Summary
Cet article décrit un protocole de travail à l'image épines dendritiques de neurones de l'hippocampe in vitro utilisant structuré Illumination Microscopy (SIM). Microscopie de super-résolution utilisant la carte SIM offre une résolution d'image de façon significative au-delà de la limite de diffraction de la lumière dans les trois dimensions de l'espace, ce qui permet l'imagerie des épines dendritiques individuelles avec l'amélioration de détail.
Abstract
Épines dendritiques sont des saillies issues de la dendrite d'un neurone et représentent les cibles primaires de post-synaptiques excitateurs entrées dans le cerveau. Les progrès technologiques ont permis d'identifier ces structures comme des éléments clés de la connectivité neuronale et la plasticité synaptique. L'analyse quantitative de la morphologie de la colonne vertébrale en utilisant la microscopie optique reste un problème essentiel en raison de limitations techniques liées à la limite de réfraction intrinsèque de la lumière. Épines dendritiques peuvent être facilement identifiés par microscopie à fluorescence confocale laser à balayage. Toutefois, la mesure des changements subtils dans la forme et la taille des épines est difficile en raison des dimensions de la colonne vertébrale autres que la longueur sont généralement plus petits que la résolution optique classique fixé par théorique limite de résolution de la microscopie optique de 200 nm.
Plusieurs techniques de super résolution récemment développés ont été utilisés pour les structures cellulaires image plus petits que les 200 nm, y compris les épines dendritiques. Ttechniques es sont basés sur les activités en champ lointain classiques et permettent donc l'utilisation de méthodes existantes de préparation d'échantillons et à l'image au-delà de la surface d'un échantillon. Décrit ici est un protocole de travail pour appliquer la résolution de super structuré éclairage microscopie (SIM) pour l'imagerie des épines dendritiques dans des cultures de neurones hippocampiques primaires. Les applications possibles de la carte SIM se chevauchent avec ceux de la microscopie confocale. Cependant, ces deux techniques présentent l'applicabilité différente. SIM offre une résolution latérale plus efficace, tout en microscopie confocale, en raison de l'utilisation d'un sténopé physique, réalise l'amélioration de la résolution au détriment de l'enlèvement de sortir de la lumière de mise au point. Dans ce protocole, les neurones primaires sont cultivées sur des lamelles de verre en utilisant un protocole standard, transfectées avec des plasmides d'ADN codant pour des protéines fluorescentes et imagée en utilisant la carte SIM. Le tout protocole décrit ici prend environ 2 semaines, parce que les épines dendritiques sont imagés après 16-17 jours in vitro, quanddéveloppement dendritique est optimal. Après l'achèvement du protocole, épines dendritiques peuvent être reconstruites en 3D de la série de la carte SIM piles d'images à l'aide de logiciels spécialisés.
Introduction
Une épine dendritique est une petite saillie de la membrane des neurones. Cette structure caractéristique est spécialisée recevoir généralement des données à partir d'une seule synapse et représente la zone de contact physique entre deux neurones. La plupart des épines dendritiques fonctionnellement matures constitués d'une pointe globulaire, appelé tête, et un cou mince qui relie la tête de l'arbre dendritique. Cependant, les épines sont pas statiques et se déplacent activement et modifier leur morphologie en permanence, même dans le cerveau adulte 2. Dans un délai de 2 semaines de temps, des cultures de neurones de l'hippocampe de rat primaire provenant de la fin du temps postnatale embryonnaire ou au début de développer tonnelles dendritiques complexes avec de nombreuses protubérances membranaires qui évoluent de filipodes tôt pour les structures de la colonne vertébrale comme 3. Sur la base de ce comportement dynamique et d'autres caractéristiques, les épines dendritiques sont pensés pour fournir un substrat anatomique pour le stockage en mémoire et 4,5 de la transmission synaptique.
