Summary
私たちは、積極的な食細胞のin situラベリングにおける選択のための新しい蛍光技術を提示し、その明確なストローク中の細胞死体オフ。虚血性脳内に存在する食細胞のわずかな割合は、細胞死の隙間に参加しているための方法は、虚血に対する脳の反応を評価するために重要である。
Abstract
我々は、局所性脳虚血に貪食クリアランスの可視化のための新たな組織化学的なアプローチについて説明します。アプローチは、任意の細胞系譜の廃棄物管理の食細胞による行程の死細胞の除去の研究を可能にします。貪食することができる多数の異なる起源の細胞が虚血性脳中に存在するが、それらの一部だけが積極的に飲み込みおよび細胞死体を消化する。このような積極的な食細胞の廃棄物管理の選択的可視化、定量化、および分析は、虚血に対する脳の反応を評価するのに役立ちます。それは、その後の再生プロセスのために道を開くように効率的な細胞死のクリアランスは、虚血性損傷から脳の回復のために重要である。死体をきれいにする失敗は非分解のDNAやタンパク質によって引き起こされる毒性反応をもたらすであろう。説明する手順は、選択的に貪食中にすべての食細胞で生産特性DNA切断にウイルストポイソメラーゼによって連結させた蛍光プローブを使用していますそして不可逆的に虚血により損傷を受けた細胞を消化。この方法は、虚血性傷害に対する脳の反応の調査のための新しいツールです。
Introduction
虚血性脳卒中は、影響を受けた脳組織の大きな変化を誘導する。これは、ミクログリア由来の常在食細胞の急速な活性化をもたらす大量の細胞死を開始する。また、好中球、マクロファージ、樹状、および肥満細胞1,2を含む血液由来のプロ食細胞の様々なタイプによる虚血性脳の浸潤をオフに設定します。
それはまだ、虚血性傷害に対するこの応答は、正または負の役割を果たしているかどうか議論されている。それは死んだ細胞をクリアし、炎症を抑制するため、脳卒中後の貪食が有益であることができますが、それはまた、ニューロンの生存に影響を与えるし、組織損傷1-5を悪化させる有毒な活性酸素種を生成します。
食細胞にはいくつかの種類が虚血性脳を浸透しながら、それらのすべては、細胞の死体を巻き込むと再生プロセス1-3の道をクリアすることによって、廃棄物管理に参加しています。このCR脳卒中における細胞死の貪食クリアランスを行う廃棄物管理の細胞の選択的同定のための要件をeates。このような積極的な廃棄物管理の細胞を撮像する場合、それは彼らが巻き込ま細胞死体を劣化させる方法を効率的に質問に答えることも重要です。それは、自己免疫の病理学および核物質6のリリースを防止するので、食作用で死んで細胞のDNAの効果的かつ完全な分解が不可欠である。
ここでは、アクティブな食細胞のマーカーとして、特定のDNA切断を使用する新しいプローブを提示する。これらの署名ブレークは、排他的な機能の廃棄物管理の細胞内で包ま核の崩壊の間に生産されています。したがってプローブは、選択的に巻き込むだけ食細胞を標識し、積極的に細胞の死体を消化。彼らはまた、貪食後の強度とDNAの分解が完了したことを観察することが可能になる。プローブは、強度とefficiの評価に役立つ貪食クリアランスency。
新しいプローブは、非タンパク質ベースのマーカーに依存しているため、広範な虚血性損傷が細胞形態を混乱させるか、特にコア虚血性ゾーン内に、タンパク質ベースのマーカーを枯渇することができ、脳卒中の研究に特に有利であり得る。
技術の原理を図1に示す。図は、酵素、ワクシニアトポイソメラーゼ（VACC TOPO）によって連結し、ヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブを示している 5'OH DNAにDNA消化7時のリソソームのDNase IIによって生成され終了します。
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Protocol
この方法は、ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋組織切片に適しています。技術は、ラットにおける実験的ストロークにここにそのアプリケーションで実証されている。
1。チラミドシグナル増幅（TSA）システムのコンポーネントの準備
TSA系増強がこの反応のために調製し、標識の最終段階で使用されているが1時間以上行うことができる。したがって、標識化を開始する前に、TSA試薬を作るために便利である。
- 蛍光団のチラ原液を作る。 TSAラベリングキットと個々のバイアルで供給される蛍光体チラミド試薬を使用してください。チラミド試薬バイアルに300μlのDMSOを追加します。 4℃で保存した場合にフルオロフォアチラミドストック溶液は、少なくとも3ヶ月間安定である
- TNTを含む洗浄緩衝液作る：0.1 Mトリス - 塩酸、pH 7.5; 0.15MのNaCl; 0.05％のTween-20。必要な場合、0.3％トリトンX-100、0.05％のTween-20の代わりに用いることができる。 Alternatively PBS洗浄緩衝液として使用してもよい。
