Summary
Vi presenterar en ny fluorescensteknik för selektiv in situ märkning av aktiva fagocytiska celler, vilket framgår av cell lik i stroke. Tillvägagångssättet är viktig för att bedöma hjärnans reaktion på ischemi, eftersom endast en liten del av fagocyter som finns i ischemisk hjärnan deltar i clearance av celldöd.
Abstract
Vi beskriver en ny histokemiskt metod för visualisering av fagocytiska clearance i fokal hjärnischemi. Ansatsen möjliggör studier av eliminering av döda celler i stroke med avfallshantering fagocyter av alla cellulära härstamning. Trots att många celler av olika ursprung som har förmåga att fagocytos är närvarande i ischemisk hjärna, endast en del av dem aktivt uppsluka och smälta cell lik. Den selektiva visualisering, kvantifiering och analys av sådan aktiv fagocytos avfallshantering är till hjälp för att bedöma hjärnans reaktion på ischemi. Effektiv celldöd clearance är viktigt för hjärnans återhämtning från ischemisk skada, eftersom det öppnar vägen för de efterföljande regenerativa processer. Misslyckandet med att rengöra liken skulle resultera i en toxisk reaktion som orsakas av icke-nedbrutet DNA och proteiner. Det beskrivna förfarandet använder fluorescerande prober selektivt ligerade av en viral topoisomeras till karakteristiska DNA-brott som produceras i alla fagocyter under omvälvningoch nedbrytning av celler oåterkalleligt skadas av ischemi. Metoden är ett nytt verktyg för att undersöka hjärnans reaktion på ischemisk skada.
Introduction
Ischemisk stroke inducerar djupgående förändringar i den drabbade hjärnvävnaden. Den initierar massiv celldöd, vilket leder till en snabb aktivering av inhemska fagocytiska celler av microglial ursprung. Den sätter också av infiltration av ischemisk hjärna genom olika typer av blodbaserade professionella fagocyter inklusive neutrofiler, makrofager, dendritiska, och mastceller 1,2.
Det är fortfarande debatteras huruvida detta svar på ischemisk skada spelar en positiv eller en negativ roll. Även fagocytos efter stroke kan vara fördelaktigt eftersom det rensar döda celler och dämpar inflammation, genererar det också giftiga reaktiva syreradikaler som påverkar neuronal överlevnad och förvärra vävnadsskada 1-5.
Medan flera typer av fagocyterande celler infiltrerar ischemisk hjärna, inte alla av dem deltar i avfallshantering genom att uppsluka cell lik och banar väg för regenerativa processer 1-3. Denna creates ett krav för selektiv identifiering av avfallshantering celler som utför fagocytiska clearance av celldöd i stroke. När avbildning sådana aktiva avfallshanterings celler, är det också viktigt att svara på frågan om hur effektivt de försämra de uppslukade cell lik. Den effektiva och fullständig nedbrytning av den döende cellens DNA i fagocytos är viktigt eftersom det förhindrar själv immunisering och frisläppandet av patologisk kärnmaterial 6.
Här presenterar vi nya sonder som använder specifika DNA-brott som markörer av aktiva fagocytceller. Dessa signatur raster uteslutande produceras under nedbrytning av uppslukade kärnor inuti funktionella avfallshantering celler. Därför sonderna selektivt märka endast de fagocyter som uppsluka och aktivt smälta cellulära lik. De tillåter också observera intensiteten och slutförandet av DNA-uppdelning efter omvälvning. Sonderna är användbara i utvärdering av intensiteten och efency av fagocytisk rensning.
De nya prober förlita sig på en icke-proteinbaserad markör och kan därför vara särskilt fördelaktig i studier av stroke, där omfattande ischemisk skada kan störa cellulär morfologi eller utarma proteinmarkörer, speciellt inuti kärnan ischemiska zonen.
Principen för tekniken presenteras i Figur 1. Figuren visar hårnålsformad oligonukleotidsonder ligerade genom enzymet vaccinia topoisomeras (VACC TOPO) till 5'OH DNA-ändar som genereras av lysosomal DNas II under DNA-digerering 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoden är lämplig för formaldehydfixerade, paraffininbäddade vävnadssnitt. Tekniken demonstreras här i dess tillämpning på experimentell stroke hos råtta.
1. Förbereda Komponenter för tyramide signalförstärkning (TSA) System
Även om TSA-baserade förstärkning används i slutskedet av märkning, förbereda för denna reaktion kan ta mer än 1 timme. Därför är det lämpligt att göra TSA reagenser innan märkningen.
- Se till fluoroforen tyramid förrådslösning. Använd fluoroforen tyramide reagens levereras i enskilda flaskor med TSA märkningssats. Lägg till 300 l DMSO till tyramide reagensflaskan. Fluoroforen tyramide stamlösning är stabil i minst 3 månader vid förvaring vid 4 ° C.