Compte tenu ee rôle critique que la taille des épines dendritiques et la forme ont dans la fonction synaptique, il est important de mesurer leurs dimensions avec précision. Épines varient d'environ 200 à 2000 nanomètres de longueur et peuvent être facilement identifiés par microscopie à fluorescence confocale laser à balayage. Cependant, les dimensions de la colonne vertébrale autres que la longueur sont généralement en dessous de la résolution des systèmes optiques classiques de, théoriquement fixée par diffraction autour de 200 nanomètres 6. Ces pouvoirs de résolution sont insuffisantes pour l'imagerie des détails plus fins, telles que la largeur de cou de la colonne vertébrale et la tête. Beaucoup de travail a été consacrée à résoudre ce problème et de nombreux relativement nouvelles techniques de microscopie de super-résolution ont fourni d'importants progrès. En particulier, il est possible d'obtenir une résolution au-delà de la limite classique sans écarter toute lumière d'émission en utilisant la microscopie à lumière structurée latéralement (SIM) dans un grand champ, d'un microscope confocal non-10.7. En utilisant cette technique en combinaison avec des non-linear techniques de microscopie, il est théoriquement possible d'améliorer la résolution latérale du microscope optique par un facteur 11 illimité. Cependant, dans la plupart des cas expérimentaux, SIM permet de dépasser la limite de résolution d'un facteur de deux 1. D'autres techniques de microscopie optique de super-résolution comme l'épuisement d'émission stimulée (STED) microscopie 12 et photo-activation localisation microscopie (PALM) 12 ont été appliquées à l'imagerie des épines dendritiques. Méthodes basées sur la localisation, telles que PALM nécessitent très grand nombre d'images brutes pour atteindre la super-résolution et sont donc limités à la vitesse. D'autre part, STED peut atteindre une vitesse élevée d'imagerie, bien au nombre de photons relativement faibles et les petits champs de vision, ce qui peut ne pas être le cas pour la carte SIM 13.
Dans cet article, l'objectif est de fournir un protocole de travail à l'image épines dendritiques des neurones hippocampiques primaires de rat en culture in vitro
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures expérimentales sur des animaux ont été optimisés pour réduire la souffrance animale et ont été approuvés par la Commission pour l'expérimentation animale, Université d'Amsterdam, Dec protocole # DED204 et DED250.
1. Coverslip Préparation
- Coupez les lamelles à une taille de 15 mm x 15 mm à l'aide d'un carbure ou diamant scribe, afin qu'ils s'insèrent dans les puits d'une plaque de 12 puits.
- En travaillant dans une hotte de laboratoire, démarrer revêtement de lamelles par une immersion complète des lamelles dans une solution d'acide nitrique concentré (70% poids / poids) dans un récipient en verre. Pour assurer une distribution uniforme de bougé, puis incuber pendant un minimum de 4 heures. Il est possible de réutiliser la solution d'acide nitrique concentré pendant environ 2 heures, mais il peut perdre couleur par exposition à la lumière.
- Retirer la solution d'acide nitrique concentré et laver les lamelles quatre fois dans de l'eau distillée pendant 30 minutes, en secouant soigneusement après chaque lavage.
- Avec prudence retirer leeau.
Remarque: les trois étapes suivantes sont effectuées dans une hotte à flux laminaire stérile. - Tremper les lamelles dans EtOH à 96%. Retirez les lamelles de la solution EtOH et les laisser sécher.
- Flamber les lamelles et les mettre dans un récipient en verre. Utilisez des pinces fines pour gérer les lamelles (forceps no.5 de style Dumont par exemple).
- Couvrez le récipient avec du papier d'aluminium et cuire dans un four à chaleur sèche pour 12-16 heures à 180 ° C. Lamelles de boulangerie peuvent être conservés à température ambiante pendant 1 mois si les couvrir.
2. Coverslip revêtement
La procédure de revêtement de la lamelle favorise l'attachement neurone à la surface du verre et de l'arborisation dendritique 14.
- Dans une hotte laminaire stérile, utiliser de petites pinces stériles pour placer les lamelles individuelles dans des puits individuels d'une plaque de 12 puits.
- Ajouter 500 pi de poly-L-lysine solution (ou des quantités suffisantes pour submerger les lamelles).
- Enveloppez til plaque dans du papier d'aluminium pour éviter l'évaporation et laisser toute la nuit à température ambiante.
- Avant de commencer la culture, aspirer le-L-lysine Poly solution soigneusement dans une hotte laminaire stérile.
- Laver chaque puits avec 1 ml d'eau stérile deux fois, tout en les empêchant de se dessécher.
- Aspirer l'eau complètement, ajouter 1 ml de milieu d'étalement et de laisser les lamelles dans l'incubateur de culture tissulaire avant d'être prêt à plaquer les cellules. Il est recommandé à plaquer les cellules dans les 24 heures.
3. Suppression des cerveaux de E16-E19 Rat embryons
- Stériliser les instruments de chirurgie, en les chauffant dans un stérilisateur à sec pendant une nuit ou en les lavant avec de l'EtOH à 70%. Sécher si EtOH est utilisé.
- Préparer plusieurs plats de 30 mm avec un tampon 1x HBSS et de les garder sur la glace.
