Summary
We presenteren een nieuw fluorescentie techniek voor het selectief in situ labeling van actieve fagocyterende cellen, die duidelijk uit cel lijken in een beroerte. De aanpak is van belang voor de beoordeling hersenen reactie op ischemie omdat slechts een klein deel van fagocyten aanwezig in ischemische hersenen deelnemen klaring van celdood.
Abstract
We beschrijven een nieuwe histochemische aanpak voor visualisatie van fagocyterende klaring bij focale ischemie hersenen. De aanpak maakt de studie van de eliminatie van dode cellen in slag door afval-beheer fagocyten van een mobiele lijn. Hoewel een groot aantal cellen van verschillende oorsprong die in staat fagocytose aanwezig in ischemische hersenen, slechts een deel daarvan actief overspoelen en verteren cellen lijken. De selectieve visualisatie, kwantificering en analyse van dergelijke actieve fagocytaire afval-management zijn nuttig bij het beoordelen van de hersenen reactie op ischemie. Efficiënte celdood klaring is belangrijk voor de hersenen herstel van ischemische schade, want het opent de weg voor de latere regeneratieve processen. De niet lijken reinigen zou resulteren in een toxische reactie veroorzaakt door niet-afgebroken DNA en eiwitten. De beschreven procedure wordt fluorescente probes selectief geligeerd door een virale topoisomerase karakteristieke DNA-breuken die in alle fagocyten tijdens afblazenen digestie van cellen onherstelbaar beschadigd door ischemie. De methode is een nieuw instrument voor het onderzoeken van hersenen reactie op ischemie.
Introduction
Ischemische beroerte veroorzaakt diepgaande veranderingen in de getroffen hersenweefsel. Het initieert massale celdood, hetgeen leidt tot een snelle activering van inwoner fagocytische cellen van microgliale oorsprong. Ook worden af infiltratie van ischemische hersenen door verschillende soorten op basis van bloed professionele fagocyten waaronder neutrofielen, macrofagen, dendritische, en mestcellen 1,2.
Het wordt nog steeds gediscussieerd of deze reactie op ischemische schade speelt een positieve of een negatieve rol. Hoewel fagocytose na slag voordelig kan zijn omdat het ruimt dode cellen en onderdrukt ontstekingen, het genereert ook toxische zuurstofradicalen die neuronale overleving en verergeren weefselschade 1-5.
Terwijl verschillende soorten fagocytcellen infiltreren ischemische hersenen, niet allemaal deelnemen aan afval-beheer door engulfing cel lijken en de weg vrijmaken voor regeneratieve processen 1-3. Deze creates een vereiste voor selectieve identificatie van afvalbeheer cellen die het uitvoeren van fagocytische klaring van celdood in een beroerte. Wanneer de beeldvorming dergelijke actieve afvalbeheer cellen, is het ook belangrijk om de vraag hoe efficiënt ze degraderen de verzwolgen cel lijken te beantwoorden. De efficiënte en volledige afbraak van DNA de stervende cel in fagocytose is essentieel omdat het voorkomt zelf-immunisatie en het vrijkomen van pathologische kernmateriaal 6.
Hier presenteren we nieuwe probes die specifiek DNA breuken als merkers van actieve fagocyten. Deze handtekening pauzes zijn uitsluitend geproduceerd tijdens afbraak van verzwolgen kernen binnen functionele afvalbeheer cellen. Daarom is de sondes selectief alleen die fagocyten die overspoelen label en actief te verteren cellulaire lijken. Zij laten ook het observeren van de intensiteit en de voltooiing van DNA afbraak na het afblazen. De sondes zijn nuttig in evaluaties van intensiteit en efficirantie van fagocytaire klaring.
De nieuwe probes steunen op een niet-eiwit-gebaseerde merker en kan daarom bijzonder voordelig zijn in studies van slag waarbij grote ischemische celmorfologie kunnen verstoren of afbreken van eiwitten merkers, vooral in de kern ischemische zone.
Het principe van de techniek is weergegeven in figuur 1. Figuur toont haarspeldvormige oligonucleotideprobes geligeerd door het enzym topoisomerase vaccinia (VACC TOPO) om 5'OH DNA-uiteinden gegenereerd door lysosomale DNase II in DNA digestie 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De methode is geschikt voor vaste formaldehyde, in paraffine ingebedde weefselcoupes. De techniek wordt hier in zijn toepassing aangetoond experimentele beroerte in ratten.
1. Voorbereiding Onderdelen voor tyramide Signal Amplification (TSA) Systeem
Alhoewel TSA-gebaseerde versterking wordt gebruikt in de slotfase van etikettering voorbereiding van deze reactie kan meer dan 1 uur duren. Daarom is het handig om de TSA reagentia te maken voordat u de etikettering.
- Maak fluorofoor tyramide stamoplossing. Gebruik het in individuele flacons met de TSA labeling kit fluorophore tyramide reagens. Voeg 300 ul DMSO de tyramide reagens flacon. Fluorofoor tyramide voorraad oplossing is stabiel gedurende tenminste 3 maanden indien bewaard bij 4 ° C.
