Summary
Se presenta una nueva técnica de fluorescencia para selectivo etiquetado in situ de las células fagocitarias activas, que claro off cadáveres de células en el accidente cerebrovascular. El enfoque es importante para evaluar la reacción del cerebro a la isquemia debido a que sólo una pequeña proporción de los fagocitos presentes en el cerebro isquémico participar en el aclaramiento de la muerte celular.
Abstract
Se describe un nuevo método histoquímico para la visualización del despacho fagocítica en la isquemia cerebral focal. El enfoque permite el estudio de la eliminación de las células muertas en el accidente cerebrovascular por los fagocitos de gestión de residuos de cualquier linaje celular. Aunque numerosas células de diferentes orígenes que son capaces de fagocitosis están presentes en el cerebro isquémico, sólo una parte de ellos engullir activamente y digerir cadáveres de células. La visualización selectiva, cuantificación y análisis de dicha gestión de residuos activa fagocítica son útiles en la evaluación de la respuesta cerebral a la isquemia. Despacho eficiente la muerte celular es importante para la recuperación de la lesión isquémica cerebral, ya que abre el camino para que los procesos de regeneración posteriores. La falta de limpieza de los cadáveres daría lugar a una reacción tóxica causada por el ADN no degradado y proteínas. El procedimiento descrito utiliza sondas fluorescentes ligadas selectivamente por una topoisomerasa viral a roturas en el ADN característicos producidos en todos los fagocitos durante la inmersióny la digestión de las células irreversiblemente dañado por la isquemia. El método es una nueva herramienta para la investigación de la reacción del cerebro a la lesión isquémica.
Introduction
El accidente cerebrovascular isquémico induce cambios profundos en el tejido cerebral afectado. Se inicia la muerte celular masiva, que conduce a la rápida activación de las células fagocíticas residentes de origen microglial. También pone en marcha la infiltración de cerebro isquémico por varios tipos de fagocitos profesionales derivadas de la sangre incluyendo neutrófilos, macrófagos, dendríticas, y mastocitos 1,2.
Todavía se debate si esta respuesta a la lesión isquémica desempeña un positivo o un papel negativo. Aunque la fagocitosis después del accidente cerebrovascular puede ser beneficioso, ya que borra las células muertas y suprime la inflamación, sino que también genera especies reactivas de oxígeno tóxicos que afectan la supervivencia neuronal y exacerbando el daño tisular 1-5.
Mientras que varios tipos de células fagocíticas infiltran cerebral isquémico, no todos ellos participan en la gestión de residuos por que envuelve los cuerpos celulares y despejando el camino para los procesos regenerativos 1-3. Este creates un requisito para la identificación selectiva de las células de gestión de residuos que llevan a cabo aclaramiento fagocítica de muerte celular en el accidente cerebrovascular. Cuando proyección de imagen tales células de gestión de residuos activos, también es importante responder a la cuestión de la eficiencia con que se degradan los cadáveres celulares envueltos. La degradación de la efectiva y completa del ADN de la célula que muere en la fagocitosis es esencial, ya que impide la auto-inmunización y la liberación de material nuclear patológica 6.
Aquí presentamos nuevas sondas que utilizan saltos de ADN específicas como marcadores de células fagocitarias activas. Estas interrupciones de la firma se producen exclusivamente durante la ruptura de núcleos envueltos dentro de las células de gestión de residuos funcionales. Por lo tanto las sondas marcadoras selectivamente sólo los fagocitos que engullen y digieren activamente cadáveres celulares. También permiten la observación de la intensidad y la finalización de la ruptura de ADN después de la inmersión. Las sondas son útiles en la evaluación de la intensidad y efficirencia del despacho fagocítica.
Las nuevas sondas se basan en un marcador no basado en proteína-y por lo tanto pueden ser particularmente ventajosa en los estudios de accidente cerebrovascular, donde extensa daño isquémico puede alterar la morfología celular o agotar marcadores a base de proteínas, especialmente dentro de la zona isquémica núcleo.