- Euthanize le barrage de rat par une injection intrapéritonéale de Euthasol (160 mg / kg Euthasol dans un volume de ± 0,4 ml).
- Vérifier l'absence de réflexes.
- Vaporiser l'abdomen de la mère à 70% EtOH.
- Faire une incision le long du ventre et enlever l'utérus.
- Retirez les embryons de l'utérus et les placer dans une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre.
- Enlevez les têtes des embryons avec de grands ciseaux et placer les têtes dans une nouvelle boîte de Pétri contenant un tampon 1x HBSS froid.
Remarque: à partir de là à l'étape 7.1 de la procédure est effectuée dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. - Maintenez la tête sur les côtés avec de grandes pinces.
- Avec de petits ciseaux, faire une coupe sagittale de la peau sur le dessus de la tête, puis les peler latéralement la peau vers le bas avec une grande pince.
- Utilisez la même approche que dans l'étape 3.10 de retirer le crâne. Faire une coupe sagittale à partir de l'extrémité caudale; ouvrir doucement le crâne sans endommager les tissus du cerveau. Pliez les deux moitiés du crâne loin exposant latéralement le cerveau.
- Avec la spatule émoussée, évider le cerveau et le placer dans fraîche 1x HBSS. 4. Dissection des hippocampes
- Retirer et jeter le cervelet avec les ciseaux fins.
- Séparer les deux hémisphères du cerveau en effectuant une coupe sagittale le long de la ligne médiane.
- Prenez chaque hémisphère et placer à la fois dans un nouveau plat de 30 mm contenant froide 1x HBSS.
- Placer chaque hémisphère de telle sorte que le lobe temporal fait face au fond de la boîte.
NOTE: A partir de là, il est recommandé d'utiliser un microscope à dissection. - Maintenez le mésencéphale en utilisant une petite pince et retirer le mésencéphale avec une autre paire de pinces. Laisser le reste de l'hémisphère intact contenant le cortex et l'hippocampe.
- Retourner le tissu, de sorte que l'hippocampe est maintenant face au fond de la coupelle.
- Tirez doucement sur l'hémisphère en pdentelle avec une pince fine. En utilisant une autre pince fine, soigneusement et retirez délicatement les méninges. Il est plus facile de commencer par le bulbe olfactif. Faites preuve de prudence afin de ne pas endommager l'hippocampe.
- Orientez le tissu de sorte que l'hippocampe est maintenant orientée vers le haut. L'hippocampe peut maintenant être vu par sa structure caractéristique en forme de C.
- En utilisant une pince fine, disséquer l'hippocampe. Recueillir dans un nouveau plat de 30 mm contenant froide 1x HBSS.
- Compter le nombre total de hippocampes, puis les couper en petits morceaux.
- Recueillir les morceaux dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 3 ml de HBSS 1x.
- Centrifuger à 300 g pendant 5 min et retirez soigneusement le surnageant.
- Ajouter 6 pi trypsine par l'hippocampe.
- Incuber pendant 20 min max à 37 ° C. Agiter après 3 min.
- Laver deux fois avec 5 ml de fraîche 1x HBSS et jeter le surnageant.
- Après le secoe laver, ajouter 1,5 ml de milieu de placage, de pré-chauffé à 37 ° C. Le sérum dans le milieu de placage va inactiver l'activité de la trypsine.
- Triturer lentement 30x avec une pipette Pasteur polie au feu jusqu'à ce que tous les morceaux de tissu sont dispersés de façon homogène dans des cellules individuelles. Éviter toute propagation.
- Ajouter 5 ml de milieu d'étalement préchauffé à 37 ° C.
- Compter les cellules en utilisant un coloration vitale au bleu Trypan.
- Ensemencer 50 000 cellules par puits d'une plaque de 12 puits dans 1 ml de placage moyen, préparés à la section 2 (volume total de 2 ml).
- Secouez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules.
- Incuber à 37 ° C, 5% CO 2. Après 2-3 jours, remplacer la moitié du milieu de placage (0,5 ml) avec du milieu de culture contenant 10 uM FUDR.
Remarque: l'imagerie de la colonne vertébrale dendritique est effectuée 16-17 jours après placage (16-17 jours in vitro, DIV). - Préparer l'ADN de plasmide exprimant la GFP et de milieu d'incubation (10 ml de milieu Neurobasal avec 100 ul de glutamax).
- Pré-chauffer le milieu d'incubation à 37 ° C.
- Préparer l'ADN mélange (tube A). Pour chaque lamelle ajouter 1 ug d'ADN dans 100 ul de milieu ordinaire Neurobasal. Mélanger doucement.
