Summary
Vi presenterer en ny fluorescens teknikk for selektiv in situ merking av aktive fagocytiske celler, noe som klart utenfor celle likene i slag. Tilnærmingen er viktig for vurdering av hjernen reaksjon på ischemi, fordi bare en liten del av fagocytter som er tilstede i iskemiske hjerne deltar i utskillelse av celledød.
Abstract
Vi beskriver en ny histochemical tilnærming for visualisering av phagocytic klaring i focal hjerne iskemi. Fremgangsmåten tillater studiet av eliminering av døde celler i slag med avfall-styrings fagocytter av alle cellulære avstamning. Selv om tallrike celler av forskjellig opprinnelse som er i stand til fagocytose er til stede i ischemisk hjerne, bare en del av dem aktivt sluker og fordøye celle lik. Den selektive visualisering, kvantifisering og analyse av slik aktiv fagocyttfunksjon avfall-ledelse er nyttig i vurderingen av hjernen svar på iskemi. Effektiv celledød klaring er viktig for hjerne utvinning fra iskemisk skade, da den åpner veien for de etterfølgende regenerative prosesser. Unnlatelse av å rense likene ville resultere i en giftig reaksjon forårsaket av ikke-degradert DNA og proteiner. Den beskrevne fremgangsmåten bruker fluorescerende prober selektivt bindes sammen av en viral topoisomerase til karakteristiske DNA pauser produsert i alle fagocytter under engulfmentog fordøyelse av celler irreversibelt skadet av iskemi. Metoden er et nytt redskap for undersøkelse av hjernen reaksjon på iskemisk skade.
Introduction
Iskemisk hjerneslag induserer dyptgripende endringer i de berørte hjernevev. Det initierer massiv celledød, noe som fører til rask aktivering av fastboende fagocytiske celler av microglial opprinnelse. Det setter også av infiltrasjon av iskemisk hjernen ved ulike typer blod-avledet profesjonelle fagocytter inkludert nøytrofile, makrofager, dendrittiske, og mastceller 1,2.
Det er omdiskutert hvorvidt dette svaret til iskemisk skade spiller en positiv eller en negativ rolle. Selv fagocytose etter hjerneslag kan være gunstig fordi det klarner døde celler og undertrykker betennelse, genererer det også giftige reaktive oksygen arter påvirker nevronale overlevelse og forverrer vevsskade 1-5.
Mens flere typer fagocyttiske celler infiltrere iskemisk hjerne, ikke alle av dem deltar i avfall-ledelse ved engulfing celle likene og rydde veien for regenerative prosesser 1-3. Dette creates et krav for selektiv identifisering av avfall-ledelse celler som utfører phagocytic clearance av celledød i slag. Når imaging slike aktive avfall-ledelse celler, er det også viktig å svare på spørsmålet om hvor effektivt de degradere de oppslukt celle likene. Den effektive og fullstendig nedvurdering av den døende cellens DNA i fagocytose er viktig fordi det hindrer selv immunisering og utgivelsen av patologisk kjernefysisk materiale seks.
Her presenterer vi nye prober som bruker spesifikke DNA pauser som markører for aktive fagocyttiske celler. Disse signatur pauser er utelukkende produseres under nedbrytning av oppslukt kjerner inne funksjonelle avfall-ledelse celler. Derfor sondene selektivt merke bare de fagocytter som sluker og aktivt fordøye cellulære lik. De tillater også at man intensiteten og komplettering av DNA nedbrytning etter engulfment. Sondene er nyttig i evalueringer av intensitet og effektivitetency av phagocytic klaring.
De nye prober er avhengige av en ikke-protein-baserte markør og kan derfor være spesielt fordelaktig i studier av slag, hvor omfattende iskemisk skade kan forstyrre cellulær morfologi eller utarme proteinbaserte markører, spesielt inne i kjernen ischemiske sonen.
Prinsippet for teknikken er presentert i figur 1.. Figuren viser hårnål-formet oligonukleotidprober ligert av enzymet vaccinia topoisomerase (VACC TOPO) til 5'OH DNA ender generert av lysosomal DNase II under DNA fordøyelsen 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fremgangsmåten er egnet for formaldehydfikserte, parafininnebygd vevssnitt. Teknikken er vist her i sin anvendelse til eksperimentell slag hos rotte.
En. Forbereder Komponenter for tyramide Signal Amplification (TSA) System
Selv om TSA-baserte forsterkning anvendes i det endelige trinn av merking, forbereder denne reaksjon kan ta mer enn 1 time. Derfor er det praktisk å gjøre TSA reagenser før du starter merking.
