Summary
Мы представляем новую технику флуоресценции для селективного на месте маркировки активных фагоцитов, которые ясно от клеточных трупов в ход. Подход важен для оценки реакции мозга к ишемии, поскольку лишь небольшая часть фагоцитов, присутствующих в ишемической мозга участвуют в оформлении гибели клеток.
Abstract
Мы описываем новую гистохимическое подход к визуализации фагоцитарной оформления в фокальной ишемии мозга. Подход позволяет изучать ликвидации отмерших клеток при инсульте по фагоцитов удаления отходов любого сотового линии. Несмотря на многочисленные клетки различного происхождения, которые способны к фагоцитозу присутствуют в ишемическом мозге, только часть из них активно поглощать и переваривать клеток трупов. Избирательное визуализация, количественная и анализ такого активного фагоцитарной сточных управления являются полезными в оценке реакции мозга к ишемии. Эффективное расстояние гибель клеток имеет важное значение для восстановления мозга от ишемического повреждения, как это открывает путь для последующих восстановительных процессов. Неспособность очистить трупы приведет к токсической реакции, вызванной Неискаженный ДНК и белков. Описанная процедура использует флуоресцентных зондов выборочно сшивали вирусной топоизомеразы к характерным разрывов ДНК, полученных во всех фагоцитов во охватеи переваривание клетки необратимо поврежденных ишемией. Метод представляет собой новый инструмент для исследования реакции мозга на ишемического повреждения.
Introduction
Ишемический инсульт вызывает глубокие изменения в пострадавших тканях головного мозга. Она также может инициировать массовую гибель клеток, что приводит к быстрому активации резидентов фагоцитирующих клеток микроглии происхождения. Он также выделяет инфильтрацию ишемической мозга с помощью различных типов крови, полученных профессиональных фагоцитов в том числе нейтрофилы, макрофаги, дендритные, и тучных клеток 1,2.
Это по-прежнему обсуждается, играет ли это ответом на ишемического повреждения положительное или отрицательную роль. Хотя фагоцитоз следующие инсульта может быть выгодно, потому что она очищает омертвевшие клетки и подавляет воспаление, но и образуются токсичные активные формы кислорода влияет выживаемость нейронов и усугубляет повреждение тканей 1-5.
В то время как несколько типов фагоцитов проникнуть ишемический мозг, не все из них участвуют в сточных управления на поглощение клеток трупы и расчистив путь для регенеративных процессов 1-3. Это крeates требование для селективного выявления клеток удаления отходов, которые осуществляют фагоцитарную клиренс гибели клеток при инсульте. При визуализации такие активные клетки регулирования отходов, важно также, чтобы ответить на вопрос, насколько эффективно они ухудшают охвативших сотовые трупы. Самый эффективный и полная деградация ДНК умирающего клетки в фагоцитоза важно, потому что это мешает чувство собственного иммунизации и высвобождение патологического ядерного материала 6.
Здесь мы представляем новые зонды, которые используют конкретные разрывы ДНК в качестве маркеров активных фагоцитов. Эти подписи разрывы исключительно производится в течение пробоя охвативших ядер внутри функциональных клеток удаления отходов. Поэтому зонды избирательно маркировать только те фагоциты, что поглотит и активно переваривать клеточные трупы. Они также позволяют наблюдать интенсивность и завершение пробоя ДНК после охвате. Зонды являются полезными в оценках интенсивности и коэффициентами полезногоency фагоцитарной оформления.
Новые зонды полагаться на маркер небелковой основе и, следовательно, может быть особенно выгодным в исследованиях инсульта, где обширные ишемические повреждения может нарушить клеточной морфологии или истощить маркеры на основе белков, особенно внутри основного ишемической зоне.
Принцип метода представлена на рисунке 1. На рисунке показано шпильки-образный олигонуклеотидных зондов сшивали с помощью фермента коровьей оспы топоизомеразы (VACC ТОРО) чтобы 5'OH концов ДНК, порожденная лизосом аз II в процессе пищеварения ДНК 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Метод подходит для формальдегида парафиновых срезах тканей. Методика демонстрируется здесь в своем применении экспериментального инсульта у крыс.
1. Подготовка Компоненты для Tyramide Усиление сигнала (TSA) Система
Хотя повышение TSA основе используется в заключительном этапе маркировки, подготовка к этой реакции может занять более 1 часа. Поэтому удобно сделать реагенты TSA перед началом маркировки.
- Сделать флуорофором tyramide маточного раствора. Используйте флуорофором tyramide реагент поставляется в отдельных флаконах с маркировки комплекте TSA. Добавить 300 мкл ДМСО во флакон tyramide реагента. Флуорофора tyramide раствор стабилен в течение не менее 3 месяцев при хранении при 4 ° С.
- Сделать TNT промывочного буферного раствора, содержащего: 0,1 М Трис-HCl, рН 7,5; 0,15 М NaCl; 0,05% Tween-20. При необходимости 0,3% Тритон Х-100 может быть заменен на 0,05% Твин-20. Переменногоively PBS может быть использован в качестве промывочного буфера.
