Summary
Vi præsenterer en række test til at afsløre indflydelse lugtstoffer på Drosophila opførsel ved hjælp af en Y-labyrint-assay.
Abstract
Afsløring signaler fra miljøet er afgørende for dyrene for at sikre deres overlevelse. Til dette formål bruger de miljømæssige signaler såsom syn, mechanoreception, hørelse, og chemoperception gennem smag, via direkte kontakt eller via lugtesansen, der repræsenterer svaret på en flygtig molekyle optræder på længere rækkevidde. Flygtige kemiske molekyler er meget vigtige signaler til de fleste dyr i afsløring af fare, en kilde til mad, eller til at kommunikere mellem individer. Drosophila melanogaster er en af de mest almindelige biologiske modeller for forskere til at udforske den cellulære og molekylære grundlag for lugtesansen. For at fremhæve olfaktoriske evner dette lille insekt, beskriver vi en modificeret valg protokol baseret på Y-labyrint-testen klassisk anvendes med mus. Data opnået med Y-labyrinter give værdifulde oplysninger til bedre at forstå, hvordan dyrene beskæftige sig med deres evigt skiftende miljø. Vi introducerer en trin-for-trin-protokollen til at studerevirkningen af lugtstoffer på flue sonderende reaktion ved hjælp af denne Y-labyrint-assay.
Introduction
Chemoreception gennem smag eller lugtesansen er en vigtig sensorisk modalitet for dyr overlevelse. Det giver vigtige signaler, der er nødvendige til påvisning af en fare eller fødevarer kilder, såvel som for sociale interaktioner. Det hjælper også dyr for at finde en sexpartner nødvendig for deres reproduktion. For mere end 20 år, intensiv forskning, herunder Nobelprisen vindende arbejde af Richard Axel og Linda Buck i 2004 "for deres opdagelser af lugtstof-receptorer og organiseringen af det olfaktoriske system", er blevet udført for at afsløre de molekylære og cellulære grundlag for lugtesansen 1,2.
Et af de foretrukne dyremodeller for videnskabsfolk at dissekere olfaktoriske opfattelsen er D. melanogaster. Dette insekt deler en lignende cellulær og molekylær lugt-kodning strategi med pattedyr. Det videnskabelige samfund anvender forskellige adfærdsmæssige paradigmer at undersøge den rolle, lugtstoffer i denne bananfluen. Disse tests omfatter multimodale assays, såsom courtshiP-tests, hvor forskellige sensoriske modaliteter, herunder lugtesansen, er vigtige for at fremkalde mandlige frieri 3. Andre analyser er også blevet udviklet til at tackle rollen som lugtstoffer mere specifikt; disse omfatter T-labyrinter, Y-labyrinter, trap assays, fire-field arenaer og vind-tunneler 4,5,6,7,8.
I denne artikel præsenterer vi en simpel modificerede Y-labyrint assay, som giver robuste olfaktoriske svarene ved D. melanogaster. Vores set-up bruger endelige tip i modsætning til en tidligere beskrevet metode 9. Således er vores Y-labyrint har to fordele. For det første undgår enhver afkast i systemet, når fluen har gjort hendes valg. For det andet begrænser udvekslingen af lugtstoffer i alle områder af Y-labyrint. Denne sidste fordel er vigtig, da Drosophila er meget følsomme over for luftstrøm, der ofte anvendes til at undgå lugtstof mætning. For at justere den eksperimentelle set-up med en luftstrøm vil være tid og omkostningskrævende. Derfor er vores Y-labyrint-assay er en efstrækkeligt og hurtig måde at teste olfaktoriske ydeevne Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Inden start
- Brug en isogenized henvisning materiel med stabile og robuste adfærdsmæssige fænotyper. Der er ingen generel regel for at vælge denne bestand, da alle potentielle kontroller kan foretage heterogene baggrund alleler.