- Gjør Fluoroforen tyramide stamløsning. Bruk Fluoroforen tyramide reagens leveres i individuelle ampuller med TSA merking kit. Tilsett 300 mL DMSO til tyramide reagensflasken. Fluoroforen tyramide lager løsningen er stabil i minst 3 måneder når den lagres ved 4 ° C.
- Lag TNT vaskebuffer inneholdende: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,05% Tween-20. Hvis nødvendig 0,3% Triton X-100 kan anvendes i stedet for den 0,05% Tween-20. Alternatively PBS kan brukes som vaskebuffer.
- Lag TNB blokkering buffer inneholdende: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,5% Blokkering Reagens (følger med kit). For å fullstendig oppløse den blokkerende reagens, langsomt legge den i små trinn til bufferen under omrøring. Varm løsningen gradvis til 55 ° C med kontinuerlig omrøring. Dette kan ta 30-60 min. Løsningen vil vises melkeaktig. Bring til romtemperatur før bruk. Delmengde og oppbevar ved -20 ° C for langsiktig bruk.
2. Utarbeidelse av seksjoner
Bruk lysbilder med montert 5 mikrometer tykke seksjoner kuttet fra formalinfiksert vev.
- Unn seksjoner med xylen i 15 min.
- Rehydrere seksjoner som følger: suge i 96% EtOH 2x for 5 min hver; synke ned i 80% EtOH i 5 min; Vask med vann 2x for 5 min hver.
- Lag Proteinase K arbeidsløsning ved å fortynne Proteinase K stamoppløsning til 50 mikrogram / ml i PBS.
- Legg ProteinaseK arbeidsløsning til seksjoner. Inkuber 15 min ved 23 ° C. Volumet av oppløsningen og tiden for fordøyelse kan måtte justeres, avhengig av størrelsen av seksjoner og vevstyper. For en liten (under 5 mm i diameter) seksjon 50 pl proteinase løsning ville være tilstrekkelig. For en gjennomsnittlig størrelse (~ 10 mm i diameter) seksjon, tilsett 100 pl proteinase K-løsning. For meget store deler volumet av løsningen kan skaleres opp. I alle tilfeller passe på å hindre at overdigestion av seksjoner som fører til fullstendig tap av signal og ødelegger vev morfologi. Dette skjer ofte hvis inkubasjonstiden stiger 25 min.
- Vask seksjoner i destillert vann 2 x 5 min hver. Forbered merking mix inneholder aktive sonde mens delene er i vann.
Tre. VACC TOPO-basert Farging
- Klargjør aktiv sonde løsning ved å kombinere følgende:
Vann - 11.75 mL
1 M Tris-HCl, pH 7,4 til 1,25 μl
100 pmol av 12-base-overheng selvmords oligonukleotid - 1 mL
100 pmol av adaptoroligonukleotid - 1 mL
50 pmol VACC TOPO - 10 mL - Bland forsiktig ved pipettering. Inkuber ved romtemperatur (23 ° C) i 15 min for å tillate sonden aktivering.
- Ta seksjoner fra vask jar og aspirer det resterende vannet. Da gjelder det aktive sonde løsning utarbeidet i trinn 3.1 (25 mL per ~ 10 x 10 mm-delen).
- Dekk seksjonene og inkuberes i 15 minutter ved 23 ° C. Dip glir i vannet for å forsiktig fjerne dekkglass. Vask med vann 3 ganger i 5 minutter hver.
4. TSA Signal Enhancement
- Dekker vevssnitt med TNB blokkering buffer fremstilt tidligere, og inkuber glir i et fuktet kammer i 30 min ved romtemperatur (23 ° C).
- Forbered en 1:100 fortynning av streptavidin-pepperrot peroksidase konjugater (SA-HRP) i TNB blokkering buffer. Aspirer TNBblokkering buffer og bruke SA-HRP løsning. Inkuber slides med SA-HRP i 30 min ved romtemperatur. Bruk egnet reagens volum til å dekke den delen vev, vanligvis 100 ul per seksjon.
- Vask glir 3x i 5 minutter hver i TNT vaskebuffer (eller PBS) ved romtemperatur.
- Forbered en 1:50 fortynning av fluoroforen tyramide lager i 1x Amplification Diluent fra settet. Pipetter Fluoroforen tyramide arbeidsløsning på hvert lysbilde. Bruk nok fungerende løsning for å dekke den delen vev, som regel 100 mL per seksjon. Gjør Fluoroforen tyramide arbeidsløsning umiddelbart før hver merking. Løsningen kan ikke gjenbrukes, så kast ubrukte delen av den etter merking.