El principio de la técnica se presenta en la Figura 1. La figura muestra las sondas de oligonucleótidos en forma de horquilla-ligados por la enzima topoisomerasa de vaccinia (VACC TOPO) al ADN 5'OH termina generada por lisosomal ADNasa II durante la digestión de ADN 7.
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Protocol
El método es adecuado para, embebidos en parafina secciones de tejido fijadas con formaldehído. La técnica se demuestra aquí en su aplicación para el accidente cerebrovascular experimental en rata.
1. Componentes Preparación para tiramida amplificación de señal (TSA) Sistema
Aunque la mejora basada en la TSA se utiliza en la etapa final de etiquetado, la preparación para esta reacción puede tomar más de 1 hora. Por lo tanto es conveniente para hacer los reactivos TSA antes de iniciar el etiquetado.
- Hacer tiramida fluoróforo solución madre. Utilice el reactivo tiramida fluoróforo en viales individuales con el equipo de marcaje de la TSA. Añadir 300 l de DMSO al vial de reactivo tiramida. Solución Fluoróforo tiramida valores es estable durante al menos 3 meses cuando se almacenan a 4 ° C.
- Hacer tampón de lavado que contiene TNT: 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M de NaCl; 0,05% de Tween-20. Si es necesario 0,3% de Triton X-100 puede ser sustituido por el 0,05% de Tween-20. AlternatIvely PBS puede ser utilizado como tampón de lavado.
- Hacer TNB tampón de bloqueo que contenía: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M de NaCl; 0,5% reactivo de bloqueo (suministrada con el kit). Para disolver completamente el reactivo de bloqueo, se añade lentamente en pequeños incrementos para el buffer mientras se agita. Calentar esta solución gradualmente a 55 ° C con agitación continua. Esto puede tomar 30 a 60 min. La solución aparecerá lechoso. Llevar a temperatura ambiente antes de usar. Alícuota y almacenar a -20 ° C para su uso a largo plazo.
2. Preparación de Secciones
Utilice diapositivas montadas con 5 secciones micras de espesor cortadas a partir de tejidos fijados con formalina.
- Tratar secciones con xileno durante 15 min.
- Rehidratar las siguientes secciones: remojar en 96% EtOH 2x durante 5 minutos cada uno; remojo en 80% EtOH durante 5 min; lavar con agua 2 veces durante 5 minutos cada uno.
- Hacer la solución de trabajo proteinasa K mediante la dilución de la proteinasa K solución madre a 50 g / ml en PBS.
- Añadir proteinasaK solución de trabajo a las secciones. Incubar 15 minutos a 23 º C. Pueden necesitar ser ajustado en función del tamaño de las secciones y tipos de tejidos El volumen de la solución y el tiempo de digestión. Para una sección pequeña (por debajo de 5 mm de diámetro) 50 l de solución de proteinasa serían suficientes. Sección Para un tamaño medio (~ 10 mm de diámetro), añadir 100 l de solución de proteinasa K. Por muy grandes secciones del volumen de la solución que se puede expandir. En todos los casos, evite que overdigestion de secciones que conduce a la pérdida completa de la señal y destruye la morfología del tejido. Esto sucede a menudo si el tiempo de incubación supera los 25 min.
- Lávese las secciones de 2x agua destilada durante 5 minutos cada uno. Preparar la mezcla de etiquetado que contiene la sonda activa, mientras que las secciones están en el agua.
3. La tinción basada en TOPO VACC
- Prepare la solución de la sonda activa mediante la combinación de los siguientes:
Agua - 11.75 l
1 M de Tris-HCl, pH 7.4 a 1.25 μl
100 pmol de 12-base de suicidio voladizo oligonucleótido - 1 l
100 pmol de oligonucleótido adaptador - 1 l
50 pmol VACC TOPO - 10 l - Mezclar suavemente con la pipeta. Incubar a temperatura ambiente (23 ° C) durante 15 min para permitir la activación de la sonda.