- Voeg TNT wasbuffer bevattende: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. Indien nodig 0.3% Triton X-100 kan worden vervangen door het 0,05% Tween-20. Alternattend PBS worden gebruikt als wasbuffer.
- Voeg TNB blokkerende buffer die 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,5% Blocking Reagent (met kit meegeleverd). Volledig oplossen van de blokkering reagens, voeg langzaam het in kleine stappen naar de buffer onder roeren. Verwarm deze oplossing langzaam tot 55 ° C onder voortdurend roeren. Dit kan 30-60 minuten duren. De oplossing verschijnt melkachtig. Breng op kamertemperatuur voor gebruik. Aliquot en bewaar bij -20 ° C voor langdurig gebruik.
2. Bereiding van de punten
Met dia's met gemonteerde 5 urn dikke secties gesneden uit formaline gefixeerde weefsels.
- Behandel secties met xyleen gedurende 15 minuten.
- Rehydrateren secties als volgt: laten weken in 96% EtOH 2x gedurende 5 minuten elk; weken in 80% EtOH gedurende 5 minuten; wassen met water 2x gedurende 5 minuten elk.
- Voeg Proteinase K werkoplossing door verdunnen Proteinase K stamoplossing tot 50 ug / ml in PBS.
- Proteinase toevoegenK werkende oplossing te delen. Incubeer 15 minuten bij 23 ° C. Het volume van de oplossing en het tijdstip van digestie moet worden aangepast aan de grootte van de secties en weefseltypen. Voor een sectie klein (minder dan 5 mm in diameter) 50 ul proteïnase oplossing voldoende. Gedeelte voor een gemiddelde grootte (~ 10 mm in diameter), voeg 100 pl Proteinase K oplossing. Voor zeer grote delen van het volume van de oplossing kan worden opgeschaald. In alle gevallen zorgen voor overdigestion secties die leidt tot signaalverlies voltooien en vernietigt weefselmorfologie voorkomen. Dit gebeurt vaak als incubatietijd van meer dan 25 minuten.
- Was secties in gedestilleerd water 2x gedurende 5 minuten elk. Bereid de etikettering mix die actieve sonde terwijl secties zijn in het water.
3. VACC TOPO-gebaseerde kleuring
- Bereid de actieve probe-oplossing door combinatie van de volgende:
Water - 11.75 gl
1 M Tris-HCl, pH 7,4-1,25 μl
100 pmol van 12-base overhang zelfmoord oligonucleotide - 1 ui
100 pmol oligonucleotide adapter - 1 pi
50 pmol VACC TOPO - 10 gl - Meng voorzichtig door pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur (23 ° C) gedurende 15 minuten om voor activering probe.
- Neem secties van wassen pot en zuig het resterende water. Vervolgens naar actieve probe bereid in stap 3.1 (25 ui per ~ 10 x 10 mm doorsnede).
- Dekglaasje secties en incubeer gedurende 15 minuten bij 23 ° C. Dipslides in water om voorzichtig te verwijderen dekglaasjes. Wassen in water 3x gedurende 5 minuten elk.
4. TSA Signal Enhancement
- Bedek weefselsecties met TNB blokkerende buffer eerder bereid en incubeer objectglaasjes in een vochtige kamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (23 ° C).
- Bereid een 1:100 verdunning van streptavidine-mierikswortelperoxidase conjugaten (SA-HRP) in TNB blokkerende buffer. Aspireren TNBblokkeringsbuffer en toepassen SA-HRP oplossing. Incubeer dia's met SA-HRP gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik voldoende reagens volume op het weefsel sectie, algemeen 100 ul per sectie te dekken.
- Was 3x dia gedurende 5 minuten elk in TNT wasbuffer (of PBS) bij kamertemperatuur.
- Bereid een 1:50 verdunning van fluorofor tyramide voorraad in 1x Amplification Diluent van de kit. Pipetteer de fluorofoor tyramide werkende oplossing op elke dia. Gebruik voldoende werkende oplossing volledig te bedekken de sectie weefsel, meestal 100 ul per sectie. Maak fluorofoor tyramide werkende oplossing onmiddellijk voor elk etiket. De oplossing kan niet worden hergebruikt, zodat het ongebruikte gedeelte van het weggooien na labeling.
- Incubeer de glaasjes bij kamertemperatuur gedurende 3 tot 10 minuten. Monitor fluorescentietoename onder microscoop totdat de eerste tekenen van structuren te zien. Snel overgaan tot stap te wassen.
- Wash glijdt 3x 5 min elk in TNT wasbuffer (of PBS) bij kamertemperatuur temperature met agitatie.
