Summary
Biz aktif fagositik hücrelerin yerinde etiketleme seçici için yeni bir floresan tekniği sunmak, hangi berrak inme hücre cesetlerin kapalı. İskemik beyin içinde mevcut olan fagositoz sadece küçük bir kısmı, hücre ölümü açıklık katılmak için bir yaklaşım, iskemi, beyin reaksiyon değerlendirilmesi için önemlidir.
Abstract
Biz fokal beyin iskemi fagositik açıklık görselleştirme için yeni bir histokimyasal yaklaşım açıklar. Yaklaşım herhangi bir hücresel soy atık yönetimi fagositlerce inme ölü hücrelerin ortadan kaldırılması çalışmasına izin verir. Fagositoz yeteneğine sahip, farklı kökenlerden çok sayıda hücreleri iskemik beyinde mevcut olmasına rağmen, bunların sadece bir kısmı aktif olarak yutan ve hücre cesetleri sindirmek. Seçici görselleştirme, ölçme ve böyle aktif fagositik atık yönetiminin analizi iskemi beyin yanıtı değerlendirirken yardımcı olur. Bu daha sonraki işlemleri için rejeneratif yol açar gibi etkili hücre ölümü açıklık, iskemik yaralanma beyin kurtarma için önemlidir. Cesetleri temizlemek için arıza olmayan bozulmuş DNA ve protein neden olduğu zehirli bir reaksiyona neden olur. Tarif edilen işlem, seçici yutulma sırasında tüm fagositler üretilen karakteristik DNA sonları için bir viral topoizomeraz ile lige floresan probları kullanırve hücrelerin sindirim geri dönüşümsüz iskemi zarar. Yöntem, iskemik yaralanma beyin reaksiyon soruşturma için yeni bir araçtır.
Introduction
İskemik inme etkilenen beyin dokusunda köklü değişiklikleri neden olur. Bu mikroglial kaynaklı yerleşik fagositik hücrelerin hızlı aktivasyonuna yol açar ki, büyük hücre ölümü başlatır. Aynı zamanda, nötrofiller, makrofajlar, dendritik ve mast hücreleri dahil olmak üzere, 1,2 kandan alınan profesyonel fagositlerin çeşitli iskemik beyin infiltrasyonu yola çıkıyor.
Hala iskemik yaralanma bu yanıtı olumlu ya da olumsuz bir rolü olup olmadığını tartışmalıdır. Ölü hücreleri temizler ve enflamasyon bastırır felç nedeniyle aşağıdaki fagositoz yararlı olabilir, ancak, aynı zamanda, nöronun hayatta kalışını etkileyen ve doku hasarı 1-5 arttıran toksik reaktif oksijen türleri oluşturur.
Fagositik hücrelerin çeşitli iskemik beyin sızmak da, tüm bunların hücre cesetlerini içine çeken ve rejeneratif süreçleri 1-3 önünü temizleyerek atık yönetimine katılmak. Bu crinme hücre ölümünün fagositik açıklık gerçekleştirmek atık yönetim hücrelerinin seçici tanımlanması için bir gereklilik eates. Gibi aktif atık yönetimi hücreleri görüntüleme, onlar sardı hücre cesetleri aşağılamak ne kadar verimli soruyu cevaplamak için de önemlidir. Kendi kendine bağışıklık ve patolojik nükleer malzeme 6'nın serbest önler, çünkü fagositozu ölen hücrenin DNA etkin ve tam bozulması gereklidir.
Burada aktif fagositik hücrelerin belirteçleri olarak spesifik DNA sonlarını kullanmak yeni araştırmalar mevcut. Bu imza sonları sadece işlevsel bir atık yönetimi hücrelerin içinde yuttu çekirdeklerinin parçalanması sırasında üretilir. Bu nedenle sondalar seçici yutmak sadece bu fagositler etiket ve aktif hücresel cesetleri sindirmek. Ayrıca yutulma sonrası yoğunluğu ve DNA parçalanması tamamlanmasını gözlem izin verir. Problar yoğunluğu ve effici değerlendirmeler de faydalıdırfagositik açıklık ency.
Yeni sondalar olmayan bir protein bazlı işaretleyici kullanan ve bu nedenle geniş bir iskemik hasar hücre morfolojisi bozacak ya da özellikle çekirdek iskemik bölge içinde, protein-bazlı belirteçler tüketebilir inme, çalışmalarda özellikle avantajlı olabilir.
