Summary
نقدم تقنية جديدة لمضان انتقائية وضع العلامات الوضع الطبيعي للخلايا البلعمية النشطة في، والتي واضح من الجثث خلية في المخ. النهج المهم لتقييم رد فعل الدماغ لنقص التروية لأن نسبة صغيرة فقط من البالعات موجودة في الدماغ الدماغية المشاركة في تطهير موت الخلية.
Abstract
وصفنا نهج النسيجية جديدة لإزالة التصور البلعمية في التنسيق نقص تروية الدماغ. يسمح النهج دراسة القضاء على الخلايا الميتة في السكتة الدماغية عن طريق البالعات إدارة النفايات في أي النسب الخلوية. على الرغم من أن العديد من الخلايا من أصول مختلفة قادرة على البلعمة موجودة في الدماغ الدماغية، سوى جزء منهم تبتلع بنشاط وهضم الجثث الخلية. تصور انتقائي، الكمي وتحليل مثل هذه النشطة لإدارة النفايات أكلة مفيدة في تقييم استجابة الدماغ لنقص التروية. كفاءة التخليص موت الخلايا مهم للانتعاش الدماغ من الإصابة الدماغية، كما أنه يفتح الطريق أمام عمليات التجدد اللاحقة. ان فشل لتنظيف الجثث يؤدي إلى رد فعل السامة الناجمة عن الحمض النووي غير المتدهورة والبروتينات. يستخدم الإجراء الموضح تحقيقات الفلورسنت ligated بشكل انتقائي من قبل topoisomerase الفيروسي إلى DNA فواصل مميزة المنتجة في كل البالعات أثناء الغمروالهضم من الخلايا التالفة بشكل لا رجعة فيه عن نقص التروية. الأسلوب هو أداة جديدة للتحقيق في رد فعل الدماغ إلى الإصابة الدماغية.
Introduction
السكتة الدماغية يؤدي الى تغييرات عميقة في نسيج الدماغ المتضررة. فإنه يبدأ موت الخلايا الضخمة، الأمر الذي يؤدي إلى تنشيط الخلايا البلعمية السريع للسكان من أصل دبقية. فإنه يضع أيضا قبالة تسلل الدماغ الدماغية عن طريق أنواع مختلفة من البالعات المهنية المشتقة من الدم بما في ذلك العدلات، الضامة، الجذعية، والخلايا البدينة 1،2.
لا تزال تناقش ما إذا كان هذا ردا على الإصابة الدماغية تلعب دورا إيجابيا أو سلبيا. على الرغم من أن البلعمة التالية السكتة الدماغية يمكن أن تكون مفيدة لأنه يزيل الخلايا الميتة ويقمع التهاب، كما أنها تولد أنواع الاكسجين التفاعلية السامة التي تؤثر على بقاء الخلايا العصبية وتفاقم تلف الأنسجة 1-5.
بينما عدة أنواع من الخلايا البلعمية التسلل الدماغ الدماغية، وليس كل منهم المشاركة في إدارة النفايات التي تجتاح الجثث الخلية ويمهد الطريق لعمليات التجدد 1-3. هذا كرeates شرطا لتحديد الانتقائي للخلايا لإدارة النفايات التي تقوم التخليص أكلة من موت الخلايا في المخ. عند التصوير مثل هذه الخلايا النشطة لإدارة النفايات، من المهم أيضا للرد على مسألة مدى كفاءة أنها تتحلل الجثث خلية غارقة. تدهور فعالة وكاملة من الحمض النووي للخلية الموت في البلعمة أمر ضروري لأنه يمنع التحصين الذاتي والإفراج عن المواد النووية المرضية 6.
هنا نقدم تحقيقات جديدة أن استخدام فواصل الحمض النووي محددة كعلامات الخلايا البلعمية نشطة. ويتم إنتاج هذه فواصل التوقيع حصرا أثناء انهيار نوى اجتاحت داخل الخلايا إدارة النفايات وظيفية. لذا تحقيقات تسمية انتقائي فقط تلك التي تبتلع البالعات وهضم بنشاط الجثث الخلوية. كما أنها تسمح بمراقبة كثافة والانتهاء من انهيار الحمض النووي بعد الابتلاع. تحقيقات مفيدة في تقييم شدة وefficiency التخليص البلعمية.
تحقيقات جديدة تعتمد على علامة غير القائمة على البروتين، وبالتالي يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص في دراسات السكتة الدماغية، حيث يمكن للأضرار واسعة النطاق الدماغية تعطيل مورفولوجيا الخلوية أو تستنفد علامات القائم على البروتين، وخصوصا داخل المنطقة الدماغية الأساسية.
