Summary
手术应激的小鼠肿瘤模型来探讨术后免疫抑制如何促进转移性疾病，并评价免疫围手术期治疗。
Abstract
手术切除是大多数癌症患者的基本治疗方法，但手术引起功能障碍，免疫系统，这已被证实与转移性疾病的动物模型中和在癌症患者中的发展。从我们的组和其他临床前工作已经证明先天免疫功能，特别是NK细胞在术后产生深远的抑制，这起着转移的增强发展的重要作用，手术后。相对较少的动物研究和临床试验都集中在特征和逆转癌症手术的不利影响。采用自发转移性肿瘤和手术应激的严格动物模型，对肺转移的发展癌症手术的提升被证明。在这个模型中，4T1乳癌细胞被植入在小鼠乳腺脂肪垫。在第14天肿瘤后植入，完整切除原发乳腺肿瘤是performeD在所有的动物。动物的一个子集接收的腹部切除术的形式附加手术应激。在第28天，肺肿瘤结节进行量化。当免疫治疗给予立即在术前，检测免疫细胞的活化深刻的防止转移的发展在手术之后。而4T1乳腺肿瘤手术模型允许对腹部手术应激对肿瘤转移的影响的仿真，其适用于其他类型的肿瘤需要进行测试。目前的挑战是确定在临床前小鼠模型的安全和前途的免疫疗法，并将其转化为可行的围手术期治疗应给予癌症手术的患者，以防止转移性疾病的复发。
Introduction
手术是在治疗癌症治疗实体瘤的重要组成部分，但尽管完全切除，许多患者制定一个转移复发并最终死于他们的疾病。越来越多地，手术后期间，由于生理应激反应手术，包括血液凝固，生长因子的释放，以及免疫抑制的结果，确认为关键时刻为转移的发展。我们组1,2和其他3-5表明，术后早期是一个独特的敏感时间，形成转移灶。
一个负责手术前转移效应的关键机制是自然杀伤（NK）细胞1-3术后功能障碍。 NK细胞是参与肿瘤的生长和转移6的控制的先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞。 NK细胞功能障碍在手术后已被记录我Ñ 人类患者1,7-9和动物模型1,10,11。术后NK细胞抑制水平与第自发和植入转移1,11-14动物模型增加了转移，而在人类的研究，在围手术期低NK细胞活性率较高的癌症复发率和死亡率15,16的关联。
尽管如此，目前没有癌症疗法专门针对发生癌症手术紧随前转移的变化。围手术期指的机会，其中在转移过程进行干预的治疗窗。虽然传统的癌症治疗，如细 胞毒性化疗，被认为太毒被给予患者大手术17恢复，免疫疗法是一种理想的围手术期管理。围手术期使用重组IL-2和IFN-γ已经探索我治疗早期阶段展示他们的潜力，以防止术后NK细胞的抑制和改善无进展生存期18-21临床试验。不幸的是，进一步的发展受到阻碍这个非特异性细胞因子疗法结合大手术17的耐受性。病毒也NK细胞的强效非特异性活化剂。我们的研究曾证明，复制病毒，如新型抗肿瘤溶瘤病毒（OV）和非复制病毒的疫苗，如流感疫苗，术前给药能抑制手术诱发的NK细胞功能障碍和减轻转移性疾病1,22。
本文所描述的手术模式促进了我们参与了肿瘤细胞术后的扩散和生长机制的了解，并允许我们去探索，可以在围手术期给予新的靶向治疗药物。为了实现这一目标，一个动物制定手术应激和自发转移的一叠模型。该模型利用了鼠标的乳腺癌肿瘤（免疫BALB / c - 4T1），它们能自发地从初级乳腺转移到多遥远的地方，尤其是肺部。在第0天，乳腺癌细胞被植入在小鼠乳腺脂肪垫。在第14天肿瘤后植入，在所有的动物中进行了完整切除原发乳腺肿瘤。动物的一个子集接收的腹部切除术的形式附加手术应激。在第28天，在肺肿瘤结节手术强调和比较不手术对照小鼠中分离和量化。在癌症和手术动物模型，正在研究手术对癌转移的影响及创新免疫疗法，包括复制和非复制病毒为基础的免疫刺激剂的围手术期管理的有效性进行测试，以便在第一时间。
Protocol
1。保持4T1肿瘤细胞在体外
- 培养未修改的4T1肿瘤细胞的完全DMEM培养液（DMEM，10％FBS，1×青霉素/链霉素）的10厘米的组织培养板中。孵育在37℃，5％CO 2的细胞培养箱。
- 文化分裂2-3次/周。为保持最佳活力细胞不应该超过80％汇合。不要使用细胞建立体内的原发性肿瘤，如果文化已经传代体外 > 1个月，因为这降低恶性肿瘤转移潜能比早期传代细胞。