- Brug denne kontrol stamme til backcross hver anden bestand er nødvendigt for senere trin. Dette tilbagekrydsning trin er typisk repræsenteret ved mindst 5 successive krydsninger af en enkelt jomfru kvinde (for at tillade eventuel overkrydsning mellem homologe kromosomer) til 2-3 isogene reference-hanner 5. Dette trin er vigtigt at homogenisere den genetiske baggrund mellem de forskellige flyve bestande.
- Vedligehold Drosophila aktier på en standard majsmel (9%), gær (10%), og agar medium (1,5%) suppleret med antibiotika (0,4% methyl-para-hydroxy-benzoat) i en 12-timers lys / mørke cyklus ved 25 ° C.
- Opnå chemosensory eksperimenter i en temperatur-kontrolleret rum (25 ° C) under langt rødt lys(At fjerne bidrag af visuelle referencer, og at fokusere på chemosensory signaler). Regelmæssigt forny luften i rummet til at ventilere området mellem hvert forsøg.
2.. Olfaktoriske reaktion ved hjælp af en Y-labyrint Assay
- Sulte fluer til 16-18 timer ved 25 ° C i glasrør indeholdende vådt køkkenrulle før testning.
- Deltag i en Y-formet stik til to hætteglas og i mindre plast hætteglas (lastning hætteglas). Brug 1 ml pipette tips, der passerer gennem skum propper til at linke stikket til de tre hætteglas, og for at opnå en tæt forseglet Y-labyrint. Skær de smalle ender af to pipettespidser (~ 2 mm diameter, for at undgå enhver tilbagevenden af fluen, når den har gjort sin beslutning) til at danne to "fælde" hætteglas, og en stor slutningen af en pipette spids for at danne "loading" røret (figur 1A).
- Lige før du tilslutter den "fælde" hætteglas (figur 1b), placeres en ~ 6 mm diameter filter papir ihvert hætteglas. Tilsæt 40 ul af lugtstof opløsning på en filtrerpapir, og 40 pi af det tilsvarende opløsningsmiddel på anden filtrerpapir.
- Indføre ti 4 til 9 daggamle fluer i "loading" hætteglasset. Brug ikke CO 2-anæstesi under denne overførsel, da det har en stærk effekt på adfærd 10.. Snarere bruge korte afkøling på is. Korrekt håndtering af bedøvede fluer er vigtigt at begrænse belastningen på de emner, så meget som muligt.
- Udføre en række Y-maze test ved 25 ° C under langt rødt lys (ved hjælp af LED-pærer for at begrænse mulig varmekilde) for at undgå visuelle stimuli så meget som muligt. Vær omhyggelig med at veksle de orienteringer af Y-labyrinter (lugtstof indeholder rør til venstre eller på højre og lastning rør foran eller i ryggen, figur 1C).
- Tillad flere timer for fluerne at komme ind i fælden hætteglasset med lugtstof eller opløsningsmidlet. Tæl fluer efter 24 timer for at øge participatipå op til mere end 80% og giver maksimal olfaktoriske indeks-værdi (Simonnet, personlig kommunikation).
- Beregn den resulterende olfaktoriske indeks ved hjælp af følgende formel: (nummer i lugt tube - nummer i solvent rør) / samlet antal belastede fluer.
- Wash Y-labyrint set-up som følger: sættetid demonteret set-up i RBS 35 MD natten over. Skyl med vand fra hanen. Til sidst skylles med deioniseret vand og lad tørre ud.
3.. Statistisk analyse af data
- Udfør en t-test, en en-vejs ANOVA eller en to-vejs ANOVA efter data og variabler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1D viser to repræsentative responser ved hjælp af denne Y-labyrint-assay. Canton-S hanner kraftigt undgå 10% eddikesyre fortyndet i destilleret vand, hvorimod de ikke i væsentlig undgå 10% phenyleddikesyre. Disse analyser er baseret på 10 hanner pr måleglas placeret sammen i lastning hætteglas. Denne protokol kan undertiden føre til stor standardafvigelse på middelværdien. Hvis det er nødvendigt, er det muligt at reducere denne ulempe ved at bruge 20 hanner pr replikater i stedet for kun 10.. Matematisk valget af den ene person har en lavere vægt på indekset værdi for en større stikprøve.