- 作るTNB含むバッファー、ブロッキング：0.1 Mトリス塩酸、pH 7.5; 0.15MのNaCl; 0.5％ブロッキング試薬（キットに付属）。攪拌しながら完全にブロッキング試薬を溶解するために、徐々にバッファに少しずつ追加します。連続的に攪拌しながら55℃に徐々にこのソリューションを加熱する。これは30〜60分かかる場合があります。解決策は、乳白色表示されます。使用前に室温に戻します。長期使用のために-20℃で一定分量や店舗。
セクションの2。準備
ホルマリン固定組織から切り出したマウント5ミクロン厚の切片をスライドを使用してください。
- 15分間キシレンでセクションを扱う。
- 次のようにセクションを再水：5分毎に96％エタノール2倍につかる。 5分、80％エタノールに浸し; 5分間ずつの水2Xで洗浄する。
- PBS中50μg/ mlのにプロテイナーゼKストック溶液を希釈することにより、プロテアーゼKワーキング溶液を作る。
- プロテイナーゼを追加セクションへの使用液のK。 23℃で15分間インキュベート溶液の体積と消化の時間は、切片および組織型のサイズに応じて調整する必要があるかもしれない。小さな（直径5mm以下の）セクションのプロテイナーゼ溶液50μlで十分です。平均サイズ（直径〜10ミリメートル）のセクションでは、プロテアーゼK溶液100μlを加える。非常に大規模なセクションの場合、溶液の体積をスケールアップすることができます。全ての場合において、信号の損失を完了するのにつながり、組織形態を破壊する部分の過剰消化しないように注意してください。インキュベーション時間は25分を超えた場合、これが頻繁に発生。
- 5分ごとに蒸留水を2倍のセクションを洗ってください。のセクションでは、水中にいる間、アクティブプローブを含む標識ミックスを準備します。
3。VACC TOPOベースの染色
- 次を組み合わせることにより、アクティブ·プローブ·ソリューションを準備します。
水 - 11.75μL
1 Mトリス-HCl、pHが7.4から1.25μL
12塩基オーバーハング自殺オリゴヌクレオチド100ピコモル - 1μL
アダプターオリゴヌクレオチドの100ピコモル - 1μL
50 pmolのVACC TOPO - 10μL - ピペッティングにより穏やかに混合します。プローブの活性化を可能にするために15分間室温（23℃）でインキュベートする。
- 洗浄瓶からのセクションを取り、残りの水を吸引する。次に、ステップ3.1（〜10×10ミリメートルのセクションごとに25μL）で調製したアクティブ·プローブ·ソリューションを適用します。
- セクションをカバースリップし、23℃で15分間インキュベートディップは優しくカバースリップを除去するために水にスライドする。 5分間ずつ水3Xで洗う。
4。TSA信号強調
- TNBは、先に調製し、室温（23℃）で30分間加湿チャンバー内でスライドをインキュベートし、ブロッキング緩衝液とともに組織切片を覆う。
- TNBはブロッキング緩衝液中のストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（SA-HRP）の1:100希釈液を準備します。吸引物TNBSA-HRP溶液を緩衝して適用ブロッキング。室温で30分間SA-HRPでスライドをインキュベートする。一般的には組織切片、セクションごとに100μlをカバーするために十分な試薬量を使用してください。
- 洗浄は、室温でのTNT洗浄バッファー（またはPBS）中で5分間ずつ3回スライドさせる。
- キットから1X増幅希釈液中の蛍光団のチラミドストックの1:50希釈を準備します。各スライドの上に蛍光体チラ作業溶液をピペット。完全に一般的に組織切片、セクションごとに100μlをカバーするのに十分な実用的なソリューションを使用してください。すぐに各ラベルの前にフルオロフォアチラ作業溶液を作る。解決策は再利用なので、標識した後、それの未使用部分を破棄することはできません。
- 3〜10分間室温でスライドをインキュベートする。構造体の最初のヒントを見ることができるまで、顕微鏡下で蛍光の増加をモニターする。すぐにステップを洗浄するために進んでください。
- 洗浄は室温tのTNT洗浄緩衝液（またはPBS）中で5分間ずつ3回スライドさせる攪拌しながらemperature。
- DAPIおよびカバーガラスで褪色防止ソリューションを追加します。蛍光顕微鏡で観察します。 DAPI及びFITC蛍光を可視化するために使用するバンドパスフィルターセット：
FITC励起D490/40、発光10分の520; DAPI励起D360/40、放射20分の460、または類似。
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Representative Results
活性な廃棄物管理の食細胞を標識するための技術の原理を図1に示されている。概略は3段階で検出進むことを示している。第一工程は、プローブの活性化（ 図1A）を包含し;第二段階で活性化プローブは、組織切片（ 図1C）内の特定のDNA切断に連結している。第三段階は、蛍光シグナル増幅（ 図1D）を含む。以下のようにより詳細な説明では、検出は進む。