ويرد مبدأ هذه التقنية في الشكل 1. ويوضح الشكل تحقيقات نيوكليوتيدات دقيقة على شكل دبوس ligated قبل topoisomerase انزيم اللقاحية (VACC TOPO) ل5'OH الحمض النووي ينتهي إنشاؤها بواسطة الليزوزومية الدناز الثاني خلال الحمض النووي الهضم 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذه الطريقة مناسبة لالثابتة والفورمالديهايد، جزءا لا يتجزأ من البارافين أقسام الأنسجة. ويتجلى الأسلوب هنا في تطبيقه على السكتة الدماغية التجريبية في الفئران.
1. إعداد مكونات Tyramide إشارة التضخيم (TSA) نظام
على الرغم من أن يتم استخدام أساس تعزيز TSA في المرحلة النهائية من وضع العلامات، والتحضير لهذا التفاعل يمكن أن تأخذ أكثر من 1 ساعة. ولأنها مريحة لجعل الكواشف TSA قبل البدء في وضع العلامات.
- جعل fluorophore tyramide محلول المخزون. استخدام كاشف fluorophore tyramide المتوفرة في قارورة الفردية مع وضع العلامات عدة TSA. إضافة 300 ميكرولتر DMSO إلى قارورة tyramide كاشف. الحل Fluorophore الأسهم tyramide مستقرة لمدة 3 أشهر على الأقل عند تخزينها في 4 درجات مئوية.
- جعل غسل العازلة التي تحتوي على مادة تي ان تي: 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5؛ 0.15 M كلوريد الصوديوم؛ 0.05٪ توين 20. إذا لزم الأمر 0.3٪ تريتون X-100 يمكن أن تكون بديلا عن 0.05٪ في توين-20. Alternatively PBS يمكن استخدامها في غسل العازلة.
- جعل TNB حظر العازلة التي تحتوي على: 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5؛ 0.15 M كلوريد الصوديوم؛ 0.5٪ حجب الكاشف (مرفق مع عدة). لتذوب تماما كاشف حظر، ببطء إضافته بزيادات صغيرة إلى المخزن المؤقت مع التحريك. تسخين هذا الحل تدريجيا إلى 55 درجة مئوية مع التحريك المستمر. هذا يمكن أن يستغرق 30-60 دقيقة. فإن الحل يبدو حليبي. تقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدام. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها على المدى الطويل.
2. إعداد أقسام
استخدام الشرائح مع شنت 5 أقسام ميكرون سميكة قطع من الأنسجة الثابتة الفورمالين.
- علاج المقاطع مع الزيلين لمدة 15 دقيقة.
- ترطيب أقسام على النحو التالي: 96٪ نقع في ETOH 2X لمدة 5 دقائق لكل منهما؛ نقع في 80٪ ETOH لمدة 5 دقائق؛ غسل 2X مع الماء لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- جعل بروتين K الحل عن طريق تمييع العمل بروتين K الحل الأسهم إلى 50 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني.
- إضافة بروتينK تعمل على حل أقسام. احتضان 15 دقيقة عند 23 درجة مئوية. قد تحتاج إلى حجم من الحل والوقت الهضم إلى أن يتم ضبط اعتمادا على حجم من أقسام وأنواع الأنسجة. لقسم صغير (أقل من 5 مم في القطر) 50 ميكرولتر من محلول بروتين ستكون كافية. قسم لمتوسط حجم (~ 10 ملم في القطر)، إضافة 100 ميكرولتر من محلول بروتين كاف. يمكن لقطاعات واسعة جدا يمكن تحجيمها حجم الحل المباراة. في جميع الحالات الحرص على منع overdigestion الأقسام مما يؤدي إلى استكمال فقدان الإشارة ويدمر الأنسجة التشكل. هذا يحدث في كثير من الأحيان إذا كان الوقت الحضانة يتجاوز 25 دقيقة.
- غسل المقاطع في المقطر 2X الماء لمدة 5 دقائق لكل منهما. تحضير مزيج وضع العلامات التي تحتوي على أقسام التحقيق نشطة بينما هي في الماء.
3. تلطيخ مقرها TOPO-VACC
- إعداد الحل التحقيق النشط من خلال الجمع بين ما يلي:
الماء - 11.75 ميكرولتر
1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7،4 حتي 1،25 μل
100 بمول من 12 قاعدة نيوكليوتيدات دقيقة عبء الانتحار - 1 ميكرولتر
100 بمول من محول نيوكليوتيدات دقيقة - 1 ميكرولتر
50 بمول VACC TOPO - 10 ميكرولتر - المزيج بلطف من قبل pipetting. يحضن في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة للسماح لتفعيل التحقيق.
