Summary
Vi presenterer et utvalg test for å avdekke påvirkning av odorants på Drosophila oppførsel ved hjelp av en Y-labyrint analysen.
Abstract
Deteksjon signaler fra omgivelsene er nødvendig for dyrene å sikre deres overlevelse. Til dette målet, bruker de miljømessige signaler som visjon, mechanoreception, hørsel, og chemoperception gjennom smak, via direkte kontakt eller gjennom luktesans, som representerer nivået til svingningene molekyl opptrer på lengre rekkevidde. Flyktige kjemiske molekyler er svært viktige signaler for de fleste dyr i deteksjon av faren, en kilde til mat, eller for å kommunisere mellom individer. Drosophila melanogaster er en av de vanligste biologiske modeller for forskere å utforske den cellulære og molekylære grunnlaget for luktesans. For å markere olfactory evnene til dette lille insektet, beskriver vi en modifisert valg protokoll basert på Y-labyrint test klassisk brukes med mus. Data innhentet med Y-labyrinter gi verdifull informasjon for å bedre forstå hvordan dyr håndtere sine stadig skiftende miljø. Vi introduserer en steg-for-steg-protokollen for å studerevirkningen av odorants på utlegger utforskende respons ved hjelp av denne Y-labyrint analysen.
Introduction
Chemoreception gjennom smak eller luktesans er en viktig sensorisk modalitet for dyr å overleve. Det gir viktige signaler som er nødvendige for påvisning av en fare eller matvarekilder, så vel som for sosial interaksjon. Det hjelper også dyrene å finne en sex partner nødvendig for deres reproduksjon. For mer enn 20 år, intensiv forskning, inkludert nobelprisvinnende arbeid av Richard Axel og Linda Buck i 2004 "for sine oppdagelser av odorant reseptorer og organiseringen av den luktsystemet", har blitt gjennomført for å avdekke de molekylære og cellulære grunnlaget for olfaction 1,2.
En av favoritt dyremodeller for forskere å dissekere olfactory oppfatning er D. melanogaster. Dette insektet deler en lignende cellulært og molekylært lukt-koding strategi med pattedyr. Den vitenskapelige samfunnet bruker ulike atferds paradigmer for å studere rollen til luktstoffer i denne bananflue. Disse testene inkluderer multimodale analyser som courtship tester der ulike sensoriske modaliteter, inkludert luktesans, er viktig å få frem mannlige frieri tre. Andre analyser har også blitt utviklet for å takle rollen som odorants mer spesifikt; disse inkluderer T-labyrinter, Y-labyrinter, felle analyser, firefelt arenaer og vindtunneler 4,5,6,7,8.
I denne artikkelen presenterer vi en enkel endrede Y-labyrint-analysen, som gir robuste olfactory svarene ved hjelp D. melanogaster. Vårt oppsett bruker slutt tips i strid med en tidligere beskrevet metode ni. Således har vår Y-labyrint to fordeler. Først unngår den noe tilbake i systemet når flua har gjort hennes valg. For det andre begrenser det utveksling av luktstoffer i alle deler av Y-labyrinten. Denne siste fordel er viktig siden Drosophila er meget følsom for luftstrømmen, som ofte blir brukt for å unngå metning odorant. For å justere den eksperimentelle oppsett med en luftstrøm vil være tid-og kostnadskrevende. Derfor representerer vår Y-labyrint analysen en eftiv og rask måte å teste lukte ytelse av Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Før start
- Bruk en isogenized referansen lager peiling stabile og robuste atferds fenotyper. Det er ingen generell regel for å velge denne bestanden, siden alle mulige kontroller kan bære heterogene bakgrunn alleler.
- Bruk denne kontrollen belastning å backcross annenhver lager nødvendig for senere trinn. Dette tilbakekryssing trinnet er vanligvis representert med minst fem etterfølgende krysninger av en enkelt jomfru kvinne (for å tillate mulig kryssing mellom homologe kromosomer) til 2-3 isogene referanse hanner fem. Dette trinn er viktig for å homogenisere den genetiske bakgrunnen mellom de forskjellige fly-bestander.