- Voeg de antifading oplossing met DAPI en dekglaasje. Let op onder de fluorescentiemicroscoop. Te visualiseren DAPI en FITC fluorescentie gebruik een band-pass filter set:
FITC excitatie D490/40, emissie 520/10; DAPI excitatie D360/40, emissie 460/20 en dergelijke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het principe van deze techniek voor het labelen actieve afvalbeheer fagocyten wordt getoond in Figuur 1. Het schema toont dat de detectie verloopt in drie stappen. De eerste stap omvat activatie probe (Figuur 1A); in de tweede stap de actieve probe geligeerd aan specifieke DNA breuken in weefselcoupes (figuur 1C); de derde stap omvat fluorescerende signaalversterking (figuur 1D). In een meer gedetailleerde uitleg, de detectie gaat als volgt:
1. Probe activatie. Voor de ligatiereactie VACC TOPO moet covalent worden gekoppeld aan het 3 'uiteinde van de oligoprobe. Tijdens de activering sonde VACC TOPO hecht aan de haarspeld-adapter duplex en splitst de bovenste streng. De 12-base-lang gedeelte dan permanent scheidt, waardoor VACC TOPO gehecht aan het 3'-uiteinde van de haarspeld. Deze oligonucleotide met het enzym gekoppeld aan de 3 'uiteinde kan DNase II Type vakantie (Figuur 1B) label. De 12-base overhang en een adapter oligo zijn nodig omdat het enzym niet knippen kortere streng 8 en derhalve niet hechten aan de sonde en op het 3'-uiteinde.
2. Probe ligatie. Biotinylated haarspelden worden geligeerd door VACC TOPO om stompe uiteinden DNA-breuken gegenereerd door de fagocyten verteren kernen van dode cellen 5'OH. De verbonden probes worden gevisualiseerd door fluorescentie met tyramide toebehoren 9.
3. Fluorescente signalering bereikt door tyramide Signal Amplification (TSA) systeem 9. Tijdens dit proces streptavidine-mierikswortelperoxidase conjugaten hechten aan gebiotinyleerde haarspelden en activeer binding van fluorescerende tyramides in de directe omgeving, het creëren van sterk fluorescerende sites.
e_content "> Toepassing van de techniek experimentele beroerte is getoond in figuur 2. Figuur 2 presenteert fluorescentiebeelden actieve fagocyten clearing celdood in rattenhersenen 48 uur na de start van permanente focale hersenischemie. De cellen worden gelabeld door de VACC TOPO probes zoals beschreven. De sondes visualiseren gigantische phagolysosomes 10 met DNase II breaks (groene fluorescentie), markering fagocyten die actief verzwelgen en verteren cel lijken 7. Gelijktijdige co-kleuring met DAPI labels chromatine van de fagocyten en de overspoelde cellen binnen fagocyten. De overlays van VACC TOPO en DAPI mogelijk maken signalen gemakkelijke identificatie en morfologische analyse van actieve fagocyten. Voor een heldere presentatie, worden de beelden aangevuld met schema's van de getoonde gebeurtenissen.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1 Detectie van fagocyterende speling in de hersenen secties door ligeerbare sondes:. Principe van de methode.
Figuur 2 Experimentele takt 48 uur na ischemie ontstaan:. Fagocytaire klaring van celdood Twee voorbeelden van fagocytaire klaring.. Ligeerbare VACC TOPO sonde - groene fluorescentie. Nucleaire vlek DAPI - blauwe fluorescentie. Diagrammen van de gebeurtenissen die in de afbeeldingen (rechterkant) tonen kernen van fagocyten en pycnotic overspoeld extra kernen in verschillende stadia van de spijsvertering. Schaalbalk - 15 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video laten we zien, in het weefsel sectie-indeling, hoe actief fagocyten etiket waarop duidelijk celdood bij focale ischemie hersenen. De gepresenteerde techniek is de eerste benadering die specifiek labels alleen die afvalbeheer cellen die overspoeld en actief te verteren cellulaire lijken. Dit maakt het voordeel ten opzichte van andere bestaande werkwijzen voor het labelen van fagocyterende cellen, die deze mogelijkheid hebben.
De methode maakt gebruik van een algemene en selectieve DNA-gebaseerde marker van fagocytose - double-stranded, stomp eindigde 5'OH DNA-breuken geproduceerd in phagolysosomes afvalbeheer cellen tijdens de spijsvertering van verzwolgen kernen. Deze specifieke kenmerken van enige actieve fagocyten maakt nauwkeurige beoordeling van de intensiteit en de efficiëntie van de fagocytische reactie in ischemische hersenen.
De techniek is robuust en werkt goed als alle stappen worden gevolgd zoals beschreven. De proteinase K digestiop stap is bijzonder belangrijk voor een sterke en reproduceerbare kleuring. Overdigestion bij deze stap leidt tot verlies van DNA van de sectie en kan verminderen of zelfs het signaal te elimineren. Het andere belangrijke punt is een zeer actieve preparaat van de vaccinia topoisomerase-enzym gebruiken. Een beperking van deze techniek is dat het niet is geoptimaliseerd voor verse ingevroren secties.
De aanpak heeft brede toepasbaarheid te onderzoeken van apoptose en is uitbreidbaar naar andere weefsels en omstandigheden buiten ischemische hersenen. Het is vooral handig wanneer gebruikt voor visualisatie van fagocyterende reacties in weefsels en organen samengesteld uit meerdere celtypen met diverse deelnemende afvalbeheer cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidie R01NS062842 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health (VVD) en door subsidies R21 NS064403 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health door ARRA (VVD) en R21 EB006301 Nationaal Instituut voor Biomedische Weergave en Biotechniek, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
