Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell'ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Summary

Questo articolo descrive un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni dell'ippocampo in vitro utilizzando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia super-risoluzione usando SIM fornisce risoluzione di immagine notevolmente oltre il limite di diffrazione della luce in tutte le tre dimensioni spaziali, permettendo l'imaging di singole spine dendritiche con maggiore dettaglio.

Abstract

Spine dendritiche sono sporgenze che emergono dal dendrite di un neurone e rappresentano gli obiettivi primari di ingressi postsinaptici eccitatori nel cervello. I progressi tecnologici hanno identificato queste strutture come elementi fondamentali di connettività neuronale e nella plasticità sinaptica. L'analisi quantitativa della morfologia della colonna vertebrale mediante microscopia ottica resta un problema essenziale a causa di limitazioni tecniche connesse con il limite intrinseco di rifrazione della luce. Spine dendritiche possono essere facilmente identificati da confocale a scansione laser microscopia a fluorescenza. Tuttavia, misurando sottili cambiamenti nella forma e dimensioni delle spine è difficile perché le dimensioni della colonna vertebrale diverse lunghezza sono generalmente più piccole rispetto alla risoluzione ottica convenzionale fissata dal limite di risoluzione teorica di microscopia luce di 200 nm.

Diverse tecniche di risoluzione di super sviluppate recentemente sono stati utilizzati per immagine strutture cellulari di dimensioni inferiori a 200 nm, comprese le spine dendritiche. Tueste tecniche sono basate su operazioni di campo lontano classici e consentono quindi l'uso di metodi di preparazione dei campioni esistenti e di immagine oltre la superficie di un campione. Qui descritto è un protocollo di lavoro per applicare la risoluzione strutturata eccellente illuminazione microscopia (SIM) per l'imaging di spine dendritiche in colture di neuroni ippocampali primarie. Le possibili applicazioni di SIM si sovrappongono con quelli della microscopia confocale. Tuttavia, le due tecniche presentano differente applicabilità. SIM offre risoluzione laterale maggiore efficacia, mentre microscopia confocale, grazie all'utilizzo di un pinhole fisica, raggiunge miglioramento risoluzione a scapito della rimozione di fuori fuoco luce. In questo protocollo, neuroni primari sono coltivate su vetrini utilizzando un protocollo standard, trasfettate con plasmidi di DNA codificanti proteine ​​fluorescenti e ripreso con SIM. L'intero protocollo qui descritto dura circa due settimane, perché spine dendritiche vengono esposte dopo 16-17 giorni in vitro, quandosviluppo dendritico è ottimale. Dopo il completamento del protocollo, spine dendritiche possono essere ricostruiti in 3D da una serie di SIM stack di immagini utilizzando software specializzati.

Introduction

Una spina dendritica è una piccola protrusione della membrana del neurone. Questa caratteristica struttura è specializzata per ricevere tipicamente ingresso di una singola sinapsi e rappresenta l'area di contatto fisico tra due neuroni. La maggior parte delle spine dendritiche funzionalmente maturi sono costituiti da una punta globulare, testa definito, e un collo sottile che collega la testa all'albero dendritica. Tuttavia, spine non sono statici e si muovono attivamente e cambiano la loro morfologia continuamente anche nel cervello adulto ^2. Entro un periodo di due settimane di tempo, colture primarie di neuroni dell'ippocampo di ratto derivati ​​da tempo postnatale ritardo embrionale o all'inizio sviluppano complessi pergole dendritiche con numerose sporgenze di membrana che si evolvono da inizio filipodia alle strutture della colonna vertebrale, come ^3. Sulla base di questo comportamento dinamico e le altre caratteristiche, spine dendritiche sono pensati per fornire un substrato anatomico per memorizzazione e ^4,5 trasmissione sinaptica.