- Сделать TNB блокирующем буфере, содержащем: 0,1 М Трис-HCl, рН 7,5; 0,15 М NaCl; 0,5% блокирующий реагент (поставляется в комплекте с). Чтобы полностью растворить блокирующий реагент, медленно добавить его небольшими порциями в буфере при перемешивании. Нагреть это решение постепенно до 55 ° C при непрерывном перемешивании. Это может занять 30-60 мин. Решение появится молочный. Довести до комнатной температуры перед использованием. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного использования.
2. Подготовка разделах
Используйте слайды с установленными 5 мкм толстых секций, вырезанных из фиксированных формалином тканей.
- Treat секции с ксилолом в течение 15 мин.
- Увлажняет разделы следующим образом: замочить в 96% этанола в 2 раза в течение 5 мин каждого; замочить в 80% этанола в течение 5 мин; мыть с водой 2 раза в течение 5 мин каждый.
- Сделать протеиназы К рабочего раствора путем разведения протеиназы К маточного раствора до 50 мкг / мл в PBS.
- Добавить ПРОТЕИНАЗК рабочего раствора на разделы. Выдержите 15 минут при 23 ° С Объем раствора и время пищеварения, возможно, должны быть скорректированы в зависимости от размера разделов и типов тканей. Для сечения небольшой (менее 5 мм в диаметре) 50 мкл раствора протеиназы будет вполне достаточно. Раздел Для среднего размера (~ 10 мм в диаметре), добавьте 100 мкл раствора протеиназы К. Для очень больших разделов объем раствора можно масштабировать до. Во всех случаях позаботиться, чтобы предотвратить избытком секций, что приводит к полной потере сигнала и разрушает ткани морфологию. Это часто происходит, если время инкубации превышает 25 мин.
- Промыть в дистиллированной секций 2x воды в течение 5 мин каждый. Подготовьте маркировки смеси, содержащей активный зонд в то время как разделы в воде.
3. VACC ТОРО на основе Окрашивание
- Готовят раствор активного зонда путем объединения следующее:
Вода - 11,75 мкл
1 М Трис-HCl, рН 7,4 - 1,25 μл
100 пмоль 12-щелочного свес самоубийства олигонуклеотида - 1 мкл
100 пмоль адаптера олигонуклеотида - 1 мкл
50 пмоль VACC ТОРО - 10 мкл - Осторожно перемешать с помощью пипетки. Инкубируют при комнатной температуре (23 ° C) в течение 15 мин, чтобы позволить для активации датчика.
- Возьмите разделы из промывной сосуд и аспирации оставшуюся воду. Затем нанесите раствор активного зонда, полученного на стадии 3.1 (25 мкл на ~ 10 х 10 мм секции).
- Покровные разделы и инкубировать в течение 15 мин при 23 ° С Dip слайды в воде, чтобы мягко удалить покровные. Промыть 3 раза в воде в течение 5 мин каждый.
4. TSA усиление сигнала
- Крышка ткани секции с TNB блокирующем буфере подготовлен ранее и инкубировать слайды в увлажненной камере в течение 30 мин при комнатной температуре (23 ° C).
- Подготовить разведение стрептавидин-пероксидазы хрена конъюгатов (SA-HRP) в ТНБ блокирующем буфере 1:100. Аспирируйте ТНБблокирующем буфере и применить решение SA-HRP. Инкубируйте слайды с SA-HRP в течение 30 мин при комнатной температуре. Используйте достаточный объем реагента, чтобы покрыть срезы ткани, обычно 100 мкл на разделе.
- Вымойте слайды в 3 раза в течение 5 мин в каждом из направлений TNT промывочного буфера (или PBS) при комнатной температуре.
- Подготовить разведение 1:50 флуорофором tyramide складе в 1x Amplification разбавителя из комплекта. Внесите рабочего раствора флуорофором tyramide на каждом слайде. Используйте достаточно рабочий раствор, чтобы полностью покрыть срезы ткани, обычно 100 мкл на разделе. Сделать рабочего раствора флуорофором tyramide непосредственно перед каждым маркировки. Решение не может быть повторно использованы, так отменить любые неиспользованную часть его после маркировки.
- Инкубируйте слайды при комнатной температуре в течение 3 до 10 мин. Монитор увеличение флуоресценции под микроскопом, пока первые намеки структур не видно. Быстро перейти к мыть шаг.
- Вымойте слайды в 3 раза в течение 5 мин в каждом из направлений TNT промывочного буфера (или PBS) при комнатной тemperature при перемешивании.