Fig. 1. Male olfaktoriske respons vurderes med en Y-labyrint set-up. A) Split enhed. B) Assembledenhed. C) Opsætning i funktionsdygtig stand under langt rødt lys. D) Kvantificering af mandlige olfaktoriske reaktioner mod eddikesyre (AA) eller phenyleddikesyre (PAA) begge fortyndet i destilleret vand (10% v / v) (N = 11, svarende til i alt 110 fluer). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en t-test, som sammenligner de data, 0. 0 betyder ingen præference. En negativ værdi angiver en aversion mod lugtstof, og en positiv værdi en attraktion. ****: P <0,0001; ns:. ikke-signifikant (p = 0,1680) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores Y-labyrint-protokol er baseret på en tidligere beskrevet protokol 9. Men vi indføre to store forskelle. Først bruger vi smalle pipettespidser til at forhindre fluerne i at vende tilbage, når de beslutter at komme ind i hætteglasset med opløsningsmiddel eller opløsningsmidlet plus lugtstof. Disse smalle tips er også nyttigt at begrænse lugtstof udbredelse i Y-labyrinten. For det andet bruger vi en mindre belastning hætteglas at tvinge fluerne at komme i Y-labyrint. Det er vigtigt at have en høj deltagelse af disse fluer (80% til 100% efter 24 timer; Simonnet, personlig kommunikation).
Denne Y-labyrint-assayet er en effektiv test til bedømmelse chemosensory reaktioner i Drosophila. Baggrunden for testen, herunder stress på fluer (fra luftstrømmen, manipulation af fluer under lastning trin osv.) potentielt påvirke deres olfaktoriske svar. Disse miljøspørgsmål er kritisk og kunne forklare, i det mindste delvist, hvorfor forskelligeundersøgelser, der kunne have forskellige adfærdsmæssige resultater. For eksempel eddikesyre er vist at være frastødende på nogle betingelser 4,11, mens det er attraktivt i andre 12. Derfor er det kritisk at kontrollere alle disse parametre så meget som muligt.
En mulig begrænsning af denne Y-labyrint-analysen er dens kunstig kontekst for fluer, da de holdes i et aflåst design. Derudover fluer indtaste i smalle passager, som kunne være stressende for dem. Forsøgslederen har at huske dette i tolkningen af data.
For at omgå disse mulige begrænsninger, kan andre supplerende olfaktoriske test skal udføres for at bekræfte virkningen af lugtstoffer på adfærd. Disse tests omfatter T-labyrinter 4, 4 field-arena assays 7 eller vindtunneler 8. Men disse tests også udnytte kunstige miljøer for fluer, som kunne være mere eller mindre stressende. For eksempel under T-maze test fluer er highly understreget, idet de rystes under lastning trin 4. En fordel ved en T-labyrint i forhold til denne Y-labyrint-assay er imidlertid, at fluer nødt til at vælge inden for få minutter, hvor gå (for at lugtstoffet eller opløsningsmidlet). Derfor Y-labyrint-respons repræsenterer en "reflekterende" valg, mens resultater opnået med en T-labyrint repræsenterer en refleks valg i en meget stressende tilstand.
Endelig en mulig forbedring af denne Y-labyrint-analysen ville være at bruge glasrør langs hele sat op i stedet for plast til nogle komponenter (lastning rør, stik, pipettespidser). Disse plastdele kan i teorien har en lugt, da de er lavet af benzin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker 4 anonyme anmeldere for deres arbejde for at forbedre manuskriptet. Vi takker Centre National de la Recherche Scientifique for sin finansielle støtte til MBG og YG, og Université de Bourgogne og den franske Forskningsministeriet til MMS. Forskning i YG laboratorium er finansieret af Det Europæiske Forskningsråd (ERC Starting Grant, GliSFCo-311.403), Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), Conseil Régional de Bourgogne (Faber), og CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