Dato the il ruolo fondamentale che le dimensioni spina dendritica e la forma sono in funzione sinaptica, è importante misurare le dimensioni con precisione. Spine variano da circa 200 a 2.000 nanometri di lunghezza e possono essere facilmente identificati da confocale a scansione laser microscopia a fluorescenza. Tuttavia, le dimensioni della colonna vertebrale diversi lunghezza sono di solito sotto la risoluzione dei tradizionali sistemi ottici ', teoricamente fissato dalla diffrazione di circa 200 nanometri ^6. Questi poteri non sono sufficienti per risolvere l'imaging più fini dettagli, come la larghezza della colonna vertebrale colli e teste. Molto lavoro è stato dedicato a risolvere questo problema e molte relativamente nuove tecniche di microscopia a super-risoluzione hanno fornito notevoli progressi. In particolare, è possibile ottenere una risoluzione al di là del limite classico senza scartare alcuna emissione di luce utilizzando lateralmente strutturato microscopia illuminazione (SIM) in un ampio campo, microscopio confocale non ^7-10. Utilizzando questa tecnica in combinazione con non-lineatecniche di microscopia r, è teoricamente possibile migliorare la risoluzione laterale del microscopio ottico per un fattore di merito ^11. Tuttavia, nella maggior parte dei casi sperimentali, SIM consente di superare il limite di risoluzione di un fattore due ^1. Altri super-risoluzione di tecniche di microscopia ottica, quali l'esaurimento emissione stimolata (STED) microscopia a ¹² e la foto-attivazione di localizzazione di microscopia (PALM) ¹² sono stati applicati alla rappresentazione delle spine dendritiche. Metodi basati localizzazione, come ad esempio PALM richiedono un gran numero di immagini raw per ottenere super-risoluzione e sono quindi limitati nella velocità. D'altra parte, STED può ottenere un'elevata velocità di esposizione, sebbene relativamente basso numero di fotoni e piccoli campi di vista, che non può essere il caso per SIM ^13.

In questo articolo l'obiettivo è quello di realizzare un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di neuroni ippocampali di ratto primari in coltura in vitro

Protocol

Tutte le procedure sperimentali su animali sono stati ottimizzati per ridurre la sofferenza degli animali e sono stati approvati dalla Commissione per la Sperimentazione Animale, Università di Amsterdam, il protocollo DEC # DED204 e DED250.

1. Coverslip Preparazione

1. Tagliare i coprioggetti a una dimensione di 15 millimetri x 15 mm con un carburo o diamante scriba, in modo che si inseriscono nei pozzetti di una piastra 12 pozzetti.
2. Mentre si lavora in una cappa aspirante, avviare rivestimento vetrino coprioggetto immergendo completamente in soluzione di acido nitrico concentrato (70% p / p) in un contenitore di vetro. Per assicurare una scossa di distribuzione, poi incubare per un minimo di 4 ore. È possibile riutilizzare la soluzione di acido nitrico concentrato per circa 2 volte, ma può perdere colore per esposizione alla luce.
3. Rimuovere la soluzione concentrata di acido nitrico e lavare i coprioggetti quattro volte in acqua distillata per 30 minuti, agitando accuratamente dopo ogni lavaggio.
4. Con cautela rimuovere l'acqua.
   Nota: le prossime tre passaggi vengono eseguiti in una cappa a flusso laminare sterile.
5. Mettere a bagno i coprioggetti nel 96% EtOH. Togliere i coprioggetti dalla soluzione EtOH e lasciarli asciugare.
6. Fiamma i coprioggetti e metterli in un contenitore di vetro. Utilizzare una pinza sottile per gestire i coprioggetti (stile Dumont pinze no.5 per esempio).
7. Coprire il contenitore con un foglio di alluminio e cuocere in forno a calore secco per 12-16 ore a 180 ° C. Coprioggetto cotti possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 1 mese se coperti ermeticamente.

2. Coverslip Coating

La procedura di rivestimento coprioggetto favorisce attaccamento neurone alla superficie del vetro e arborization dendritica ^14.

1. In una cappa laminare sterile, utilizzare sterili piccole pinze per posizionare i singoli vetrini in singoli pozzetti di una piastra 12 pozzetti.
2. Aggiungere 500 ml di Poli-L-lisina soluzione (o una quantità sufficiente a sommergere i coprioggetti).
3. Avvolgere tegli piastra in un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione e lasciare tutta la notte a temperatura ambiente.
4. Prima di iniziare la coltura, aspirare accuratamente la soluzione di poli-L-lisina in una cappa laminare sterile.
5. Lavare ogni pozzetto con 1 ml di acqua sterile due volte, pur impedendo loro di asciugarsi.
6. Aspirare acqua completamente, aggiungere 1 ml di placcatura medio e lasciare i coprioggetti nel tessuto culturale incubatore fino al momento piastra le cellule. Si raccomanda alla piastra le cellule entro 24 ore.