Tekniğin ilkesi, Şekil 1 'de sunulmuştur. Şekil enzim vaccinia topoizomeraz (VACC TOPO) ile lige saç tokası şeklinde oligonükleotit probları gösterir 5'OH DNA DNA sindirim 7 boyunca lızozomal DNase II tarafından üretilen sona erer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yöntem, formaldehit sabitlenmiş, parafine gömülü doku bölümleri için uygundur. Bu teknik, sıçanlarda deneysel olarak inme burada uygulanması gösterilmiştir.
Tyramide Sinyal Amplifikasyon (TSA) sistemi için 1. Hazırlanması Bileşenleri
TSA tabanlı geliştirme Bu reaksiyon için hazırlanması, etiketleme son aşamasında kullanılır, ancak en fazla 1 saat alabilir. Bu nedenle etiketleme başlamadan önce TSA reaktifler için uygundur.
- Fluorofor tiramid stok solüsyonu olun. TSA etiketleme kiti ile tek tek vialler içinde verilen flüorofor tiramid reaktifi kullanarak. Tiramid reaktifi şişeye 300 ul DMSO ilave edin. 4 ° C'de depolandığında Florofor tiramid stok çözeltisi en az 3 ay süreyle stabildir
- TNT içeren yıkama tamponu edin: 0.1 M Tris-HCI, pH 7.5; 0,15 M NaCl; % 0.05 Tween-20. Gerektiğinde% 0.3 Triton X-100,% 0.05 Tween-20 ile ikame edilebilir ise. Alternatively PBS yıkama tampon olarak kullanılabilmektedir.
- Yap TNB içeren bloke edici tampon: 0.1 M Tris-HCI, pH 7.5; 0,15 M NaCl; % 0.5 Engelleme Reaktif (kit ile birlikte). Karıştırılırken tamamen bloke reaktif çözmek için, yavaş yavaş arabelleğe küçük artışlarla ekleyin. Yavaş yavaş sürekli karıştırma ile 55 ° C'ye kadar bu çözüm ısıtın. Bu 30-60 dakika sürebilir. Çözelti sütlü görünecektir. Kullanmadan önce oda sıcaklığına getirin. Uzun süreli kullanım için -20 ° C'de kısım ve mağaza.
Bölüm 2. Hazırlanması
Formalin sabit dokulardan kesip monte 5 mikron kalınlığında kesitler ile slaytlar kullanın.
- 15 dakika boyunca, ksilen ile tedavi bölümleri.
- Aşağıdaki gibi bölümler Rehydrate: 5 dakika her biri için% 96 EtOH 2x emmek; 5 dakika boyunca% 80 EtOH emmek; 5 dakika her biri için, su 2X ile yıkayın.
- PBS içinde 50 ug / ml proteinaz K stok çözelti seyreltilerek Proteinase K çalışma çözeltisi olun.
- Proteinaz EkleK bölümlere çözüm çalışıyor. 23 ° C'de 15 dakika inkübe Çözeltinin hacmi ve sindirim zaman bölümleri ve doku tiplerinin boyutuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Küçük bir (çapı 5 mm altında) bir bölüm için proteinaz çözeltisi 50 ul yeterli olacaktır. Ortalama boyutu için, (~ 10 mm çapında) bölümünde Proteinaz K çözeltisi 100 ul ilave edin. Çok büyük kesitler için çözeltinin hacmi kadar ölçeklendirilebilir. Tüm durumlarda sinyal kaybını tamamlamak için yol ve doku morfolojisi yok bölümleri Overdigestion önlemek için özen. Kuluçka süresi 25 dakika aşarsa, bu sık sık olur.
- Her biri 5 dakika için damıtılmış su 2x bölümleri yıkayın. Bölümler su içinde iken aktif prob ihtiva eden etiketleme karışım hazırlayın.
3.. VACC TOPO dayalı Boyama
- Aşağıdaki birleştirerek aktif prob çözeltisi hazırlayın:
Su - 11.75 ul
1 M Tris-HCI, pH 7,4-1,25 μl
12-baz çıkıntı intihar oligonükleotidin 100 pmol - 1 ul
Adaptör oligonükleotidin 100 pmol - 1 ul
50 pmol VACC TOPO - 10 ul - Pipetleme ile hafifçe karıştırın. Prob aktivasyonu için izin vermek için 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (23 ° C) inkübe edin.