1。プローブの活性化 。ライゲーション反応VACC TOPOに先立ち、共有結合オリゴプローブの3 '末端に連結される必要がある。プローブの活性化の際にVACC TOPOは、ヘアピンアダプター二重と切断する上側の鎖に付着する。 12塩基長の部分は、次いで、恒久的にヘアピンの3 '末端に結合VACC TOPOを残して、分離する。その3 '末端に結合した酵素と、このオリゴヌクレオチドは、DNA分解酵素II型の切断（ 図1B）を標識することができます。酵素は短い方の鎖8をカットされませんので、プローブに接続し、その3 '末端を活性化することができなくなりますので、12塩基のオーバーハングとアダプターオリゴが必要です。
2。連結をプローブビオチン化ヘアピンは、死細胞の核を消化する食細胞で生成された平滑末端DNA破壊を5'OHするVACC TOPOによって連結される。取り付けられたプローブは、チラミド増強9を用いて蛍光によって可視化される。
（3）蛍光シグナルを、チラミドシグナル増幅（TSA）系9を用いることにより達成される。このプロセスの間に、ストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートは、ビオチン化ヘアピンに接続し、強く蛍光サイトの作成、近接して蛍光チラミドの結合を有効にしてください。
e_content ">実験的脳卒中に対する技術の応用は、 図2に示されている。永久的局所性脳虚血開始後のラット脳の48時間における細胞死をクリア活性食細胞の2プレゼント蛍光画像を図 。細胞はVACC TOPOによって標識される記載されたプローブ。プローブは、積極的に細胞の死体7を巻き込むとダイジェスト食細胞をマーク、DNアーゼII改（緑色蛍光）と巨大なファゴリソソーム10を可視化する。DAPIで共染色同時の食細胞の食細胞内部に飲み込まれ、細胞のクロマチンにラベルを付けます。ザ· VACC TOPOおよびDAPI信号のオーバーレイは、簡単に識別し、積極的な貪食細胞の形態学的分析を可能にする。明確にプレゼンテーションのために、画像が示されたイベントのダイアグラムによって補完されています。JPG "幅=" 500 "/>
図1の連結可能なプローブによる脳切片における貪食クリアランスの検出：法の原理。
図2虚血発症後の実験的脳卒中の48時間：細胞死の貪食クリアランス貪食クリアランスの2つの例。連結可能VACC TOPOプローブ - 緑色蛍光。核染色のDAPI - 青色蛍光。画像で提示するイベント（右列）の図は、食細胞とpycnoticの核は消化の様々な段階で余分な核を巻き込んだ示しています。スケールバー - 15μmである。
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Discussion
このビデオでは、局所性脳虚血のどの明細胞死アクティブ食細胞を標識する方法を、組織切片の形式で、示しています。提示された技術は、具体的に飲み込まれ、積極的に細胞の死体を消化しているだけの廃棄物管理の細胞を標識する最初のアプローチである。これは、この機能を持っていない貪食細胞の標識化のための他の既存の方法に関して、それが有利になります。
二本鎖包ま核の消化中に廃棄物管理細胞のファゴリソソームで生産終了5'OH DNA破壊を鈍ら - メソッド食作用活性の一般的かつ選択的なDNAベースのマーカーを使用しています。のみアクティブ食細胞は、この特異的な標識は、虚血性脳内の貪食反応の強さと効率の正確な評価を可能にします。
技術が堅牢であると説明されているようにすべての手順に従えばうまく動作します。プロテイナーゼK digesti段差に強く、再現性のある染色のために特に重要である。この段階で過剰消化セクションからのDNAの損失につながると減少したり、信号を排除する可能性があります。他の重要な点は、ワクシニアトポイソメラーゼ酵素の活性の高い準備を使用することです。技術の制限は、それが新鮮凍結切片での使用に最適化されていなかったということです。
アプローチは、アポトーシスの研究への幅広い適用性を有しており、虚血性脳を超えて他の組織との条件まで拡張可能です。多様な参加廃棄物管理の細胞との複数の細胞型からなる組織および器官における食細胞の反応の可視化のために使用される場合に特に便利である。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、国立神経疾患·脳卒中研究所、国立衛生研究所（VVD）と神経疾患や脳卒中の国立研究所からの補助金、R21 NS064403によって、ARRA（VVD）とR21を介して国立衛生研究所からの助成金R01NS062842によってサポートされていました生物医学イメージングとバイオエンジニアリングEB006301国立研究所、国立衛生研究所（VVD）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