3. Rimozione di Brains da E16-E19 Rat Embrioni

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici riscaldandoli in uno sterilizzatore a secco durante la notte o di lavarli con il 70% EtOH. Asciugare accuratamente se si utilizza EtOH.
2. Preparare diversi piatti 30 millimetri con 1x tampone HBSS e tenerli su ghiaccio.
3. Euthanize diga ratto con una iniezione intraperitoneale di Euthasol (160 mg / kg Euthasol in un volume di ± 0,4 ml).
4. Controllare l'assenza di riflessi.
5. Spruzzare l'addome della diga con il 70% EtOH.
6. Effettuare un'incisione lungo l'addome e rimuovere l'utero.
7. Rimuovere gli embrioni dall'utero e metterli in una capsula di Petri del diametro di 100 mm.
8. Togliere le teste degli embrioni con grandi forbici e posizionare le testine in un nuovo piatto di Petri contenente freddo 1x tampone HBSS.
   Nota: da qui al punto 7.1 la procedura viene eseguita in condizioni di sterilità in una cappa a flusso laminare.
9. Tenere premuto le teste lungo i lati con grandi pinze.
10. Con piccole forbici, fare un taglio sagittale in pelle sulla parte superiore della testa, poi lateralmente staccare la skin giù con una grande pinza.
11. Utilizzare lo stesso approccio nel passaggio 3.10 per rimuovere il cranio. Effettuare un taglio sagittale a partire dalla fine caudale; aprire delicatamente il cranio senza danneggiare il tessuto cerebrale. Piegare le due metà del cranio via laterale esponendo il cervello.
12. Con la spatola smussata, scavare il cervello e metterlo in acqua dolce freddo 1x HBSS.
4. Dissezione degli ippocampi

E 'molto importante che la dissezione avviene più rapidamente possibile in condizioni sterili per garantire la vitalità cellulare. Mantenere i campioni freddo sul ghiaccio.

1. Rimuovere e gettare il cervelletto con le belle forbici.
2. Separare i due emisferi del cervello, facendo un taglio sagittale lungo la linea mediana.
3. Prendere ogni emisfero e posizionare sia in un nuovo piatto 30 millimetri contenente fredda 1x HBSS.
4. Posizionare ciascun emisfero tale che il lobo temporale affronta il fondo del piatto.
   NOTA: Da qui in poi, si consiglia di utilizzare un microscopio da dissezione.
5. Premere delicatamente il mesencefalo utilizzando una piccola pinza e rimuovere il mesencefalo con un altro paio di pinze. Lasciare il resto dell'emisfero intatta contenente la corteccia e nell'ippocampo.
6. Girare il tessuto, in modo che l'ippocampo sta affrontando il fondo del piatto.
7. Premere delicatamente l'emisfero in ppizzo con una pinza sottile. Utilizzando un altro pinza sottile, con attenzione e rimuovere delicatamente le meningi. E 'più facile iniziare al bulbo olfattivo. Usare cautela in modo da non danneggiare l'ippocampo.
8. Orientare il tessuto in modo che l'ippocampo è ora rivolto verso l'alto. L'ippocampo può ora essere visto da sua caratteristica struttura a forma di C.
9. Utilizzando una pinza sottile, sezionare l'ippocampo. Raccogliere in un nuovo piatto 30 millimetri contenente fredda 1x HBSS.

5. Dissociazione Cellulare e placcatura

1. Contare il numero totale di ippocampi, poi tagliateli a pezzetti.
2. Raccogliere i pezzi in un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 3 ml 1x HBSS.
3. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e rimuovere con cura il supernatante.
4. Aggiungere 6 ml di tripsina per ippocampo.
5. Incubare per max 20 min a 37 ° C. Agitare dopo 3 min.
6. Lavare due volte con 5 ml di fresco freddo 1x HBSS e scartare il surnatante.
7. Dopo il second lavare, aggiungere 1,5 ml di mezzo di placcatura, pre-riscaldato a 37 ° C. Il siero nel mezzo di placcatura inattivare l'attività tripsina.
8. Lentamente triturare 30x con una pipetta Pasteur lucidati a fuoco fino a quando tutti i pezzi di tessuto sono omogeneamente dispersi in singole cellule. Evitare qualsiasi bubbling.
9. Aggiungere 5 ml di placcatura medio preriscaldata a 37 ° C.
10. Contare le cellule utilizzando un Trypan blu colorazione vitale.
11. Seed 50.000 cellule per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti in 1 ml di placcatura mezzo, preparati nella Sezione 2 (volume totale di 2 ml).
12. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule.
13. Incubare a 37 ° C, 5% CO _2. Dopo 2-3 giorni, sostituire la metà del mezzo placcatura (0,5 ml) con terreno di coltura contenente 10 mM FUDR.
    Nota: Dendritic di imaging della colonna vertebrale viene effettuata 16-17 giorni dopo la placcatura (16-17 giorni in vitro, DIV).