- تأخذ مقاطع من جرة غسيل ونضح المياه المتبقية. ثم تطبيق الحل التحقيق النشطة التي أعدت في الخطوة 3.1 (25 ميكرولتر في ~ 10 × 10 مم الباب).
- ساترة الأقسام واحتضان لمدة 15 دقيقة في 23 درجة مئوية. تراجع الشرائح في الماء لإزالة بلطف coverslips. غسل 3X في الماء لمدة 5 دقائق لكل منهما.
4. TSA تعزيز الإشارات
- تغطية أقسام الأنسجة مع TNB عرقلة العازلة أعدت في وقت سابق واحتضان الشرائح في غرفة ترطيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية).
- إعداد 1:100 التخفيف من تقارن streptavidin الفجل البيروكسيداز-(SA-HRP) في TNB حظر العازلة. نضح TNBحجب العازلة وتطبيق حل SA-HRP. احتضان الشرائح مع SA-HRP لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام حجم كاشف كافية لتغطية قسم الأنسجة، وعموما 100 ميكرولتر لكل قسم.
- تغسل الشرائح 3X لمدة 5 دقائق في كل من غسل العازلة TNT (أو PBS) في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 1:50 التخفيف من fluorophore الأسهم tyramide في 1X التضخيم مخفف من عدة. ماصة الحل تعمل fluorophore tyramide على كل شريحة. استخدام حل العاملة ما يكفي لتغطية كامل قسم الأنسجة، وعموما 100 ميكرولتر لكل قسم. جعل الحل تعمل fluorophore tyramide فورا قبل كل وضع العلامات. الحل لا يمكن إعادة استخدامها، لذلك تجاهل أي الجزء غير المستخدم من أنه بعد وضع العلامات.
- احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 10 دقيقة. رصد زيادة مضان تحت المجهر حتى يمكن رؤية تلميحات الأول من الهياكل. المضي قدما بسرعة لغسل الخطوة.
- تغسل الشرائح 3X لمدة 5 دقائق في كل من غسل العازلة TNT (أو PBS) في غرفة رemperature مع الانفعالات.
- إضافة الحل antifading مع دابي وساترة. مراقبة تحت المجهر مضان. لتصور دابي ومضان FITC استخدام عامل تصفية مجموعة الفرقة تمرير:
D490/40 FITC الإثارة، وانبعاث 520/10؛ دابي الإثارة D360/40، انبعاث 460/20، أو ما شابه ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد مبدأ هذه التقنية لوصفها البالعات نشط لإدارة النفايات في الشكل 1. التخطيطي يوضح أن حصيلة الكشف في ثلاث خطوات. الخطوة الأولى تشمل تفعيل التحقيق (الشكل 1A)؛ في الخطوة الثانية هو ligated التحقيق المنشط لفواصل الحمض النووي محددة في أقسام الأنسجة (الشكل 1C)؛ وتشمل الخطوة الثالثة الفلورسنت إشارة التضخيم (الشكل 1D). في شرح أكثر تفصيلا، كشف يذهب على النحو التالي:
1. تفعيل التحقيق. قبل رد الفعل ربط VACC TOPO يحتاج إلى أن تكون مرتبطة تساهميا إلى 3 'نهاية oligoprobe. خلال تفعيل التحقيق تعلق VACC TOPO إلى الوجهين دبوس محول ويشق حبلا العليا. للدامت قاعدة 12 جزء ثم يفصل بشكل دائم، وترك VACC TOPO تعلق على 3 'نهاية القاسي. هذا قليل النوكليوتيد مع انزيم مرتبط في 'نهاية 3 يمكن تسمية الدناز الثاني فواصل نوع (الشكل 1B). يطلب من عبء 12 قاعدة وبنسبة ضئيلة محول لأن الانزيم لا تقطع حبلا أقصر 8، وبالتالي لن تكون قادرة على نعلق على التحقيق وتنشيط لها 'نهاية 3.
2. دقق ربط. و تربط دبابيس الشعر البيروكسيديز بواسطة VACC TOPO ل5'OH فواصل الحمض النووي العضوية حادة الناتجة عن هضم البالعات نوى الخلايا الميتة. وتصور تحقيقات التي توليها مضان باستخدام تعزيز tyramide 9.