- Yıkama kavanoz bölümleri alın ve kalan suyu aspire. Daha sonra adım 3.1 (~ 10 x 10 mm bölüm başına 25 ul) 'de hazırlanan aktif prob çözeltisi uygulanır.
- Bölümleri lamel ve 23 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe Dip lamelleri yavaşça çıkarmak için su içinde kayar. 5 dakika her biri için su 3x yıkayın.
4. TSA Sinyal Geliştirme
- TNB daha önce hazırlanan ve oda sıcaklığında (23 ° C) de 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya bırakın Blokaj tamponu ile doku bölümleri örtün.
- TNB bloke edici tampon içinde streptavidin-yaban turpu peroksidaz (SA-HRP) bir 1:100 seyreltme hazırlayın. Aspire TNBSA-HRP solüsyonu tampon ve uygulamak engelleme. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca SA-HRP ile slaytlar inkübe edin. Doku bölümü, Bölüm başına genellikle 100 ul kapsayacak şekilde reaktif ses kullanın.
- Yıkama, oda sıcaklığında, TNT, yıkama tamponu (veya PBS) içinde 5 dakika boyunca 3 kez, her kayar.
- Kiti 1x Abartma Seyrelticisi içinde fluoroforun tiramid stokunun 1:50 seyreltme hazırlayın. Her bir slayt üzerine flüoroforun tiramid çalışma çözeltisi pipetle. Tamamen doku bölümü, Bölüm başına genellikle 100 ul karşılamak için yeterli çalışma solüsyonu kullanın. Hemen her etiketleme önce fluoroforun tiramid çalışma çözüm olun. Çözelti, tekrar, yani etiketleme sonra da herhangi bir kullanılmamış bir bölümünü atmak mümkün değildir.
- 3-10 dakika boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya bırakın. Yapıların birinci uçları görülebileceği kadar, bir mikroskop altında floresan artışı izler. Çabuk adımı yıkamak geçin.
- Yıkama odası t TNT yıkama tamponu (veya PBS) içinde 5 dakika boyunca 3 kez her slaytlarçalkalanarak emperature.
- DAPI ve kapak ile solmaya solüsyonu ekleyin. Flöresanlı bir mikroskop altında dikkate alınmalıdır. DAPI ve FITC floresan bir bant geçiren filtre seti kullanmak görselleştirmek için:
FITC uyarma D490/40, emisyon 520/10; DAPI uyarma D360/40, emisyon 460/20, veya benzer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aktif atık yönetim fagositler etiketleme için tekniğin temel ilkesi, Şekil 1 'de sunulmuştur. Gösteren şematik üç adımda tespit ilerler ki. İlk adım, sonda ile aktivasyonunu (Şekil 1A) kapsamaktadır; ikinci adımda aktive prob doku bölümleri (Şekil 1C) belirli DNA sonları bağlanır; Üçüncü adım floresan sinyal amplifikasyon (Şekil 1D) içerir. Aşağıdaki gibi daha ayrıntılı bir açıklama, algılama gider:
1.. Probe etkinleştirme. Önceki ligasyon reaksiyonuna VACC TOPO oligoprobe 3 'ucuna kovalent olarak bağlanmış olması gerekir. Prob aktivasyonu sırasında VACC TOPO firkete-adaptör dubleks ve yararak üst şerit takılır. 12-baz-uzunluğunda bir parçası daha sonra, sürekli, firketenin 3 'ucuna bağlı VACC TOPO bırakarak ayırır. 3 'ucuna bağlanmış enzimle Bu oligonükleotid DNase II tipi sonları (Şekil 1 B) etiketleyebilir. Enzim daha kısa bir teli 8 yeterli olmayacaktır ve bu nedenle prob birleşir ve onun 3 'ucunu aktif hale getirmek için mümkün olacaktır, çünkü 12-baz çıkıntı ve bir adaptör oligo gerekmektedir.
2.. Probe ligasyonu. Biyotinilat tokaları ölü hücrelerin çekirdekleri sindirerek fagositler tarafından üretilen künt uçlu DNA kırılmaları 5'OH için VACC TOPO tarafından bağlanır. Ekli sondalar tiramid geliştirme 9 kullanarak floresan tarafından görüntülenmiştir.