- Добавьте antifading решение с DAPI и покровного стекла. Соблюдайте под флуоресцентным микроскопом. Для визуализации DAPI и флуоресценции FITC использовать набор фильтров полосовой:
D490/40 возбуждения FITC, эмиссия 520/10; DAPI D360/40 возбуждения, эмиссия 460/20, или аналогичный.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Принцип метода для маркировки активные фагоциты регулирования отходов представлена на рисунке 1. Схематическое показывает, что доходы обнаружения в три этапа. Первый шаг включает в себя активацию датчика (рис. 1А); на второй стадии активированный зонд лигируют с конкретными разрывов ДНК в срезах тканей (фиг. 1С); третий шаг включает в себя люминесцентные усиление сигнала (рис. 1D). В более подробного объяснения, обнаружение идет следующим образом:
Активация датчика 1.. До проведени реакции лигировани VACC TOPO должно быть ковалентно связан с 3'-конца от oligoprobe. Во время активации зонда VACC ТОРО придает шпилька-адаптера дуплекс и расщепляет верхняя прядь. 12-база длиной часть затем постоянно отделяет, оставив VACC TOPO прикреплен к концу 3 'шпильке. Этот олигонуклеотид с ферментом, связанного с ее 3 'конце может маркировать типа разрывы ДНКазы II (фиг. 1b). 12-база свес и адаптер олиго необходимы, поскольку фермент не будет сокращать более короткий прядь 8 и, следовательно, не сможет присоединить к зонду и активировать ее 3 'конце.
2. Зонд перевязки. Биотинилированные шпильки лигируются по VACC ТОРО в 5'OH затупляли разрывы ДНК, генерируемые фагоцитов переваривание ядра мертвых клеток. Прилагаемые зонды визуализированы с помощью усиления tyramide 9 по флуоресценции.
3. Сигнализации Флюрисцентная достигается за счет использования Tyramide Усиление сигнала (TSA) системы 9. Во время этого процесса стрептавидин-пероксидаза хрена сопряженные приложить к биотинилированными шпилек и активировать связывания флуоресцентных tyramides в непосредственной близости, создавая сильно люминесцентные сайтов.
e_content "> Применение методики к экспериментальной инсульта показано на рисунке 2. Рисунок флуоресценции 2 представлены образы активных фагоцитов клиринговых гибель клеток в головном мозге крыс 48 ч после начала постоянного фокальной ишемии мозга. Клетки помечены на ТОРО VACC зонды, как описано. Зонды визуализировать гигантские фаголизосомах 10 с ДНКазы II брейков (зеленая флуоресценция), маркировка фагоциты, которые активно поглощают и переваривают клеточные трупы 7. Одновременное совместное окрашивание DAPI этикетки хроматин из фагоцитов и из охвативших клеток внутри фагоцитов. накладки VACC ТОРО и сигналов DAPI облегчения идентификации и морфологический анализ активных фагоцитов. Для более четкого представления, образы дополняются диаграммами событий, показанных.JPG "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1 Обнаружение фагоцитарной оформления в срезах мозга по ligatable зондов. Принцип метода.
Рисунок 2 Экспериментальный ход 48 часа после ишемии начала:. Фагоцитарная оформление клеточной гибели Два примера фагоцитарной оформления.. Ligatable VACC ТОРО зонд - зеленая флуоресценция. Ядерная пятно ДАПИ - синий флуоресценции. Схемы событий, представленных в образах (правая колонка) показать ядра фагоцитов и pycnotic охвачен дополнительные ядра на разных стадиях пищеварения. Шкала бар - 15 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео мы покажем, в формате разделе ткани, как маркировать активные фагоциты, которые ясно гибель клеток в фокальной ишемии мозга. Представленная методика является первым подходом, который специально этикетки только те ячейки, регулирования отходов, которые охватили и активно переваривать клеточные трупы. Это делает выгодным в отношении других существующих методов маркировки фагоцитирующих клеток, которые не имеют такой возможности.
Метод использует общую и селективную основе ДНК маркер фагоцитарной активности - двухцепочечной, с тупыми концами перерывы 5'OH ДНК, произведенные в фаголизосомах клеток по обращению с отходами в процессе переваривания охвативших ядер. Этот конкретный маркировка только активных фагоцитов позволяет точную оценку интенсивности и эффективности фагоцитарной реакции при ишемическом мозге.
Методика является надежной и хорошо работает, если все шаги будут, как описано. Протеиназы К digestiна этапе особенно важно для сильного и воспроизводимым окрашивания. Избытком на этой стадии приводит к потере ДНК из секции и может уменьшить или даже устранить сигнал. Другой критической точкой является использование высокоактивного подготовку коровьей оспы топоизомеразы фермента. Ограничением метода является то, что он не был оптимизирован для использования с свежих замороженных срезов.
Подход имеет широкое применение в исследованиях апоптоза и может быть расширена на другие ткани и не зависящим ишемической мозга. Это особенно удобно при использовании для визуализации фагоцитарных реакций в тканях и органах, состоящих из нескольких типов клеток с различными участвующих клеток удаления отходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом R01NS062842 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальных Институтов Здоровья (ВСД) и грантами R21 NS064403 из Национального института неврологических расстройств и инсульта, Национальных Институтов Здоровья через ARRA (ВСД) и R21 EB006301 Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии, Национальные институты здравоохранения (ВСД).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