- Préparer Lipofectamine mélange (tube B). Pour chaque lamelle ajouter 2 pi Lipofectamine dans 100 pi de milieu ordinaire Neurobasal. Mélanger doucement.
- Ajouter le mélange Lipofectamine goutte à goutte ADN de mélange.
- Incuber dans la hotte à flux laminaire pendant 30 min à température ambiante.
- Ajouter 1 ml de milieu d'incubation pré-chauffé à la plaque 1.
- plaque de magasin 2 pendant 5 min à 37 ° C, 5% CO 2.
- Ajouter doucement goutte à goutte 200 ul de l'ADN / Lipofectamine mélangent à chaque puits et incuber pendant 45 min à 37 ° C, 5% CO 2.
- Avec l'utilisation de petites pinces mécaniques du coverslips contenant les neurones et rincez-les en les trempant dans un plat à 3 cm contenant un milieu frais chaud Neurobasal et déplacez-les sur la plaque 2.
- Incuber les neurones transfectées à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.
- Vérifier l'efficacité de la transfection 24 heures après transfection.
- Préparer 4% PFA et 0,05 M SCT.
- Réchauffer la solution à 4% de PFA à 37 ° C.
- Aspirer le milieu des puits contenant les lamelles.
- Ajouter 500 pi de chaud 4% de PFA avec soin pour éviter d'endommager les dendrites.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min.
- Laver avec 1x HBSS 3 fois pendant 5 min.
REMARQUE: à ce point échantillons peuvent être conservés jusqu'à 3 semaines à 4 ° Cou immunologique peut être démarré immédiatement. - Si les échantillons ont été conservés, se laver avec 0,05 M SCT 3 fois pendant 5 min.
- Bloquer avec du TBS-BSA (1%) solution à la température ambiante pendant 30 min.
- Laver avec du TBS 0,05 M 3 fois pendant 5 min.
- Ajouter l'anticorps primaire dilué dans du mélange d'incubation.
- Incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante.
- En outre, incuber une nuit à 4 ° C avec agitation douce.
- Retirer l'anticorps primaire.
- Laver avec 0,05 M SCT 3x pendant 5 min.
NOTE: à partir de ce moment, garder les lamelles abri de la lumière. - Ajouter l'anticorps fluorescent conjugué secondaire dilué en mélange d'incubation.
- Incuber à température ambiante pendant 2 h.
- Retirer l'anticorps secondaire.
- Laver avec du TBS 0,05 M 3 fois pendant 5 min.
- Laver avec 1X TB 2 fois pendant 5 min.
- Utilisez des pinces fines pour enlever à lamelles dans les puits.
- Sécher l'excédent de la tuberculose avec un tissu et monter le coverslips en utilisant un milieu de montage.
- Sceller avec du vernis à ongles pour éviter l'évaporation de milieu de montage.
- Allumez le laser de 488 nm, la lampe à mercure, le contrôleur de l'étape, le contrôleur piézo, la lampe halogène pour lumière transmise et le PC et lancer le logiciel SIM dans le mode "ANDOR N-SIM".
- Nettoyez l'objet de la FRBR 100xive avec 95% d'éthanol à trois reprises, et si nécessaire avec de l'éther de pétrole.
- Utilisez les paramètres de filtre suivants: 520 LP avec un dichroïque 488.
- Mettre une goutte d'huile d'immersion sur l'objectif. Vérifiez qu'il n'y a pas de bulles d'air dans l'huile goutte. Déplacez l'objectif vers le haut jusqu'à ce que l'huile touche l'échantillon.
Remarque: Placez un couvercle sur la scène pour le protéger de la lumière ambiante et éteindre les lumières dans la salle autant que possible. - Régler la bague de correction de l'objectif à 37 ° C, 200 pm, afin d'obtenir la meilleure symétrie des PSF. Afin de définir la position du col correcte, la première position de l'anneau objectif à la position nominale optimale et contrôler un échantillon de billes de 100 nm. Selon la symétrie de la meilleure PSF, légèrement modifier la position d'une collerette autour de la consigne.