6. Rat ippocampale primaria Neuron Transfezione utilizzando Lipofectamine

1. Preparare plasmide DNA che esprime GFP e mezzo di incubazione (10 ml di mezzo Neurobasal con 100 ml di glutamax).
2. Pre-riscaldare il mezzo di incubazione a 37 ° C.
3. Preparare mix DNA (metro A). Per ogni vetrino aggiungere 1 mg di DNA in 100 ml di pianura medio Neurobasal. Mescolare delicatamente.
4. Preparare mix Lipofectamine (metro B). Per ogni vetrino aggiungere 2 ml Lipofectamine in 100 ml di pianura medio Neurobasal. Mescolare delicatamente.
5. Aggiungere la miscela Lipofectamine goccia a goccia alla miscela DNA.
6. Incubare nella cappa a flusso laminare per 30 minuti a temperatura ambiente.
7. Aggiungere 1 ml di terreno di incubazione pre-riscaldato alla piastra 1.
8. Conservare piastra 2 per 5 min a 37 ° C, 5% CO _2.
9. Aggiungere delicatamente goccia a goccia 200 ml di DNA / Lipofectamine mescolano in ciascun pozzetto e incubare per 45 min a 37 ° C, 5% di CO _2.
10. Con l'uso di piccole pinze sollevare il coverslips contenente i neuroni e li lavare immergendoli in un piatto 3 centimetri contenente fresco caldo medie Neurobasal e spostarli alla piastra 2.
11. Incubare i neuroni trasfettati a 37 ° C, 5% CO ₂ per 48 ore.
12. Controllare l'efficienza di trasfezione 24 ore dopo la trasfezione.

7. Immunostaining e del montaggio di ratto neuroni primari

Per migliorare l'intensità di fluorescenza in cellule trasfettate, eseguire un protocollo di immunocolorazione per migliorare il rilevamento GFP 48 ore dopo la trasfezione.

1. Preparare 4% PFA e 0,05 M TBS.
2. Riscaldare la soluzione PFA 4% a 37 ° C.
3. Aspirare delicatamente il terreno dai pozzetti contenenti le lamelle.
4. Aggiungere 500 ml di caldo 4% PFA con attenzione per evitare di danneggiare i dendriti.
5. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
6. Lavare con 1x HBSS 3 volte per 5 min.
   NOTA: a questo punto i campioni possono essere conservati fino a 3 settimane a 4 ° Co immunoistochimica può essere avviato immediatamente.
7. Se i campioni sono stati conservati, lavare con 0,05 M TBS 3 volte per 5 min.
8. Bloccare con la soluzione TBS-BSA (1%) a temperatura ambiente per 30 min.
9. Lavare con 0,05 M TBS 3 volte per 5 min.
10. Aggiungere l'anticorpo primario diluito in miscela di incubazione.
11. Incubare le piastre per 1 ora a temperatura ambiente.
12. Inoltre, incubare una notte a 4 ° C con un leggero scuotimento.
13. Rimuovere l'anticorpo primario.
14. Lavare con 0,05 M TBS 3x per 5 min.
    NOTA: da questo punto in poi, tenere i vetrini al riparo dalla luce.
15. Aggiungere l'anticorpo fluorescente coniugato secondario diluito in mix di incubazione.
16. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
17. Rimuovere l'anticorpo secondario.
18. Lavare con 0,05 M TBS 3 volte per 5 min.
19. Lavare con 1X TB 2 volte per 5 min.
20. Utilizzare le pinzette multa da rimuovere per vetrini dai pozzetti.
21. Asciugare ogni eccesso di TB con un tessuto e montare la coverslips con mezzo di montaggio.
22. Sigillare con smalto per evitare l'evaporazione del mezzo di montaggio.

8. Spine dendritiche Imaging utilizzando Struttura Illumination Microscopy

Dendritica di imaging spina dorsale usando il sistema SIM descritto nel materiale ha una risoluzione laterale (XY) valore di circa 85-110 nm e un valore assiale (Z) risoluzione tra 200-250 nm, fornendo un fattore di miglioramento 2 volte in risoluzione rispetto microscopia a grande campo.

NOTA: Dendritic immagini della colonna vertebrale utilizzando SIM viene fatto di solito due giorni dopo il passo 7.22, ma potrebbe essere fatto fino a 3 settimane più tardi se i campioni vengono tenuti al buio e sotto una temperatura controllata di 22-23 ° C.