- Oppretthold Drosophila aksjer på et standard maismel (9%), gjær (10%), og agar-medium (1,5%) supplert med antibiotika (0,4% metyl-para-hydroksy-benzoat) i en 12-timers lys / mørkesyklus ved 25 ° C.
- Oppnå chemosensory eksperimenter i et temperaturkontrollert rom (25 ° C) i henhold langt rødt lys(For å eliminere bidrag av visuelle signaler, og å fokusere på chemosensory signaler). Regelmessig fornye luften i rommet for å ventilere området mellom hvert forsøk.
2. Olfactory Response ved hjelp av en Y-labyrint analysen
- Sulte fluene til 16 til 18 timer ved 25 ° C i glassrør inneholdende våte papirhåndkle før testing.
- Bli med i en Y-form-kontakt til to glassflasker og til en mindre plasthetteglass (lasting hetteglass). Bruk en ml pipetter som passerer gjennom de skumpropper for å koble kontakten til de tre ampuller, og for å få en tett forseglet Y-labyrint. Skjær de smale endene av to pipetter (~ 2 mm diameter, for å unngå eventuell avkastning på flua når den har gjort sitt vedtak) til å danne to "felle" ampuller, og et stort slutten av ett pipettespissen å danne "loading" røret (figur 1A).
- Like før du kobler "felle" hetteglass (Figur 1B), plasserer en ~ 6 mm diameter filter papir ihvert hetteglass. Legg 40 mL av odorant løsning på én filterpapir, og 40 pl av den tilsvarende oppløsningsmiddel på den andre filterpapir.
- Introduser ti 4 til 9 dager gammel fluer inn i "loading" hetteglass. Ikke bruk CO 2 anestesi under denne overføringen, siden det har en sterk effekt på atferd 10. Heller bruke kort kjøling på is. Riktig manipulering av bedøvede fluer er viktig å begrense belastningen på de fagene så mye som mulig.
- Utføre en serie av Y-labyrint tester ved 25 ° C under far-rødt lys (ved hjelp av LED pærer for å begrense mulige varmekilden) for å unngå visuell stimuli så mye som mulig. Vær forsiktig med å veksle de orienteringer av Y-labyrinter (odorant inneholder tube til venstre, eller til høyre og lasting tube foran eller bak, figur 1C).
- Tillate flere timer for fluene til å gå inn i fellen hetteglasset med odorant eller løsemiddel. Telle fluer etter 24 timer for å øke participatipå opp til mer enn 80% og gi maksimal lukteindeksverdi (Simonnet, personlig meddelelse).
- Beregn den resulterende olfactory indeks ved hjelp av følgende formel: (antall i lukt tube - tall i oppløsningsmiddel rør) / totalt antall lastede fluer.
- Vask Y-labyrint satt opp som følger: suge den demonterte satt opp i RBS 35 MD over natten. Skyll ut med vann fra springen. Til slutt skyll med avionisert vann og la tørke ut.
Tre. Statistisk analyse av data
- Utfør en t-test, en enveis ANOVA eller en to-veis ANOVA, avhengig av data og variabler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1D viser to representative svarene ved hjelp av denne Y-labyrint analysen. Canton-S hanner sterkt unngår 10% eddiksyre fortynnet i destillert vann, mens de ikke i betydelig grad å unngå 10% fenyleddiksyre. Disse analysene er basert på 10 menn per replikere plassert sammen i laste ampuller. Denne protokollen kan noen ganger føre til store standardavvik. Hvis nødvendig, er det mulig å redusere denne ulempen ved å bruke 20 hanner pr replikater i stedet for bare 10. Matematisk, valg av en person har en lavere vekt på indeksverdi for et større prøvestørrelse.