- Gör TNT tvättbuffert innehållande 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. Om det behövs 0,3% Triton X-100 kan användas i stället för 0,05% Tween-20. Alternativtivt PBS kan användas som tvättbuffert.
- Gör TNB blockeringsbuffert innehållande 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,5% blockeringsreagens (som levereras med satsen). För att fullständigt lösa upp den blockerande reagens, tillsätt långsamt den i små steg till bufferten under omrörning. Värm lösningen gradvis till 55 ° C med kontinuerlig omrörning. Detta kan ta från 30 till 60 min. Lösningen kommer att visas mjölkig. Ta till rumstemperatur innan den används. Fördela och förvara vid -20 ° C för långvarig användning.
2. Beredning av avsnitten
Använd bilder med monterade 5 ìm tjocka sektioner skurna från formalinfixerade vävnader.
- Behandla sektioner med xylen under 15 min.
- Rehydrera sektioner enligt följande: blöt i 96% EtOH 2x 5 min vardera; blöt i 80% EtOH under 5 min; tvätta med vatten 2 x för 5 min vardera.
- Gör proteinas K-arbetslösning genom späd Proteinas K-stamlösning till 50 pg / ml i PBS.
- Lägg ProteinasK arbetslösning till sektioner. Inkubera 15 minuter vid 23 ° C. Volymen av lösningen och tiden för matsmältningen kan behöva justeras beroende på storleken av sektioner och vävnadstyper. För en liten (under 5 mm i diameter) avsnitt 50 pl proteinas lösning skulle räcka. För en genomsnittlig storlek (~ 10 mm i diameter) sektionen, tillsätt 100 pl av proteinas K-lösning. För mycket stora sektioner volymen av lösningen kan skalas upp. I samtliga fall vara noga med att undvika overdigestion sektioner som leder till fullständig förlust av signal och förstör vävnad morfologi. Detta händer ofta om inkubationstid än 25 min.
- Tvätta sektioner i destillerat vatten 2 x för 5 min vardera. Förbered mixen märkning som innehåller aktiv sond medan sektioner är i vatten.
3. VACC TOPO baserade Färgning
- Förbered den aktiva sondlösning genom att kombinera följande:
Vatten - 11.75 xl
1 M Tris-HCl, pH 7,4 till 1,25 μl
100 pmol av 12-bas överhäng självmord oligonukleotid - 1 pl
100 pmol adapter oligonukleotid - 1 pl
50 pmol VACC TOPO - 10 | il - Blanda försiktigt genom att pipettera. Inkubera vid rumstemperatur (23 ° C) under 15 min för att medge prob-aktivering.
- Ta avsnitt från tvätt burk och aspirera återstående vatten. Applicera sedan den aktiva sondlösning som framställts i steg 3,1 (25 pl per ~ 10 x 10 mm-sektion).
- Täckglas sektionerna och inkubera under 15 min vid 23 ° C. Doppa glider i vattnet för att försiktigt ta bort täckglas. Tvätta i vatten 3 x 5 min vardera.
4. TSA Signal Enhancement
- Täck vävnadssnitt med TNB blockeringsbuffert beredd tidigare och inkubera objektglasen i en fuktkammare i 30 minuter vid rumstemperatur (23 ° C).
- Bered en 1:100 utspädning av streptavidin-pepparrotsperoxidas-konjugat (SA-HRP) i TNB blockeringsbuffert. Aspirera TNBblockerande buffert och applicera SA-HRP-lösning. Inkubera objektglasen med SA-HRP i 30 minuter vid rumstemperatur. Använd lämplig reagensvolym för att täcka vävnadssektionen, i allmänhet 100 pl per avsnitt.
- Tvätta diabilder 3x för 5 min vardera i TNT-tvättbuffert (eller PBS) vid rumstemperatur.
- Bered en 1:50 spädning av fluoroforen tyramide lager i 1x Amplification Diluent ur satsen. Pipet fluoroforen tyramide arbets lösningen på varje bild. Använd tillräckligt med fungerande lösning för att helt täcka vävnadssektionen, i allmänhet 100 pl per avsnitt. Gör fluoroforen tyramide arbetslösning omedelbart före varje märkning. Lösningen kan inte återanvändas, så kassera eventuell överbliven det efter märkning.
- Inkubera objektglasen vid rumstemperatur under 3 till 10 min. Övervaka fluorescensökning under mikroskop tills de första inslag av konstruktioner kan ses. Snabbt vidare till tvätta steg.
- Tvätta glider 3x i 5 minuter vardera i TNT tvättbuffert (eller PBS) vid rums temperatur omröring.