2。收获4T1肿瘤细胞注射
- 从用巴氏吸管的组织培养板中吸出培养基。
- 加入含2ml EDTA10毫升1X无菌PBS。让的PBS溶液，在37℃，5％CO 2的组织培养箱中5-7分钟孵育的板。
- 从板河收获PBS溶液insing板2-3X使用的解决方案，转移到15毫升锥形管。
- 细胞离心5分钟，在500×g离心，在4℃下，在台式离心机。
- 吸去上清，重悬在无血清的DMEM将细胞沉淀。
- 用细胞计数测定细胞浓度。
- 稀释的细胞用无血清培养基中以1×10 6 cells/500微升（1×10 5 cells/50微升（用于注射和定位细胞于冰上。
3。注射小鼠4T1肿瘤细胞
完成所有的动物研究是根据在渥太华建议大学动物护理兽医服务用于接收原位注射或植入肿瘤的所有动物的组织指导方针。
- 皮下注射治疗小鼠丁丙诺啡（0.05毫克/千克）手术疼痛管理前1小时。
- 诱导并用注射的持续时间期间2.5％的异氟醚麻醉下保持鼠标化。捏鼠标的脚垫来检测反射反应。如果没有检测到，有效的麻醉水平达到了。无菌眼润滑剂，然后应用到防止角膜干燥。
- 加载一个30 G½在“超精细”注射器正是50微升的细胞悬液。确保所有的气泡被从注射器柱通过敲击注射器的侧撞出气泡除去。
- 将鼠标（麻醉下）腹朝上。
- 用酒精棉签清洁注射部位和水平，并直接引入进针第四届乳腺脂肪垫，慢慢地免除注射器体积。
- 用棉签清理任何可能的泄漏。
- 让小鼠从麻醉中恢复。
- 保持丁丙诺啡（0.05毫克/千克）的疼痛管理管理SC，每8小时2天。
4。在4T1荷瘤BALB / c小鼠管理围手术期处理
- 13天后肿瘤细胞注射，使用外部卡尺测量原发性肿瘤。测量的最大长径（长度）和最大横直径（宽度）与卡钳。修改后的椭圆体的公式用于计算肿瘤体积（ 肿瘤体积 = 1/2（ 长度为宽度的 2）
- 13天后肿瘤细胞注射，原发肿瘤应该测量大约1 立方厘米 。当这个肿瘤测量达到后，准备围手术期治疗试剂。
- 溶瘤病毒是创新的治疗，人们可以在围手术期管理。制备溶瘤病毒（1×10 9 PFU / 1毫升）在1x无菌PBS中，置于冰上注射前。
- 安全和鼠标的地方为阻挡器尾静脉注射。
- 轻轻地热鼠尾在温暖的自来水，以可视化的侧面尾静脉。
- 恰恰与100微升的溶瘤病毒治疗加载一个27 G½在“胰岛素注射器”。确保所有气泡从注射器列中删除。
- 用1×10 8 PFU/100微升/鼠注入鼠标的侧面尾静脉中的一个。如果针被适当地插入侧脉，无阻力，应按压注射器时，可以感觉到。
5。原发肿瘤和腹部左侧肾切除术中完整切除
- 14天后肿瘤细胞注射，开始例行的围手术期护理以下渥太华动物护理和兽医服务的大学认可的协议。皮下注射治疗小鼠丁丙诺啡（0.05毫克/千克）手术疼痛管理前1小时。诱发和使用在手术过程中2.5％异氟烷维持麻醉。 üNDER无菌条件下，使用无菌手术器械，手术部位被剃光，并擦洗。动物被施用在手术前皮下流体和眼的润滑剂。
- 做一个小切口（1-2厘米长）从乳腺脂肪垫轻轻地，彻底切除原发肿瘤4T1。
- 关闭切口用2-39毫米主食。
- 通过沿小鼠的腹侧中线皮肤和皮下组织层切割露出腹部。
- 做一个切口在白线（3-4厘米）来访问小鼠腹膜。
- 通过移动覆盖大便到侧露出腹部的左内侧。确保肠子都保持湿润，用生理盐水浸湿无菌纱布。
- 用钝对手术镊子，轻轻抓住了左肾。
- 使用3-0涂蜡编织丝线绑成一个环，结扎左肾肾门和3外科结固定。与surgi取出左肾卡尔剪刀。
- 仔细检查缝合的领带，以确保有足够的止血的实现。
- 使用5-0编织吸收，然后主食皮肤使用9毫米主食层连续缝合环闭合皮下层。步骤5.2至5.10应该要求10分钟/动物。
- 保持丁丙诺啡（0.05毫克/千克）的疼痛管理管理SC，每8小时2天。
6。小鼠实施安乐死及加工和肺部肿瘤负担定量
- 在28天后4T1肿瘤注射，根据动物护理和兽医服务在渥太华大学协议安乐死小鼠。
- 喷下来鼠标用70％乙醇。
- 使最初的切口，用剪刀只是下方的肋骨。
- 通过沿着鼠标的胸腔腹正中线皮肤和皮下组织层切割露出胸部。
- 通过皮肤和组织每侧到NE使横向切口CK鼠标。
- 通过轻轻抓肺而剪断相差结缔组织上方和下方的肺部解剖出肺。