1. Accendere il laser 488 nm, la lampada al mercurio, il controllore fase, il controller piezo, la lampada alogena per la luce trasmessa e il PC e avviare il software SIM in modalità "dell'ANDOR per N-SIM".
2. Pulire l'oggetto TIRF 100xive con etanolo al 95% per tre volte, e se necessario con etere di petrolio.
3. Utilizzare le seguenti impostazioni del filtro: 520 LP con 488 dicroico.
4. Mettere una goccia di olio di immersione sull'obiettivo. Verificare che non vi siano bolle d'aria nel-goccia di olio. Spostare l'obiettivo verso l'alto finché l'olio tocca il campione.
   Nota: Posizionare un coperchio sopra il palco per proteggere il campione dalla luce ambientale e abbassare le luci nella stanza più possibile.
5. Impostare il collare di correzione dell'obiettivo a 37 ° C, 200 micron, per ottenere la migliore simmetria del PSF. Per impostare la posizione del collare corretta, prima posizione l'anello obiettivo alla posizione nominale ottimale e quindi controllare un campione di cordone 100 nm. Secondo la simmetria il meglio del PSF, cambiare leggermente la posizione del collare attorno a quello nominale.
6. Per l'illuminazione, utilizzare 3D-SIM reticolo (3D 1layer 100X/1.49 tutte le lunghezze d'onda). Per iniziare il luogo allineamento reticolo blocco reticolo selezionato nell'illuminatore SIM, con la 100X 1.49 obiettivo posto. Utilizzare un campione tallone 100 nm montato in media, con una concentrazione che può consentire l'isolamento 10-15 perline per un campo di vista (FOV). Dopo aver impostato il collare di correzione obiettivo nella posizione desiderata, selezionare l'illuminazione 3D-SIM e avviare la procedura di allineamento guidata dal software. Verrà eseguito (5 fasi) x (1) direzione x (100 z-aerei) immagini, da cui sarà ricostruire il FOV con perline. Dopo aver selezionato un unico cordone attraverso un ROI adeguato, che copre l'intera tallone compresa la luce offuscata out-of-focus, il software si avvia un PSF automatico di raccordo e che consente di regolare la posizione di reticolo in base al risultato.
7. Per verificare le prestazioni del microscopio, ripetere l'allineamento reticolo ogni 2 settimane, a causa del possibile disallineamento causato da movimenti del tavolo e / o alla deriva di temperatura. Inoltre, controllare anche l'intensità del laser e la stabilità in base ai suggerimenti del produttore.
8. Pulire la superficie del campione con il 95% ethAnol tre volte.
   Nota: Per i prossimi passaggi vedi figura 3 per una panoramica dei pannelli di controllo e le impostazioni corrette nel software SIM.
9. Nel software SIM, selezionare la configurazione ottica FITC Eye e selezionare un blocco di filtro vuoto a Torretta 1 per l'ispezione visiva con luce bianca.
10. Impostare la velocità di messa a fuoco e la velocità di traslazione della tavola XY su "Fine".
11. Aprire l'otturatore e rapidamente concentrarsi sul campione.
12. Richiudere il pulsante di scatto e impostare la coordinata Z a zero.
13. Selezionare il filtro verde in Torretta 1 per l'ispezione visiva utilizzando il canale verde.
14. Impostare l'intensità della lampada al mercurio al valore più basso.
15. Spostare al confine del campione con attenzione, facendo in modo che l'obiettivo non tocchi il sigillante.
16. Aprire l'otturatore e rapidamente la scansione attraverso il campione con il più basso possibile intensità.
17. Dopo aver incontrato un dendrite sufficientemente luminosa di interesse e centraggio un segmento di interessenel campo di vista, chiudere l'otturatore.
18. Impostare il software di configurazione 3D Optical-SIM 488 e le impostazioni della fotocamera per leggere-out modalità di EM, guadagnare 1 MHz a 16 bit, tempo di esposizione di 100 msec, potenza del laser 5% e EM guadagnare 200.
    NOTA: Controllare che il filtro verde in torretta 2 è selezionata e che Turret 1 è vuoto.
19. Verificare che il reticolo sia impostato su 'Moving' e fare clic su Live per visualizzare il campione con luce laser e attraverso la fotocamera.
20. Attivare il Look Up Table.
21. Centrare l'oggetto di interesse, se necessario, e mettere a fuoco con la velocità di messa a fuoco è impostato su Extra Fine.