- Till antifading lösningen med DAPI och täckglas. Beakta under fluorescensmikroskop. Att visualisera DAPI och FITC fluorescens använda ett bandpassfilter set:
FITC excitation D490/40, emission 520/10; DAPI excitation D360/40, emission 460/20, eller liknande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Principen om tekniken för märkning aktiva avfallshanterings fagocyter presenteras i figur 1. Schemat visar att intäkterna upptäckt i tre steg. Det första steget omfattar sonden aktivering (figur 1 A); i det andra steget av den aktiverade sonden ligeras till specifika DNA-avbrott i vävnadssektionerna (figur 1C); det tredje steget innefattar fluorescerande signalförstärkning (figur 1D). I en mer detaljerad förklaring, går detektion enligt följande:
1. Probe aktivering. Före ligeringsreaktionen VACC TOPO måste kovalent bunden till 3 '-änden av oligoprobe. Under sond aktivering VACC TOPO fäster hårnålen-adaptern duplex och klyver den övre strängen. The 12-base-lång del därefter permanent separerar och lämnar VACC TOPO fäst till 3 '-änden av hårnålen. Denna oligonukleotid med enzymet kopplat till dess 3'-ände kan etikettera DNas II Typ raster (fig 1b). Den 12-bas överhäng och en adapter oligo krävs eftersom enzymet inte kommer att klippa en kortare sträng 8 och kommer därför inte att kunna ansluta till proben och aktivera sin 3 'ände.
2. Probe ligation. Biotinylerade hårnålar knyts ihop av VACC TOPO att 5'OH trubbiga ändar DNA-avbrott genereras av fagocyter smälta kärnor av döda celler. De bifogade prober visualiseras genom fluorescens med hjälp tyramide förbättring 9.
3. Fluorescerande signalering uppnås genom att använda tyramid Signal Amplification (TSA)-systemet 9. Under denna process streptavidin-pepparrots peroxidaskonjugat fäster biotinylerade hårnålar och aktivera bindning av fluorescerande tyramides i närområdet, skapar starkt fluorescerande platser.
e_content "> Tillämpning av tekniken för experimentell stroke visas i figur 2. Figur 2 presenterar fluorescensbilder av aktiva fagocytiska celler clearing celldöd i råtthjäma 48 h efter starten av permanent fokal hjärnischemi. cellerna märktes genom VACC TOPO prober som beskrivs. Sonderna visualisera gigantiska phagolysosomes 10 med DNas II raster (grön fluorescens), märkning fagocyter som aktivt uppsluka och smälta cell lik 7. Samtidig co-färgning med DAPI etiketter kromatin av fagocyter och de uppslukas celler inuti fagocyter. Den överlägg av VACC TOPO och DAPI signaler medger enkel identifiering och morfologisk analys av aktiva fagocytceller. För tydligare presentation, visas bilderna kompletteras med diagram över de händelser som visas.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1 Upptäckt av fagocytiska clearance i hjärnan sektioner av ligerbara sonder:. Principen för metoden.
Figur 2 Experimentell stroke 48 timmar efter ischemi debut:. Fagocytiska clearance av celldöd Två exempel på fagocytisk clearance.. Ligerbara VACC TOPO sond - grön fluorescens. Kärn fläcken DAPI - blå fluorescens. Diagram över de händelser som presenteras i bilderna (höger kolumn) visar kärnor av fagocyter och pycnotic uppslukas extra kärnor i olika stadier av nedbrytning. Scale bar - 15 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här videon visar vi, i vävnaden avsnittet format, hur man märka aktiva fagocyter som tydligt celldöd i fokal hjärnischemi. Den presenterade tekniken är den första metoden som specifikt märker bara de avfallshanterings celler som uppslukade och aktivt smälta cellulära lik. Detta gör det fördelaktigt med hänsyn till andra befintliga metoder för märkning av fagocyterande celler, som inte har denna förmåga.
Metoden använder en generell och selektiv DNA-baserade markör av fagocyterande förmåga - dubbelsträngat, trubbig slutade 5'OH DNA-brott som produceras i phagolysosomes av avfallshanteringsceller under matsmältningen av uppslukade kärnor. Denna specifika märkningen av endast aktiva fagocytceller tillåter korrekt bedömning av intensiteten och effektiviteten i den fagocytiska reaktion i ischemisk hjärnan.
Tekniken är robust och fungerar bra om alla steg följs som beskrivs. Det proteinas K digestipå steg är särskilt viktigt för en stark och reproducerbar färgning. Overdigestion i detta steg leder till förlust av DNA från sektionen och kan minska eller tom eliminera signalen. Den andra kritiska punkten är att använda en mycket aktiv beredning av vaccinia topoisomeras enzymet. En begränsning med tekniken är att den inte var optimerad för användning med färska frysta snitt.
Ansatsen har bred tillämplighet på studier av apoptos och kan utökas till andra vävnader och omständigheter utanför ischemisk hjärna. Det är särskilt praktiskt när det används för visualisering av fagocytiska reaktioner i vävnader och organ sammansatta av flera celltyper med olika deltagande avfallshanteringsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av bidrag R01NS062842 från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke, National Institutes of Health (VVD) och genom bidrag R21 NS064403 från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke, National Institutes of Health genom Arra (VVD) och R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