- Pour l'éclairage, utiliser 3D-SIM réseau (3D 1layer 100X/1.49 toutes les longueurs d'onde). Pour commencer le lieu de réseau d'alignement du bloc réseau sélectionné dans l'illuminateur SIM, avec le 100X 1.49 objectif en place. Utilisez un échantillon de billes de 100 nm monté dans les médias, avec une concentration qui peut permettre d'isoler 10-15 perles pour un champ de vision (FOV). Après avoir réglé la bague de correction objectif à la position désirée, sélectionnez l'éclairage 3D-SIM et commencer la procédure d'alignement logiciel guidée. Il sera exécuté (5 phases) x x (1) de direction (100 z-avions) les images, à partir de laquelle il sera de reconstruire le champ de vision avec des perles. Après avoir sélectionné une seule bille par un retour sur investissement approprié, couvrant l'ensemble du talon y compris la lumière floue out-of-focus, le logiciel va commencer un PSF automatique de montage et il ajustera la position de réseau selon le résultat.
- Pour vérifier la performance du microscope, répéter le réseau d'alignement toutes les 2 semaines, en raison de l'alignement éventuel causé par les mouvements de table et / ou la dérive de température. En outre, vérifiez que l'intensité et la stabilité laser selon les recommandations du fabricant.
- Nettoyer la surface de l'échantillon avec 95% ethANOL trois fois.
Note: Pour les prochaines étapes voir figure 3 pour une vue d'ensemble des panneaux de contrôle et les paramètres corrects dans le logiciel de la carte SIM. - Dans le logiciel SIM, sélectionnez la configuration optique yeux FITC et sélectionnez un bloc de filtre vide dans la tourelle 1 pour l'inspection visuelle de la lumière blanche.
- Réglez la vitesse de focalisation et la vitesse de Voyage de la table XY pour "Fine".
- Ouvrir l'obturateur et rapidement se concentrer sur l'échantillon.
- Refermez le volet et définir la coordonnée Z à zéro.
- Sélectionnez le filtre vert dans la tourelle 1 pour l'inspection visuelle à l'aide du canal vert.
- Régler l'intensité de la lampe au mercure à la température minimum.
- Passer à la frontière de l'échantillon avec soin, veillant à ce que l'objectif ne touche pas le produit d'étanchéité.
- Ouvrir l'obturateur et rapidement balayer à travers l'échantillon avec l'intensité la plus faible possible.
- En rencontrant une dendrite suffisamment lumineuse d'intérêt et de centrage d'un segment d'intérêtdans le champ de vision, fermer l'obturateur.
- Réglez le logiciel de configuration optique 3D-SIM 488 et les réglages de l'appareil de lecture en mode EM, gagner 1 MHz 16 bits, temps d'exposition de 100 ms, la puissance du laser 5% et EM gagner 200.
REMARQUE: Vérifier que le filtre vert dans la tourelle 2 est sélectionnée et que la tourelle 1 est vide. - Vérifiez que le réseau est réglé sur «Moving» et cliquez en direct pour voir l'échantillon avec une lumière laser et à travers la caméra.
- Activer le Look Up Table.
- Centrez l'objet d'intérêt si nécessaire et de se concentrer à la mise au point rapide mis à Extra Fine.
NOTE: dans le mode de lecture EM gagner 1 MHz 16-bit, l'intensité de la cible pour une bonne image de la carte SIM est entre 30,000-45,000. - Ajuster rapidement les réglages de l'appareil pour obtenir une valeur d'intensité entre 30,000-45,000 dans le mode de lecture EM gagner 1 MHz 16-bit. Utiliser un premier temps:
- Puissance du laser: 0% - 20% (avec des échantillons préparés comme décrit ci-dessus, 5% ou 2,6 mW est suffisante)
- Temps d'exposition:50 ms-2 sec
- Mode de lecture: EM gagner 1 MHz 16-bit
- EM gagner: 0-300
- gain de conversion: 1x - 5.1x
- Format pour Live: Non binning
- Format de capture: Non binning
REMARQUE: ces paramètres 6,3% ± 1,3% blanchiment est systématiquement réalisé, dans la limite de 10% de blanchiment maximale acceptable, ce qui pourrait affecter de manière significative la qualité de l'image 15.
- Cliquez sur Arrêter pour désactiver l'affichage en direct.
- Configurez les paramètres de la pile 3D Z dans le panneau Séquence ND à:
- Plage: 2 pm
- Régler la taille: 120 nm
- Plan Z
- Cliquez sur la position d'accueil
- Sélectionnez la configuration optique 3D-SIM 488 dans la section Lambda
- Sélectionnez la fonction 3D-SIM comme mode d'acquisition dans le bloc N-SIM.
- Exécutez l'acquisition de séquence ND et enregistrer les données brutes.