    NOTA: in modalità read-out EM guadagnare 1 MHz a 16 bit, l'intensità di destinazione per una buona immagine di SIM è tra 30,000-45,000.
22. Regolare rapidamente le impostazioni della fotocamera per ottenere un valore di intensità tra 30,000-45,000 in modalità read-out EM guadagnare 1 MHz a 16 bit. Inizialmente utilizzare:
    1. Potenza del laser: 0% - 20% (con campioni preparati come sopra descritto, 5% o 2,6 mW è sufficiente)
    2. Tempo di esposizione:50 msec-2 sec
    3. Modalità read-out: EM guadagnare 1 MHz a 16 bit
    4. EM guadagno: 0-300
    5. Guadagno di conversione: 1x - 5.1x
    6. Formato per Live: No binning
    7. Formato per Capture: No binning
       NOTA: con queste impostazioni 6,3% ± 1,3% sbiancamento è di routine raggiunto, entro un limite del 10% di accettabile sbiancamento massimo, che potrebbero influenzare significativamente la qualità dell'immagine ^15.
23. Fare clic su Stop per disattivare la visualizzazione Live.
24. Configurare le impostazioni dello stack Z 3D nel pannello Sequenza ND a:
    1. Range: 2 micron
    2. Imposta la dimensione: 120 nm
    3. Piano Z
    4. Clicca posizione di Home
    5. Selezionare la configurazione ottico 3D-SIM 488 nella sezione Lambda
25. Selezionare 3D-SIM come modalità di acquisizione del tappetino N-SIM.
26. Eseguire l'acquisizione Sequence ND e salvare i dati grezzi.
27. Selezionare nuovamente la configurazione ottica FITC Eye e ripetere i passaggi 8,15-8,27 fino a quando è stato ripreso l'intero campione
28. Ricostruzione 3D Image: I dati acquisiti nel passo 8.23 ​​possono sia essere ricostruiti subito o in seguito. Inizia ricostruendo lo stack Z con le impostazioni predefinite di ricostruzione in modalità Ricostruire Slice o ricostruire Stack e regolare se necessario.
    NOTA: per i migliori risultati, pile Z devono essere effettuate con il passo indicato e ricostruite nel modo Ricostruire Stack. Controllare sempre la validità della immagine ricostruita confrontandolo con i dati grezzi o, preferibilmente, un'immagine a grande campo. I parametri che possono essere regolati per il processo di ricostruzione sono il contrasto e la soppressione del rumore ad alta frequenza. Entrambi si influenzano come le diverse immagine proprietà greggio sono presi in considerazione durante il processo di ricostruzione. In caso di bassa profondità di modulazione di dati grezzi, il parametro contrasto gioca un ruolo importante. Se l'utente dispone di dati con un basso rapporto segnale-rumore, il parametro di soppressione del rumore ad alta frequenza può influenzare la qualità ricostruzione SEseveramente.
29. Quando imaging finito, centro XY e spostare l'obiettivo fino in fondo alla sua posizione di riposo.
30. Smontare e pulire il campione sia il campione e oggettivo con etanolo al 95%.
31. Arrestare il software e il PC e spegnere tutti gli altri dispositivi.
32. 3d ricostruzione e della colonna vertebrale classificazione delle immagini acquisite può essere effettuata dopo la conversione dei file TIFF come descritto prima di utilizzare software NeuronStudio (vedi Figura 4) ^16.
33. Utilizzare i seguenti parametri per la ricostruzione nel software NeuronStudios:
    1. Volume: Dimensioni Voxel: X: 0.03 micron; Y: 0.03 micron; Z: 0.120 micron.
    2. Rilevazione Dendrite: Allega rapporto: 1.3; Durata minima: 5 micron; Rapporto Discretizzazione: 1; Riallineare giunzioni: sì.
    3. Spine di rilevamento: Altezza minima: 0,2 micron; Altezza massima: 5.001 micron; Larghezza massima: 3 micron; Dimensione tozzo minima: 10 voxel; Dimensione minima non tozzo: 5 voxels.
    4. Spine Classifier: rapporto Neck (rapporto testa-collo): 1,1; Thin Rapporto: 2,5; Dimensione del fungo: 0,35 micron;
34. Parametri NeuronStudio utilizzati per il rendering: Forma vertice neuriti: eclipse solido; Colore neurite vertice: per tipo; Forma bordo neurite: line; Neurite colore del bordo: singolo colore; Spine forma: eclipse solido; Colore Spine: per tipo.
    Nota: Dopo la ricostruzione 3D è anche possibile impostare il volume di rendering. La soglia predefinita è stato impostato a 20 con l'opzione 'Rigenerare il volume di rendering' attivo. Opacità è stato fissato da 'Intensity Automatic' controllato. 'Solo superficiale' e le opzioni 'uso Point Pre-rendering' erano anche attivi