- 预浸提取的肺中冷PBS以除去残留的血液，然后放置在10％缓冲福尔马林。
- 拍摄每个肺肿瘤转移的评估。权衡肺部肿瘤负荷定量。
Representative Results
已开发手术应激而导致肺转移的急剧增强的可重复的小鼠模型。在一天28后4T1肿瘤接种（14天后肿瘤切除术+ / - 腹部肾切除术），肺收获和可视化的转移。手术明显增加肺转移的量相比，未处理的小鼠就证明了肺的照片（ 图1A），肺结节的枚举（ 图1B）和肺重量（ 图1C）。复制溶瘤病毒与灭活流感疫苗的术前给药显著抢救癌手术前转移效应（ 图1A-C）。
要确定NK细胞是否起到防止转移后疫苗治疗调解作用，NK细胞是用抗唾液酸-GM-1在肿瘤转移模型药理耗尽。在不存在NK细胞的细胞中，我们观察到的围手术期的免疫疗法的治疗效果的废除（ 图2A和2B）。该数据表明，肿瘤转移切除在我们的手术应激模型主要通过溶瘤病毒和流感疫苗活化NK细胞和随后的NK介导的肿瘤介导的裂解。下面的溶瘤病毒和流感疫苗的围手术期管理，以进一步刻画NK细胞的功能， 体外 NK细胞杀伤进行了评估。简单地说，汇集和整理DX5 + NK细胞从脾中分离手术强调与对照组小鼠。它们共培养4小时用铬标记的YAC-1靶细胞，在不同的效靶比，接着上清液铬释放用γ计数器测定。 NK细胞的细胞毒作用下溶瘤病毒和INFL的围手术期给药的显著手术引起的缺陷以及一个显著复苏的NK细胞杀伤uenza疫苗相比单纯手术（ 图2C和2D）进行了观察。总之，这些结果表明，围手术期NK细胞的抑制可以成功地治疗和转移性疾病减少了新颖的免疫疗法。
图1。新型抗肿瘤溶瘤病毒和流感疫苗作为对肺转移 4T1肺肿瘤转移时的指示治疗组由代表肺（一）照片，（二）肺 肿瘤枚举28日。评估手术引起的围手术期强化治疗结节和（C）肺湿重。数据代表3次类似的实验，其中n = 5-10/group（*，P = 0.01; **，P <0.0001; NS，不显著）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。手术应激通过削弱NK细胞增加肺肿瘤转移。 （A，B）肺肿瘤转移的定量手术强调与新颖的围手术期治疗治疗的小鼠（C，D）纯化DX5 + NK细胞从手术的能力，强调和未经处理的控制，以杀死肿瘤细胞。数据显示为平均百分比 - 从一式三份孔的指示é铬释放的（+ / SD）：T比率。数据代表3次类似的实验，其中n = 4-5/group（*，P = 0.01; **，P <0.005，NS，不显著）。/ www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
Discussion
手术切除是治疗患者的局部实体恶性肿瘤的中流砥柱。即使完全切除，许多患者制定一个转移复发并最终死于他们的疾病。术后即刻期间提供了一个理想的环境，形成癌转移，调制，在很大程度上，术后NK细胞的抑制。尽管如此，它仍然是一个治疗窗口，在很大程度上忽略。 目前并没有标准的围手术期的抗癌疗法旨在预防术后转移。目前的挑战是确定安全的和有前途的疗法，将激活NK细胞在围手术期，从而防止建立微转移灶。这些疗法必须严格特点是在临床前动物模型安全性和有效性，然后翻译成精心设计的临床试验。
主要比率制定手术应激的小鼠肿瘤模型的纳莱是继手术，以探讨免疫抑制和转移扩散的机制和评估创新免疫疗法具有潜在的癌症患者接受手术切除原发肿瘤备将来使用。为了实现这个目标，加上手术应激一个4T1小鼠乳腺癌模型的开发。而4T1细胞系是鼠“乳腺癌”，使用该细胞系的原因是自发性转移的重现性，使我们能够评估手术应激的一个现实癌模型的影响。在这种情况下，恶性的实际原点比转移潜力和肿瘤生物学那么重要了。我们的模型的第二关键组分是一种动物外科手术，以接近于人类癌症手术的发展。在这种动物手术应激模型，主要4T1乳腺肿瘤后达到1 立方厘米切除。因为癌症手术在人类患者涉及显著的免疫抑制，在“手术应激”治疗组的开放式腹部切除术是另外进行。因为它与更传统的肿瘤切除术在人类进行比较，一个完整的左侧肾切除术的创伤性是非常类似的，以多种类型的外科治疗实体恶性肿瘤，包括手术治疗结肠直肠癌，卵巢癌，肾癌，胰腺癌，肺癌和食道癌癌症。此外，我们会说，发生围手术期的深刻的生理变化，由于剖腹探查+肾切除术，充分再现了发生下列微创手术对于大多数实体恶性肿瘤绝大多数生理变化。为了控制围手术期因素，可能导致过度手术应激和死亡，麻醉时间和手术，并在手术中保持体温的精确定义。所有这些参数都精确地执行了D在我们的手术协议中定义镜像例行围手术期护理在人类癌症患者。