- Inkuber objektglassene ved romtemperatur i 3 til 10 min. Monitor fluorescens utvidelse under mikroskop før de første hint av strukturer kan sees. Raskt fortsette å vaske trinn.
- Vask glir 3x for 5 min hver i TNT vaskebuffer (eller PBS) på rommet temperature med agitasjon.
- Tilsett antifading løsning med DAPI og dekkglass. Observer under fluorescens mikroskop. For å visualisere DAPI og FITC fluorescens bruke et band-pass filter sett:
FITC eksitasjon D490/40, utslipp 520/10; DAPI eksitasjon D360/40, utslipp 460/20, eller lignende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prinsippet av teknikken for merking aktive avfall håndterings fagocytter er presentert i figur 1.. Skjematisk viser at deteksjons fortsetter i tre trinn. Det første trinnet omfatter probe aktivering (figur 1A); i det andre trinnet av den aktiverte probe blir ligert til spesifikke DNA-brudd i vevssnitt (figur 1C); det tredje trinn omfatter fluorescerende signal forsterkning (fig. 1D). I en mer detaljert forklaring, går den oppdagelse som følger:
En. Probe aktivering. Før ligeringsreaksjonen VACC TOPO trenger å bli kovalent bundet til 3'-enden av oligoprobe. Under probe aktivering VACC TOPO festes til hårnål-adapter duplex og kløyver den øvre Strand. Den 12 grunn lange delen deretter permanent skiller, slik VACC TOPO festet til 3'-enden av hårnål. Dette oligonukleotid med enzymet knyttet til dens 3'-ende kan merke DNase II type bryter (figur 1B). Den 12-base-overheng og en adapter oligo er nødvendig fordi enzymet ikke skjærer en kortere tråd 8, og vil derfor være ute av stand til å feste seg til sonden og aktiverer sin 3 'ende.
2. Probe ligation. Biotinylated hårnåler ligeres av VACC TOPO å 5'OH sløv ended DNA bryter generert av fagocytter fordøye kjerner av døde celler. De vedlagte sonder er visualisert ved fluorescens hjelp tyramide ekstrautstyr ni.
Tre. Fluorescent signale oppnås ved å bruke tyramide Signal Amplification (TSA) system ni. I løpet av denne prosessen streptavidin-pepperrot peroksidase konjugater feste til biotinylerte hårnåler og aktiver binding av fluorescerende tyramides i umiddelbar nærhet, og skaper sterkt fluorescerende nettsteder.
e_content "> Anvendelse av teknikken til eksperimentell slag er vist i figur 2.. Figur 2 viser fluorescens bilder av aktive fagocytiske celler fjerne celledød i rotte hjernen 48 timer etter starten av permanent fokal hjerne-ischemi. Cellene blir merket med VACC TOPO prober som beskrevet. Sondene visualgigantiske phagolysosomes 10 med DNase II pauser (grønn fluorescens), merking fagocytter som aktivt sluker og fordøye celle likene 7. Samtidig co-farging med DAPI etiketter kromatin av fagocytter og av de oppslukt celler inne fagocytter. Den overlegg av VACC TOPO og DAPI signaler tillater enkel identifisering og morfologisk analyse av aktive fagocytiske celler. For klarere presentasjon, blir bildene supplert med diagrammer av hendelser vist.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1 Påvisning av phagocytic klaring i hjernen deler av ligatable sonder:. Prinsippet for metoden.
Figur 2 Experimental hjerneslag 48 timer etter iskemi utbruddet:. Phagocytic clearance av celledød To eksempler på phagocytic klaring.. Ligatable VACC TOPO probe - grønn fluorescens. Nuclear flekken DAPI - blå fluorescens. Diagrammer av hendelsene som presenteres i bilder (høyre kolonne) viser kjerner av fagocytter og pycnotic oppslukt ekstra kjerner i ulike stadier av fordøyelsen. Scale bar - 15 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette video viser vi, i vevet delen format, hvordan man skal merke aktive fagocytter som klart celledød i fokal hjerne-ischemi. Den presenterte teknikken er den første tilnærmingen som spesifikt etiketter bare de avfall-ledelse celler som har oppslukt og aktivt fordøye cellulære lik. Dette gjør det fordelaktig i forhold til andre eksisterende metoder for merking av fagocytiske celler, som ikke har denne evne.