Representative Results

Qui descritto è un protocollo di lavoro standardizzato per l'imaging spine dendritiche di topo neuroni primari in vitro utilizzando SIM. Il flusso di lavoro protocollo ei suoi passi fondamentali sono illustrati nella Figura 1. Nel complesso, il protocollo richiede circa 2 settimane di lavoro sperimentale separate in una prima fase di preparazione del campione, compresi cultura, sviluppo e trasfezione di neuroni ippocampali di ratto primari e immunoistochimica e seconda fase dell'imaging campione utilizzando SIM. Il ratto neuroni primari sono fissati circa 2 settimane dopo l'inizio della cultura, quando i neuroni hanno sviluppato pergole dendritiche complesse tenendo numerose spine dendritiche ^3,5. Utilizzando il protocollo descritto in dettaglio nelle sezioni 1-8, è possibile sistematicamente immagine spine dendritiche con risoluzione super. In confronto con un metodo convenzionale di imaging spina dendritica utilizzando microscopio confocale a fluorescenza descritto prima ^16,17, il protocollo qui descritto utilizzando SIM fornisce significativamente migliore risoluzione delle immagini e ricostruzione 3D, permettendo l'identificazione e la classificazione dei neuroni protrusioni di membrana che vanno dai primi filipodia alle strutture della colonna vertebrale-like.

Figura 1. Lo schema mostra un flusso di lavoro di protocollo, i suoi passi e la tempistica.

Figura 2. Micrografie rappresentativi dei dendriti e spine dendritiche ripreso con confocale (A) e la microscopia SIM (B). Il microscopio SIM rappresentante stata acquisita come descritto nel capitolo 8, il microscopio confocale rappresentante è stato acquisito ucantare fisica dimensione foro stenopeico: 30 micron potenza del laser 2.6 mW, nessuna media. Le acquisizioni sono state ricostruite dalle immagini confocale e SIM (C e D, rispettivamente) che utilizzano il software NeuronStudio come descritto in precedenza ^16. Dendriti sono stati rintracciati e le spine sono stati classificati automaticamente con il software dopo la regolazione dei principali parametri quali la lunghezza del collo, diametro del collo e diametro della testa. Le aree in scatola mostrano una spina dendritica individuo ripreso con confocale (A) e SIM (B) e ricostruito dai loro corrispondenti stack Z (C e D), raffiguranti le differenze di risoluzione e precisione delle ricostruzioni in 3D che ne derivano. Secondo risoluzione maggiore di SIM, analisi quantitativa sia testa (E) e del collo (F) Diametro rivela che misure SIM dimensioni notevolmente ridotte rispetto microscopia confocale per le stesse spine dendritiche, indicando che SIM è in grado di rilevare variazioni minori in spine dendritiche morfologia. D ata in E e F sono normalizzati alle misure di riferimento confocale. I risultati sono presentati come media ± SD di tre spine dendritiche estratti da 5 segmenti dendritiche ripreso in entrambe le modalità microscopio confocale e SIM. Per il diametro del collo c'era una differenza significativa (p = 0,0049 **) tra confocale (100.0 ± 4,296 unità normalizzate) e SIM (50,61 ± 7,642 unità normalizzate) immagini, come testato con studenti t-test (E). Per il diametro della testa vi era una differenza significativa (p = 0,0209 *) tra confocale (100.0 ± 6,255 unità normalizzate) e SIM (58,12 ± 9,451 unità normalizzate) immagini, come testato con studenti t-test.

Figura 3. Screenshot da NIS Elements pacchetto software 6.14 SIM della Nikon con le impostazioni descritte in questo protocollo.

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Figura 4. Schermata NeuronStudio dalla ricostruzione 3D e software di classificazione spina dorsale di una immagine rappresentativa di un dendrite.

Tabella 1. Elenco dei reagenti. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

In questo articolo viene descritto un protocollo di lavoro di immagine spine dendritiche di topo neuroni primari in coltura in vitro utilizzando SIM. Il metodo di coltura neurone dell'ippocampo primaria è un adattamento del metodo originale descritto da Kaech e Banker ^18. Le differenze principali sono l'uso di Neurobasal/B27 terreno di coltura, che elimina la necessità di culture alimentazione astrogliali, e l'aggiunta del FUDR inibitore mitotico il giorno 3 che promuove la sopravvivenza neuronale sopprimendo la proliferazione gliale, come descritto da Brewer et al ^19.