3.. Floresan sinyal Tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) sistemi 9 kullanılarak elde edilir. Bu süreçte streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatlan biyotinli saç tokaları takmak ve güçlü floresan siteleri oluştururken, yakın çevresinde floresan tyramides bağlanmasını etkinleştirin.
Deneysel inme tekniğin e_content "> uygulama, Şekil 2'de gösterilmiştir. kalıcı fokal işemi, beyin başlamasından sonra sıçan beyninde 48 saat hücre ölümünü etkin temizleme fagositik hücrelerin 2 sunar floresan görüntü Şekil. Hücreler VACC TOPO ile etiketlenir açıklandığı sondalar gibi. sondalar aktif yutmak ve hücre cesetleri 7 sindirmek fagositler işaretleme, DNase II sonları (yeşil floresan) ile devasa fagolizozomları 10 görselleştirmek. DAPI ile eşzamanlı co-boyama fagositlerin ve fagositlerle iç sardı hücrelerin kromatin etiketler. VACC TOPO ve DAPI sinyalleri paylaşımları kolay tanımlanmasını ve aktif fagositik hücrelerin morfolojik analiz izin. net sunumu için, görüntüleri gösterilen olayların diyagramlar ile tamamlanmaktadır.jpg "width =" 500 "/>
Yöntemin prensibi:. Ligatable sondalar beyin kesitlerinde fagositik açıklık 1. Algılama Şekil.
Şekil 2 iskemi başlangıcından sonra Deneysel inme 48 hr:. Hücre ölümü fagositik temizleme fagositik açıklık iki örnek.. Ligatable VACC TOPO prob - yeşil floresan. Nükleer leke DAPI - mavi floresan. Görüntülerde sunulan olaylar (sağ sütun) Diyagramları fagositlerin ve pycnotic çekirdekleri sindirim çeşitli aşamalarında ekstra çekirdekleri sardı göstermektedir. Ölçek çubuğu - 15 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu videoda fokal beyin iskemi hangi berrak hücre ölümü aktif fagositler etiketlemek için nasıl, doku kesiti biçiminde göstermektedir. Sunulan tekniği özellikle yuttu ve aktif hücresel cesetleri sindirimi yalnızca bu atık yönetimi hücreleri etiketler ilk yaklaşımdır. Bu, bu yeteneğe sahip değilsiniz fagositik hücrelerin, etiketlenmesi için varolan diğer yöntemlere göre avantajlı kılar.
, Çift kollu bir sardı çekirdeklerin sindirim sırasında atık yönetim hücre fagolizozomları üretilen sona 5'OH DNA kırılmaları blunt - bir yöntem fagositik aktivite genel ve seçici bir DNA-temelli imleyici kullanır. Sadece aktif fagositik hücrelerin Bu özel etiketleme yoğunluğu ve iskemik beyin fagositik reaksiyonun verimliliği doğru değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.
Tekniği sağlam ve açıklandığı gibi tüm aşamaları takip eğer iyi çalışır. Proteinaz K digestiAdım güçlü ve yeniden üretilebilir bir boyama için özellikle önemlidir. Bu aşamada Overdigestion bölümünden DNA'nın kaybına yol açar ve azaltmak ve hatta ortadan kaldırmak sinyali olabilir. Diğer kritik nokta vaccinia topoizomeraz enzimin son derece aktif bir hazırlık kullanmaktır. Tekniğin bir sınırlama taze donmuş bölümleri ile kullanım için optimize değil olmasıdır.
Yaklaşım apoptoz çalışmaları geniş uygulanabilirliği olan ve iskemik beyin dışındaki diğer dokulara ve koşullara genişletilebilir. Katılan çeşitli atık yönetim hücreleri ile birden fazla hücre tipleri oluşan dokular ve organlarda fagositik reaksiyonlar görselleştirilmesi için kullanıldığında özellikle uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu araştırma Nörolojik Bozukluklar Ulusal Enstitüsü hibe R01NS062842 ve Sağlık (VVD) İnme, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü ve ARRA aracılığıyla Sağlık İnme, National Institutes (VVD) ve R21 hibe R21 NS064403 tarafından desteklenmiştir Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik EB006301 Ulusal Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