的围手术期处理的定时是一个额外的关键组成部分的围手术期抢救模型。 4T1荷瘤小鼠先前已经治疗流感疫苗3个方案：新辅助（给出前5天手术），围手术期（在手术当天给出）和围手术期+多剂量（在手术当天发出，其次是2额外的剂量给予5天外）。值得注意的是，疫苗治疗的所有3种模式显著降低肺转移22。然而，流感疫苗的围手术期给药作为单剂量减少转移最有效。总的来说，这些实验中突出的治疗窗窄，在转移过程进行干预眼前的围手术期的重要性。
围手术期使用创新的免疫疗法，如oncoly抽动病毒和疫苗已完全被限制在我们的研究小组。我们证明在第一次新颖的溶瘤ORF和牛痘病毒的围手术期用药可逆转NK细胞抑制手术后的动物模型1。更重要的是，本次救援机体免疫功能的关联与在术后转移的形成减少。在人类研究中，术后肿瘤手术患者减少了NK细胞的细胞毒性和围手术期的OV显着提高NK细胞活性在肿瘤患者1。使用市售的预防性疫苗，我们证明了围手术期的流感疫苗接种显著降低肿瘤转移和改善临床前肿瘤模型中NK细胞的细胞毒作用。在人类的研究，流感疫苗显著增强健康人的捐助者和癌症手术的患者22 NK细胞活性。
许多方法被用来减少CANC呃复发，包括化疗和放疗，但这些疗法通常给予星期前（新辅助）或（佐剂）手术后个月。这方面的研究表明，术后早期是决定长期的肿瘤复发率的关键。因此，在这一关键时期的临床干预免疫疗法的形式可能有大量的长期利益。采用自发肺转移和手术应激小鼠模型我们的研究提供了一个独特的机会去探索新的治疗方法，并确定他们的潜力，以防止围手术期免疫抑制癌症手术的患者，从而也降低癌症的复发率。
Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者希望你要感谢金耶茨，艾琳富兰克林，和丽贝卡Tjepkema（动物护理和兽医服务，渥太华大学）与动物手术援助。李华泰是由一个全宗德RECHERCHE桑特魁北克奖学金支持。领导者的机会格兰特丽贝卡奥尔 - 这项工作是由加拿大癌症协会研究所创新资助，研究与发展早期研究者奖安大略省教育部和加拿大创新基金会运作的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cell-Gro | 10-013-CV | |
| Inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 1x Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Cell Gro | 21-031-CV | |
| Buprenorphine | Chiron, Guelph | RXN309968 | |
| Isoflurane | Baxter Corp | 1001936040 | |
| 1/2 Ultra-fine syringe | Terumo | 30 G, SS05M3009 | |
| 9 mm Staples | Braintree | ACS BX | |
| 5-0 Braided absorbable suture | Covidien | UL-202 | |
| 3-0 Wax braided silk suture | Covidien | S-194 | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 | |
| 4T1 Tumor cells | ATCC | CRL-2539 | |
| BALB/c mice | Charles Rivers Labs | Strain Code:028 |
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