- Sélectionnez la configuration optique yeux FITC et répétez les étapes 8.15 à 8.27 jusqu'à ce que la totalité de l'échantillon a été imagé
- Reconstruction de l'image 3D: Les données acquises à l'étape 8.23 peuvent être soit reconstruit tout de suite ou plus tard. Commencez par la reconstruction de la pile de Z avec les paramètres de reconstruction par défaut en mode Reconstruire Slice ou Reconstruire Pile et ajuster si nécessaire.
REMARQUE: pour de meilleurs résultats, Z piles doivent être faites avec la taille de l'étape indiquée et reconstruites en mode Reconstruire Stack. Toujours vérifier la validité de l'image reconstruite en la comparant aux données brutes ou, de préférence, une image à grand champ. Les paramètres qui peuvent être ajustés pour le processus de reconstruction sont le contraste et la suppression du bruit à haute fréquence. Deux d'entre eux influencent la façon dont différentes propriétés de l'image brute sont prises en compte au cours du processus de reconstruction. En cas de faible profondeur de modulation des données brutes, le paramètre de contraste joue un rôle important. Si l'utilisateur dispose des ensembles de données avec un faible rapport signal-sur-bruit, le paramètre de suppression de bruit à haute fréquence peut influencer la qualité de reconstruction soisévèrement. - Quand l'imagerie dans les produits finis, centre de la platine XY et déplacer l'objectif tout le long de sa position de repos.
- Démontez l'échantillon et nettoyer l'échantillon et l'objectif de 95% d'éthanol.
- Arrêtez le logiciel et l'ordinateur et éteignez tous les autres appareils.
- Reconstruction et la colonne vertébrale classification 3d des images acquises peut être effectué après la conversion des fichiers au format TIFF comme décrit précédemment en utilisant un logiciel NeuronStudio (voir la figure 4) 16.
- Utilisez les paramètres suivants pour la reconstruction dans le logiciel NeuronStudios:
- Volume: dimensions Voxel: X: 0,03 um; Y: 0,03 um; Z: 0,120 um.
- Détection Dendrite: Attacher rapport: 1,3; Durée minimale: 5 um; Ratio de discrétisation: 1; Réaligner jonctions: Oui.
- Spine détection: Hauteur minimum: 0,2 um; Hauteur maximum: 5.001 um; Largeur maximum: 3 pm; Taille tronqué minimum: 10 voxels; Taille non tronqué minimum: 5 voxels.
- Spine classificateur: rapport du cou (rapport tête-cou): 1.1; Rapport mince: 2,5; taille des champignons: 0,35 um;
- Paramètres NeuronStudio utilisés pour le rendu: forme de sommet Neurites: éclipse solide; Couleur neurites de sommet: par type; Forme de bord neurites: ligne; Neurites couleur de bord: une seule couleur; Spine forme: éclipse solide; couleur de la colonne vertébrale: par type.
Remarque: Après la reconstruction 3D est-il également possible de régler le volume de rendu. Le seuil de défaut a été fixé à 20 avec l'option «Régénérer le volume rendering 'actif. Opacité a été fixé par 'automatique d'intensité "cochée. «Surface uniquement» et les options «Utiliser le point de pré-rendu» ont également été actifs
Il est très important que la dissection se fasse aussi rapidement que possible dans des conditions stériles afin d'assurer la viabilité des cellules. Conserver les échantillons froid sur la glace.
5. Dissociation cellulaire et placage
6. Hippocampe de rat primaire Neuron transfection utilisant Lipofectamine
7. Immunocoloration et montage de rat hippocampe neurones primaires
Pour améliorer l'intensité de fluorescence dans les cellules transfectées, effectuer un protocole d 'immuno d'améliorer la détection de la GFP 48 heures après transfection.
8. Des épines dendritiques imagerie utilisant Structure Illumination Microscopy
Imagerie épines dendritiques en utilisant le système SIM décrit dans les matériaux avec une résolution latérale (XY) de la valeur d'environ 85 à 110 nm et une valeur axiale (Z) de résolution entre 200 à 250 nm, la fourniture d'un facteur de 2 fois l'amélioration de la résolution par rapport à microscopie à champ large.