Metoden bruker en generell og selektiv DNA-baserte markør for fagocyttisk aktivitet - dobbel-strandet, sløv endte 5'OH DNA pauser produsert i phagolysosomes av avfalls celler under fordøyelsen av oppslukt kjerner. Denne spesifikke merking av bare aktive fagocytiske celler tillater nøyaktig vurdering av intensiteten og effektiviteten av fagocytisk reaksjonen i iskemisk hjerneskade.
Teknikken er robust og fungerer bra hvis alle trinnene er fulgt som beskrevet. Den proteinase K digestipå trinnet er særlig viktig for sterk og reproduserbar farging. Overdigestion på dette trinn fører til tap av DNA fra seksjonen og kan redusere eller eliminere signalet. Den andre kritiske punkt, er å benytte en høyaktiv forberedelse av vaccinia topoisomerase enzymet. En begrensning av teknikken er at det ikke ble optimalisert for anvendelse med fersk frossen seksjoner.
Tilnærmingen har bred anvendelse i studier av apoptose og kan utvides til andre vev og forhold utenfor iskemisk hjerne. Det er spesielt fordelaktig når den brukes for visualisering av fagocytiske reaksjoner i vev og organer består av flere celletyper med forskjellig deltagende avfallsstyring celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av stipend R01NS062842 fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health (VVD) og med tilskudd R21 NS064403 fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag, National Institutes of Health gjennom Arra (VVD) og R21 EB006301 National Institute of Biomedical Imaging og bioteknologi, National Institutes of Health (VVD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | JT Baker | 9490-22 | |
| Ethanol | |||
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| PBS Buffer | Invitrogen | AM9624 | |
| Vaccinia Topoisomerase I | Vivid Technologies | 5 pmol/μl stock | |
| 12-Base Overhang Suicide Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-AAG GGA CCT GCB GCA GGT CCC TTG ATA CGA TTC TA -3’; B – Biotin-dT; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| Adapter Oligonucleotide | IDT DNA | 5’-TAG AAT CGT ATC-3’; 100 pmol/μl stock in ddH2O | |
| 1 M Tris-HCl, PH 7.4 | Lonza | 51237 | |
| TSA, Fluorescein System | PerkinElmer | NEL701A001KT | |
| 1 M NaCl | |||
| DMSO | Sigma | ||
| Tween-20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | 22 x 22 mm or 22 x 40 mm glass or plastic coverslips. Plastic coverslips are preferable during the reaction, as they are easier to remove from the section. | ||
| Rat Brain Sections | Rat brain taken 48 hr after reproduction of ischemic stroke as described in Didenko et al11. 5-6 μm-thick sections cut from paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue blocks. Use charged and precleaned slides. | ||
| Inverted Microscope | Olympus | ||
| Digital Video camera and software | Micromax | ||
| Software | Metamorph |
References
- Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. J Leukoc Biol. 87, 779-789 (2010).
- Schilling, M., Besselmann, M., Müller, M., Strecker, J. K., Ringelstein, E. B., Kiefer, R. Predominant phagocytic activity of resident microglia over hematogenous macrophages following transient focal cerebral ischemia: an investigation using green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol. 196 (2), 290-297 (2005).
- Faustino, J. V. Microglial cells contribute to endogenous brain defenses after acute neonatal focal stroke. J Neurosci. 31 (36), 12992-13001 (2011).
- Thored, P. Long term accumulation of microglia with proneurogenic phenotype concomitant with persistent neurogenesis in adult subventricular zone after stroke. Glia. 57 (8), 835-849 (2009).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 6 (9), 677-688 (2005).
- Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16 (6), 4599-4614 (2011).
- Shuman, S. Two classes of DNA end-joining reactions catalyzed by vaccinia topoisomerase. Sci. Rep. 267, 16755-16758 (1992).
- TSA Fluorescence Systems. , Available from: http://www.perkinelmer.com/CMSResources/Images/44-73609man_TSAFluorescenceSystems.pdf Forthcoming.
- Barcia, C., et al. ROCK/Cdc42-mediated microglial motility and gliapse formation lead to phagocytosis of degenerating dopaminergic neurons in vivo. Sci. Rep. . 2, 809 (2012).
- Didenko, V. V., Ngo, H., Minchew, C. L., Boudreaux, D. J., Widmayer, M. A., Baskin, D. S. Visualization of irreparable ischemic damage in brain by selective labeling of double-strand blunt-ended DNA breaks. Mol. Med. 8, 818-823 (2002).