- Tome secciones del tarro de lavado y aspirar el agua restante. A continuación, aplicar la solución de la sonda activo preparado en el paso 3.1 (25 l por ~ sección 10 x 10 mm).
- Cubreobjetos las secciones y se incuba durante 15 minutos a 23 º C. Dip se desliza en el agua para eliminar suavemente cubreobjetos. Lave en agua 3 veces durante 5 minutos cada uno.
4. TSA de señal de mejora
- Cubrir las secciones de tejido con tampón de bloqueo TNB preparado anteriormente e incubar los portaobjetos en una cámara humidificada durante 30 min a temperatura ambiente (23 ° C).
- Preparar una dilución 1:100 de conjugados de peroxidasa de rábano picante estreptavidina (SA-HRP) en TNB tampón de bloqueo. Aspirar TNBtampón de bloqueo y aplique la solución SA-HRP. Incubar los portaobjetos con SA-HRP durante 30 min a temperatura ambiente. Utilizar volumen de reactivo adecuado para cubrir la sección de tejido, generalmente de 100 l por sección.
- Lavar los portaobjetos 3x por cada 5 min en tampón de lavado TNT (o PBS) a temperatura ambiente.
- Prepare una dilución 1:50 de fluoróforo tiramida stock en 1x Amplificación Diluyente del kit. Pipetear la solución de trabajo tiramida fluoróforo en cada diapositiva. Utilice solución de trabajo suficiente para cubrir completamente la sección de tejido, generalmente de 100 l por sección. Haga solución de trabajo tiramida fluoróforo inmediatamente antes de cada etiqueta. La solución no puede ser reutilizado, por lo que descarta cualquier porción no utilizada de la misma después de la marcación.
- Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 3 a 10 min. Monitorear incremento de fluorescencia con un microscopio hasta que los primeros indicios de estructuras se pueden ver. Proceder rápidamente a lavarse paso.
- Lavar los portaobjetos 3x por cada 5 min en tampón de lavado TNT (o PBS) en sala de temperatura con agitación.
- Añadir la solución de antifading con DAPI y cubreobjetos. Observar bajo el microscopio de fluorescencia. Para visualizar DAPI y FITC fluorescencia utilizan un conjunto de filtros de paso de banda:
D490/40 excitación FITC, emisión de 520/10; DAPI D360/40 de excitación, emisión 460/20, o similar.
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Representative Results
El principio de la técnica para el etiquetado de los fagocitos de gestión de residuos activos se presenta en la Figura 1. El esquema demuestra que el producto de detección en tres pasos. La primera etapa comprende la activación de la sonda (Figura 1A); en el segundo paso la sonda activado se ligó a roturas en el ADN específicas en las secciones de tejido (Figura 1C); la tercera etapa incluye la amplificación de la señal fluorescente (Figura 1D). En una explicación más detallada, la detección es como sigue:
1. La activación de la sonda. Antes de la reacción de ligación VACC TOPO necesita ser unido covalentemente al extremo 3 'de la oligosonda. Durante la activación de la sonda VACC TOPO concede a los dúplex del adaptador de la horquilla y se unirá la cadena superior. El 12-base durante mucho tiempo parte y luego se separa de forma permanente, dejando VACC TOPO unido al extremo 3 'de la horquilla. Este oligonucleótido con la enzima ligada a su extremo 3 'puede etiquetar las pausas de tipo ADNasa II (Figura 1B). El voladizo 12-base y un oligo adaptador son necesarios debido a que el enzima no se corta una hebra más corto 8 y por lo tanto será incapaz de unirse a la sonda y activar su extremo 3 '.
2. Ligadura de la sonda. Horquillas biotinilados se ligan por VACC TOPO a 5'OH roturas en el ADN extremos romos generados por los fagocitos para digerir los núcleos de las células muertas. Las sondas unidas se visualizaron por fluorescencia utilizando mejora tiramida 9.