Ci sono molti passaggi critici nel protocollo. Lo spessore del coprioggetto utilizzati per placcare le cellule è cruciale per un esperimento SIM accurato. Sterilità durante la preparazione vetrino e rivestimento è importante. Non lasciate che i vetrini poli-L-lisina trattati asciugare durante 2.3 e 2.4. Il diametro della pipetta lucidato fiamma utilizzato nel passo 5.8 è cruciale.Troppo stretto una punta comporterà vitalità cellulare partire in fasi successive. Isolamento delle ippocampi il più rapidamente possibile garantirà la vitalità delle cellule alta. I tempi di incubazione e le concentrazioni tripsina sono fondamentali per garantire la vitalità delle cellule elevata. Perdita di attività enzimatica tripsina può anche influenzare la vitalità cellulare. Infine, l'aggiunta di FUDR nel passo 5.14 è cruciale per promuovere la sopravvivenza dei neuroni e inibire la proliferazione gliale.

La fase di imaging campione è semplice se eseguita seguendo rigorosamente il protocollo descritto qui e risultati per l'acquisizione di immagini super-risoluzione che possono essere facilmente ricostruito in 3D per analizzare e classificare le spine dendritiche in base alle loro caratteristiche morfologiche. Come mostrato in Figura 2, la qualità delle immagini acquisite in modalità SIM è sostanzialmente migliore rispetto alle immagini di esattamente gli stessi segmenti dendritiche e singole spine acquisiti utilizzando la modalità confocale dello stesso microscopio. Questo risultato suggerisce that l'uso di SIM potrebbe fornire un'eccellente opportunità per un'immagine più sottili cambiamenti nelle spine dendritiche morfologia, come quantificato nelle figure 2E e 2F.

Finora, la maggior parte (fluorescente) microscopia a largo campo è stato utilizzato per le cellule vive di immagine, grazie alla sua bassa fototossicità. Allo stesso modo, grazie ai suoi bassi effetti fototossici e buona combinazione con i tradizionali fluophores (genetiche), SIM permette di cellule vive di immagini e identificazione delle spine dendritiche in bassa fluophore cellule che esprimono a super-risoluzione. In confronto ad altri metodi di microscopia super-risoluzione, come STED o PALM, SIM fornisce un metodo rapido e conveniente per l'imaging di spine dendritiche di topo neuroni primari in vitro. Anche se in pratica SIM aumenta solo la risoluzione per due volte rispetto alla microscopia confocale convenzionale.

Un esempio di una limitazione della SIM è che si basa sulla fluorescenza, che inalcuni apparati sperimentali possono essere difficili da applicare. A tal fine, tecniche di microscopia che non si basano su fluorescenza come la microscopia elettronica possono fornire una possibile soluzione. Tuttavia, microscopia elettronica in particolare è un noioso, costoso un metodo lento. Inoltre, microscopia elettronica può essere effettuato su campioni fissati. Pertanto, SIM è più adatto per super-risoluzione di immagini di cellule vive. Il razionale per l'applicazione di una proteina fluorescente plasmide codificante trasfezione è che si traduce in una scarsa, ma riproducibile etichettatura citoplasmatica di cellule isolate, evitando sovrapposizione di dendriti di cellule differenti e l'identificazione delle singole spine dendritiche. Combinazione di trasfezione con immunocolorazione è stato precedentemente dimostrato per incrementare la fluorescenza ^17. Tuttavia, altre tecniche di fluorescenza potrebbe essere applicata anche alla rappresentazione di spine dendritiche con SIM, ad esempio la colorazione fluorescente sufficiente potrebbe essere acquisita tramite recente desviluppata actina sonde vincolanti ^20.

Da recenti sviluppi tecnici hanno consentito l'applicazione di SIM per l'imaging cellulare dinamico, dimostrando che ad alta velocità microscopio strutturato illuminazione è capace di una risoluzione di 100 nm a frame rate fino a 11 Hz ^13, una futura applicazione molto logica del protocollo qui descritto potrebbe essere la sua applicazione di time-lapse SIM di primari di ratto neuroni dell'ippocampo dal vivo e l'analisi dei cambiamenti dinamici veloci in spine dendritiche morfologia. Una prossima sfida per questa applicazione potrebbe essere la fototossicità cumulativo atteso associato a lunghi intervalli di tempo della microscopia live.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fine forceps
Big forceps
Fine scissor
Big scissor
Blunt spatula
Dissecting microscope with illumination
Light microscope
37 °C water bath
Laminar flow cell culture hood
High-temperature dry-oven
Bunsen burner
Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C)
Microcentrifuge
Orbital shaker

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon structured illumination microscope setup consisting of:
Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49)
4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive piezo controller
Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp
SIM Microscope Enclosure temperature control
Andor EM-CCD Camera iXon DU897
PC with Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package
Nikon type A immersion oil