3. ويتحقق الفلورسنت إشارات باستخدام Tyramide إشارة التضخيم (TSA) نظام 9. أثناء هذه العملية تقارن streptavidin الفجل البيروكسيداز-نعلق على دبابيس الشعر البيروكسيديز وتفعيل ملزم من tyramides الفلورسنت في منطقة قريبة، وخلق مواقع الفلورسنت بقوة.
ويرد e_content "> تطبيق هذه التقنية لالسكتة الدماغية التجريبية في الشكل 2 الشكل 2 يعرض الصور مضان من الخلايا البلعمية نشطة تطهير موت الخلايا في دماغ الفئران 48 ساعة بعد بدء دائمة نقص تروية الدماغ التنسيق. وصفت الخلايا التي TOPO VACC تحقيقات حد وصفه. تحقيقات تصور phagolysosomes العملاق 10 مع الدناز الثاني فواصل (مخضر)، بمناسبة البالعات التي تبتلع بنشاط وهضم الجثث الخلية 7. في وقت واحد شارك في تلطيخ دابي مع تسميات لونين من البالعات والخلايا اجتاحت داخل البالعات. و تراكب من VACC TOPO وإشارات دابي تسمح سهولة التعرف والتحليل الصرفي للخلايا البلعمية نشطة. لعرض أكثر وضوحا، وتستكمل الصور عن طريق الرسوم البيانية للأحداث هو مبين.jpg و"العرض =" 500 "/>
الرقم 1 الكشف عن إزالة البلعمية في أقسام الدماغ عن طريق تحقيقات ligatable: مبدأ هذه الطريقة.
الشكل 2 السكتة الدماغية التجريبية 48 ساعة بعد ظهور نقص التروية: إزالة أكلة من موت الخلايا وهناك مثالان التخليص البلعمية. Ligatable VACC TOPO جنة التحقيق - مخضر. وصمة عار النووية دابي - مضان الأزرق. تظهر الرسوم البيانية من الأحداث المعروضة في الصور (العمود الأيمن) نوى البالعات وpycnotic اجتاحت نوى إضافية في مراحل مختلفة من عملية الهضم. شريط النطاق - 15 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو علينا أن نظهر في شكل قسم الأنسجة، وكيفية تسمية البالعات النشطة التي موت الخلايا واضحة في التنسيق نقص تروية الدماغ. تقنية قدم هو النهج الأول التي تصف على وجه التحديد فقط تلك الخلايا إدارة النفايات التي اجتاحت وهضم بنشاط الجثث الخلوية. وهذا يجعل من المفيد فيما يتعلق بأساليب الأخرى القائمة لوضع العلامات الخلايا البلعمية، والتي لا تملك هذه القدرة.
يستخدم الأسلوب علامة المعتمدة على الحمض النووي عامة وانتقائية النشاط أكلة - الذين تقطعت بهم السبل المزدوج، بصراحة انتهت فواصل 5'OH الحمض النووي التي تنتج في الخلايا phagolysosomes إدارة النفايات خلال عملية الهضم من نوى غارقة. هذا وضع العلامات المحددة للخلايا البلعمية النشطة فقط يسمح تقييم دقيق لكثافة وكفاءة رد فعل أكلة في الدماغ الدماغية.
تقنية قوية ويعمل بشكل جيد إذا ما اتبعت جميع الخطوات كما هو موضح. وdigesti بروتين Kعلى الخطوة أهمية خاصة لتلطيخ قوية وقابلة للتكرار. Overdigestion في هذه الخطوة يؤدي إلى فقدان الحمض النووي من الباب، وربما تقليل أو حتى القضاء على الإشارة. النقطة الحرجة الآخر هو استخدام مستحضر نشطة للغاية للانزيم اللقاحية topoisomerase. وجود قيود على الأسلوب الذي لم يكن الأمثل للاستخدام مع أقسام الطازجة المجمدة.
النهج لديه تطبيق واسعة لدراسات الخلايا ويمكن توسيعها إلى الأنسجة وظروف أخرى خارجة عن الدماغ الدماغية. أنها مريحة وخاصة عندما تستخدم لرؤية ردود فعل أكلة في الأنسجة والأعضاء تتكون من أنواع الخلايا متعددة مع المشاركة الخلايا إدارة النفايات المتنوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل منحة R01NS062842 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي)، ومنح R21 NS064403 من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية، والمعاهد الوطنية للصحة من خلال الأذربيجانية (الليبرالي) وR21 المعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية EB006301 والهندسة الحيوية، والمعاهد الوطنية للصحة (الليبرالي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