3. Señalización fluorescente se logra mediante el uso de amplificación de señal de tiramida sistema 9 (TSA). Durante este proceso de conjugados de peroxidasa de rábano-estreptavidina se adhieren a las horquillas con biotina y activar la unión de tyramides fluorescentes en las inmediaciones, la creación de sitios fuertemente fluorescentes.
e_content "> Aplicación de la técnica para el accidente cerebrovascular experimental se muestra en la Figura 2. Figura 2 presenta las imágenes de fluorescencia de las células fagocíticas activos de compensación muerte celular en cerebro de rata 48 horas después del inicio de la isquemia cerebral focal permanente. Las células se marcan por el TOPO VACC sondas según lo descrito. Las sondas visualizar fagolisosomas gigantescos 10 con ADNasa II rompe (fluorescencia verde), marcando los fagocitos que engullen y digieren activamente cadáveres celulares 7. co-tinción simultánea con DAPI etiquetas de la cromatina de los fagocitos y las células envueltos dentro de los fagocitos. El superposiciones de VACC señales DAPI TOPO y permiten una fácil identificación y el análisis morfológico de las células fagocitarias activas. Para una presentación más clara, las imágenes se complementan con diagramas de los eventos mostrados.jpg "width =" 500 "/>
Figura 1 Detección del despacho fagocítica en las secciones del cerebro por medio de sondas ligables:. Principio del método.
Figura 2 Experimental golpe de 48 horas después del inicio de la isquemia:. Despeje fagocítica de muerte celular Dos ejemplos de liquidación fagocítica.. Ligables sonda VACC TOPO - fluorescencia verde. Tinción nuclear DAPI - fluorescencia azul. Diagramas de los eventos que se presentan en las imágenes (columna derecha) muestran núcleos de los fagocitos y picnótico envolvieron núcleos adicionales en diversas etapas de la digestión. Barra de escala - 15 micras.
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Discussion
En este video se demuestra, en el formato de la sección de tejido, como etiquetar los fagocitos activos que clara la muerte celular en la isquemia cerebral focal. La técnica presentada es el primer enfoque que marca específicamente sólo las células de gestión de residuos, que han afectado y digerir activamente cadáveres celulares. Esto hace que sea ventajoso con respecto a otros métodos existentes para el etiquetado de las células fagocíticas, que no tienen esta capacidad.
El método utiliza una base de ADN marcador general y selectiva de la actividad fagocítica - de doble cadena, blunt roturas en el ADN 5'OH terminados producidos en fagolisosomas de las células de gestión de residuos durante la digestión de los núcleos envueltos. Este etiquetado específico de las células fagocíticas sólo activos permite la evaluación precisa de la intensidad y la eficacia de la reacción fagocítica en el cerebro isquémico.
La técnica es robusta y funciona bien si se siguen todos los pasos como se describe. El Digesti proteinasa Ken el paso es particularmente importante para la tinción fuerte y reproducible. Overdigestion en este paso conduce a la pérdida de ADN de la sección y podría disminuir o incluso eliminar la señal. El otro punto crítico es el uso de una preparación altamente activo de la enzima topoisomerasa de vaccinia. Una limitación de la técnica es que no se ha optimizado para su uso con las secciones congeladas frescas.
El enfoque tiene amplia aplicabilidad a los estudios de la apoptosis y es ampliable a otros tejidos y condiciones más allá de cerebro isquémico. Es particularmente conveniente cuando se utiliza para la visualización de reacciones fagocíticas en los tejidos y órganos compuestos de múltiples tipos de células con diversas células de gestión de residuos que participan.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por conceder R01NS062842 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, Institutos Nacionales de Salud (VVD) y por subvenciones R21 NS064403 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, Institutos Nacionales de Salud a través de ARRA (VVD) y R21 Instituto Nacional EB006301 de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, Institutos Nacionales de Salud (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
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