍蝇返回一旦他们决定在含有溶剂或溶剂加臭剂小瓶进入。这些窄的尖端也是有用的，以限制在Y-迷宫的加臭剂的扩散。其次，我们使用一个较小的负载小瓶强制苍蝇在Y-迷宫进入。有这些苍蝇的高参与重要的是（24小时后80％至100％; SIMONNET，个人通讯）。
这个Y型迷宫实验代表一个有效的测试，以评估化学感受反应的果蝇 。测试，包括压力的苍蝇（从空气流动，在加载步骤中的苍蝇的操作等）的情况下是潜在地影响其嗅觉反应。这些环境问题是至关重要的，并可以解释，至少部分地，为什么不同研究可以有不同的行为结果。例如乙酸被证明是排斥力在某些条件4,11，而它是在其他12吸引。因此，关键是要尽可能地控制所有这些参数。
这个Y型迷宫实验中的一个可能的限制是因为它们是在一个锁定的设计举行了人工上下文苍蝇。另外，苍蝇在狭窄的通道进入，这可能是紧张的他们。实验者有解释数据时要记住这一点。
为了绕过这些可能的限制，其他辅助嗅觉测试可以进行确认的气味对行为的影响。这些测试包括T型迷宫4，4场主场检测7，或风洞8。然而，这些试验还利用人工环境苍蝇，它可以是更多或更少的压力。例如，在T型迷宫测试苍蝇喜ghly强调，因为它们是在加载步骤4动摇。然而，一个T型迷宫的相比，这Y-迷宫试验的优点是，苍蝇必须分钟内选择在哪里（对加臭剂或溶剂）。因此，Y型迷宫回应表示“反思”的选择，而搭配T-迷宫获得的成果代表了一种高度紧张的状态反射性的选择。
最后这个Y-迷宫试验的一个可能的改进是使用玻璃试管均沿集而不是塑料的一些组件（装弹管，连接器，移液管尖端）向上。这些塑料部件，在理论上，有异味，因为他们是从汽油制成。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢4匿名审稿人的工作，提高了稿件。我们感谢中心法国国家科学研究因为它有MBG和YG的财政支持，以及大学德勃艮第和法国研究部彩信。研究YG实验室是由欧洲研究委员会（ERC开始格兰特，GliSFCo-311403）中，法新社国立德拉RECHERCHE（ANR-JCJC，GGCB-2010），行政法院地区的勃艮第（麦嘉华）和法国国家科学研究中心资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