REMARQUE: imagerie de la colonne vertébrale dendritique utilisant la carte SIM se fait généralement deux jours après l'étape 7.22, mais pourrait se faire jusqu'à 3 semaines plus tard si les échantillons sont maintenus dans l'obscurité et sous une température contrôlée de 22 à 23 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Décrit ici est un protocole de travail normalisé pour l'imagerie épines dendritiques des neurones de l'hippocampe primaires de rat in vitro utilisant la carte SIM. Le flux du protocole et de ses étapes cruciales sont présentés dans la figure 1. Globalement, le protocole prend environ 2 semaines de travaux expérimentaux séparés dans une première phase de préparation de l'échantillon, y compris la culture, le développement et la transfection de neurones hippocampiques primaires de rat et immunohistochimie, et la seconde phase de l'imagerie de l'échantillon en utilisant la carte SIM. Les neurones de l'hippocampe primaires de rat sont fixés environ 2 semaines après le début de la culture, lorsque les neurones ont développé tonnelles dendritiques complexes portant de nombreuses épines dendritiques 3,5. En utilisant le protocole décrit en détail dans les sections 8.1, il est possible de l'image de manière systématique avec des épines dendritiques super-résolution. En comparaison avec un procédé d'imagerie des épines dendritiques classique en utilisant la microscopie à fluorescence confocale qui est décrit avant 16,17, le protocole décrit ici en utilisant SIM offre nettement meilleure résolution de l'image et de la reconstruction 3D, permettant l'identification et la classification des protubérances membranaires des neurones allant de filipodes tôt pour les structures de la colonne vertébrale, etc.
Figure 1. Le schéma montre un flux de protocole, ses étapes et le calendrier.
Figure 2. Des micrographies représentatives de dendrites et des épines dendritiques imagées avec confocal (A) et la microscopie SIM (B). La micrographie SIM représentant a été acquis comme décrit dans l'article 8, la micrographie confocale représentant a été acquis uchanter taille sténopé physique: 30 pm puissance du laser de 2,6 mW, pas de moyenne. Acquisitions ont été reconstruites à partir des images confocale et SIM (C et D, respectivement) en utilisant le logiciel NeuronStudio comme décrit précédemment 16. Dendrites ont été tracées et les épines ont été classés automatiquement avec le logiciel après ajustement des principaux paramètres tels que la longueur du cou, diamètre du col et le diamètre de la tête. Les zones encadrées indiquent un épines dendritiques individu imagé avec confocale (A) et SIM (B) et reconstruite à partir de leurs piles correspondant Z (C et D), représentant les différences de résolution et la précision des reconstitutions en 3D résultant. Selon une résolution supérieure de la carte SIM, l'analyse quantitative de fois la tête (E) et le cou (F) de diamètre montre que les mesures SIM significativement plus petites dimensions que la microscopie confocale pour les mêmes épines dendritiques, ce qui indique que la carte SIM est capable de détecter les petites variations des épines dendritiques morphologie. Ré ata en E et F sont normalisées par rapport à des mesures de référence confocaux. Les résultats sont présentés en moyenne ± SD de trois épines dendritiques extraites de 5 segments dendritiques imagées dans les deux modes et confocale de microscope SIM. Pour diamètre du col il y avait une différence significative (p = 0,0049 **) entre confocale (100,0 ± 4.296 unités normalisées) et SIM (50,61 ± 7.642 Les unités normalisées) des images, tel que testé avec un test t Etudiants (E). Pour diamètre de la tête il y avait une différence significative (p = 0,0209 *) entre confocale (100,0 ± 6.255 unités normalisées) et SIM (58,12 ± 9,451 Les unités normalisées) des images, tel que testé avec un test t étudiants.
Figure 3. Capture d'écran de NiS éléments du logiciel 6.14 SIM du Nikon avec les paramètres décrits dans le présent protocole.
Figure 4. Capture d'écran de la reconstruction 3D et NeuronStudio logiciel de classification de la colonne vertébrale d'une image représentant d'une dendrite.
Tableau 1. Liste des réactifs. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cet article, un protocole de travail à l'image épines dendritiques des neurones de l'hippocampe primaires de rat en culture in vitro en utilisant la carte SIM est décrit. Le procédé de culture des neurones hippocampiques primaires est une adaptation de la méthode originale décrite par Kaech Banker et 18. Les différences principales sont l'utilisation d'un milieu Neurobasal/B27 de culture, ce qui élimine la nécessité de cultures nourricières astrocytaires, et l'addition de la FUDR d'inhibiteur mitotique au jour 3 qui favorise la survie des neurones tout en supprimant la prolifération des cellules gliales, comme décrit par Brewer et al 19.