Figur 1. Mann lukte respons vurderes med en Y-labyrint oppsett. A) B) Split enhet. Assembledenhet. C) Sett opp i arbeidstilstand etter far-rødt lys. D) Kvantifisering av hann olfaktoriske respons overfor eddiksyre (AA) og fenyleddiksyre (PAA) som begge fortynnet i destillert vann (10% v / v) (N = 11, som tilsvarer totalt 110 fluer). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en t-test for sammenligning av data til 0. 0 betyr ingen preferanse. En negativ verdi indikerer en aversjon mot odorant, og en positiv verdi en attraksjon. ****: P <0,0001; ns:. ikke-signifikant (p = 0,1680) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår Y-labyrint-protokollen er basert på en tidligere beskrevet protokoll 9.. Men, innfører vi to viktige forskjeller. Først bruker vi smale pipetter for å hindre fluene fra å vende tilbake når de bestemmer seg for å gå inn i hetteglasset med løsemiddel eller løsemiddel pluss odorant. Disse smale tips er også nyttige for å begrense diffusjon odorant i Y-labyrint. I tillegg benytter vi en mindre lastehetteglasset for å tvinge fluene å gå inn i Y-labyrinten. Det er viktig å ha en høy deltagelse av disse fluer (80% til 100% etter 24 timer; Simonnet, personlig kommunikasjon).
Dette Y-labyrint analysen representerer en effektiv test for å evaluere chemosensory reaksjoner i Drosophila. Konteksten av testen, blant annet stress på fluene (fra luftstrømmen, manipulering av fluene under lasting trinn, etc.) er potensielt påvirke deres olfactory svar. Disse miljøspørsmål er kritisk og kunne forklare, i hvert fall delvis, hvorfor annerledesstudier kunne ha ulike atferdsmessige utfall. For eksempel eddiksyre er vist å være frastøtende i enkelte forhold 4,11, mens det er attraktivt i andre 12. Derfor er det viktig å styre alle disse parametre så mye som mulig.
En mulig begrensning av dette Y-labyrint-analysen er den kunstige kontekst for fluer, siden de er holdt i en låst utforming. I tillegg, fluer må skrive inn i trange passasjer, noe som kan være stressende for dem. Eksperimentator må huske dette ved tolkning av data.
For å omgå disse mulige begrensninger, kunne andre komplementære lukte tester utføres for å bekrefte effekten av odorants på atferd. Disse testene inkluderer T-labyrinter 4, 4 felt-arena analyser 7, eller vindtunneler åtte. Imidlertid er disse tester også benytte kunstige miljøer for fluer, som kan være mer eller mindre stressende. For eksempel under T-labyrint tester fluer er highly streket siden de er rystet under lasting trinn 4. Imidlertid en fordel med en T-labyrint i forhold til denne Y-labyrint-analysen er at fluene har å velge i løpet av minutter, der skal gå (i odorant eller til løsningsmiddel). Derfor er den Y-labyrint responsen representerer en "reflektert" valg, mens resultatene oppnådd med en T-labyrint representerer en refleks valg i en høyt stresstilstand.
Endelig er en mulig forbedring av dette Y-labyrint assay ville være å bruke glass-rør langs hele satt opp i stedet for plast for noen komponenter (laste-rør, koblings, pipettespisser). Disse plastdeler kan, i teorien, har en lukt, siden de er laget av bensin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker fire anonyme anmeldere for sitt arbeid for å forbedre manuskriptet. Vi takker Centre National de la Recherche Scientifique for sin økonomiske støtte til MBG og YG, og Université de Bourgogne og det franske departementet for forskning til MMS. Forskning i YG laboratoriet er finansiert av European Research Council (ERC Starting Grant, GliSFCo-311403), den Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), Conseil Régional de Bourgogne (Faber), og CNRS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Polystyrene tube | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y-maze |
| Drosophila Borosilicate tube | Dijon verre | 95 X 25 mm Y-maze |
|
| Foam stopper | Dutscher | 999038 | Y-maze |
| Y-shaped connector | Europrix | 11020605 | Y-maze |
| 100-1,000 µl pipette tips | Corning | 4868 | Join the following pipette tips to the Y-shaped connector. Cut 2 pipette tips at 65 mm from the wide end, and connect the narrow end (with a ∼2 mm opening) to 2 test vials. These openings will limit the U-turns once the flies enter the tubes containing the odors. Cut 1 pipette tip at 35 mm from the wide end, and connect it to the loading vial. Y-maze |
| Far-Red LED Bulb | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| Phenylacetic Acid | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| Yeast | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| Cornmeal | eurogerm | Farine de maïs | |
| Agar | Kalys | HP-697-25 | |
| Methyl hydroxy 4 benzoate | VWR international | 25605293 |
References
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y.
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