Il ya de nombreuses étapes critiques dans le protocole. L'épaisseur des lamelles utilisées pour plaquer les cellules est essentiel pour une expérience SIM précis. Stérilité lors de la préparation de la lamelle et le revêtement est important. Ne laissez pas des lamelles poly-L-lysine-traitée sécher pendant 2.3 et 2.4. Le diamètre de la pipette de la flamme polie utilisée dans l'étape 5.8 est cruciale.Une pointe trop étroite se traduira par une faible viabilité des cellules à des stades ultérieurs. Isolation des hippocampes aussi rapidement que possible permettra d'assurer la viabilité des cellules haute. Le moment de l'incubation et la concentration de la trypsine sont essentiels pour assurer la viabilité cellulaire élevée. La perte de l'activité enzymatique de la trypsine peut également affecter la viabilité cellulaire. Enfin, l'addition de 5,14 FUDR dans l'étape est cruciale pour promouvoir la survie des neurones et inhibe la prolifération des cellules gliales.
La phase d'imagerie de l'échantillon est simple lorsqu'il est effectué suivant strictement le protocole décrit ici et les résultats dans l'acquisition d'images de super résolution qui peut être facilement reconstituées en 3D pour analyser et classer les épines dendritiques en fonction de leurs caractéristiques morphologiques. Comme le montre la figure 2, la qualité des images acquises en mode SIM est sensiblement meilleure que les images des segments exactement les mêmes épines dendritiques et individuelles acquises en utilisant le mode confocal de la même microscope. Ce résultat suggère that l'utilisation de la carte SIM pourrait fournir une excellente occasion à l'image plus de changements subtils dans la morphologie des épines dendritiques, quantifiée dans les figures 2E et 2F.
Jusqu'à présent, la plupart du temps (fluorescente) microscopie à grand champ a été utilisé pour les cellules vivantes de l'image, en raison de sa faible phototoxicité. De même, en raison de ses faibles effets phototoxiques et bonne combinaison avec fluophores (génétiques) classiques, la carte SIM permet l'imagerie des cellules vivantes et l'identification des épines dendritiques en basse fluophore cellules exprimant à super-résolution. En comparaison à d'autres méthodes de microscopie de super-résolution tels que STED ou PALM, SIM fournit une méthode rapide et abordable pour l'imagerie des épines dendritiques des neurones de l'hippocampe primaires de rat in vitro. Bien que dans la pratique, la carte SIM ne augmente la résolution de deux fois par rapport à la microscopie confocale classique.
Un exemple d'une limitation de la SIM est qu'elle repose sur la fluorescence, dans laquellecertains montages expérimentaux peuvent être difficiles à appliquer. A cette fin, des techniques de microscopie qui ne reposent pas sur la fluorescence tel que la microscopie électronique peut fournir une solution possible. Néanmoins, la microscopie électronique en particulier est un cher une méthode lente fastidieux. Par ailleurs, la microscopie électronique ne peut être réalisée sur des échantillons fixes. Par conséquent, la carte SIM est plus approprié pour la super-résolution de l'imagerie des cellules vivantes. La justification de l'application d'un plasmide codant la protéine fluorescente transfection est qu'il en résulte un marquage cytoplasmique rares, mais reproductible de cellules isolées, ce qui empêche le chevauchement des dendrites de cellules différentes et l'identification des épines dendritiques individuels. Combinaison de transfection avec immunocoloration a été montré précédemment pour renforcer la fluorescence 17. Néanmoins, d'autres techniques fluorescentes pourraient également être applicables à l'imagerie des épines dendritiques avec SIM, par exemple coloration fluorescente suffisant pourrait être obtenu à l'aide récemment désondes contraignants développés d'actine 20.
Depuis les récents progrès techniques ont permis l'application de SIM à l'imagerie cellulaire dynamique, ce qui démontre que haute vitesse-éclairage structuré microscope est capable de la résolution 100 nm à des cadences jusqu'à 11 Hz 13, une demande future très logique du protocole décrit ici pourrait être son application à time-lapse SIM de neurones hippocampiques primaires de rats vivants et l'analyse des changements dynamiques rapides dans la morphologie des épines dendritiques. Un prochain défi pour cette application pourrait être la phototoxicité cumulatif prévu associé à de longs intervalles de temps de la microscopie en direct.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par un H64.09.016 VIDI numéro de subvention de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) à CPF. CPF est reconnaissante au Dr A. Silvina Fratantoni pour ses commentaires critiques et corrections sur le manuscrit final. GMRDL / Emmm sont pris en charge par la Fondation de la technologie VAP néerlandais (de 12151 de projet et 11350), qui fait partie de la NWO, et qui est en partie financé par le ministère des Affaires économiques. Nous remercions Catherine Kitts-et-Peter Drent de Nikon Instruments Europe BV pour l'aide et le soutien. HX a été soutenue par l'Académie royale néerlandaise des arts et des sciences (subvention 11CDP10) et WT a été pris en charge par la subvention de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (subvention 820.02.006).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 Forthcoming.
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
