Summary
Este artigo descreve um protocolo de trabalho de imagem espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo in vitro utilizando Structured Illumination Microscopy (SIM). Microscopia Super-resolução usando SIM oferece resolução de imagem significativamente além do limite de difração da luz em todas as três dimensões espaciais, permitindo que a imagem de espinhas dendríticas individuais com maior pormenor.
Abstract
As espinhas dendríticas são saliências emergentes da dendrite de um neurónio e representam os alvos primários pós-sinápticos de entradas excitatórios no cérebro. Os avanços tecnológicos têm identificado estas estruturas como elementos-chave na conectividade neuronal e plasticidade sináptica. A análise quantitativa da morfologia da coluna usando microscopia de luz continua a ser um problema essencial, devido a limitações técnicas associadas limite intrínseco da refração da luz. Espinhas dendriticas podem ser prontamente identificados por microscopia de fluorescência confocal de varrimento laser. No entanto, medindo mudanças sutis na forma e tamanho de espinhos é difícil, porque outros do que o comprimento da coluna dimensões são geralmente menores do que a resolução óptica convencional fixada por limite de resolução teórico de microscopia de luz de 200 nm.
Várias técnicas de resolução de super recentemente desenvolvidos têm sido utilizados para imagem estruturas celulares menores do que os 200 nm, incluindo espinhas dendriticas. Tstas técnicas baseiam-se em operações de campo distante clássicos e, por conseguinte, permitir a utilização de métodos de preparação de amostras existentes e para além da imagem da superfície de uma amostra. Descrito aqui é um protocolo de trabalho para aplicar resolução estruturada microscopia de iluminação super (SIM) para a imagem das espinhas dendríticas em culturas de neurônios do hipocampo primários. Possíveis aplicações de SIM coincidir com os de microscopia confocal. No entanto, as duas técnicas apresentam aplicabilidade diferente. SIM oferece resolução lateral superior eficaz, ao passo que a microscopia confocal, devido ao uso de um orifício físico, atinge melhoria resolução à custa da remoção de luz fora de foco. Neste protocolo, neurónios primários são cultivadas em lamelas de vidro, utilizando um protocolo padrão, transfectados com os plasmídeos de DNA que codificam as proteínas fluorescentes e fotografadas usando SIM. Todo o protocolo aqui descrito leva aproximadamente duas semanas, porque espinhas dendríticas são visualizados após 16-17 dias in vitro, quandodesenvolvimento dendrítica é o ideal. Após a conclusão do protocolo, espinhas dendríticas pode ser reconstruído em 3D da série de pilhas de imagens do SIM usando software especializado.
Introduction
A espinha dendrítica é uma pequena saliência da membrana neuronal. Esta estrutura característica é especializada para receber normalmente a entrada de uma única sinapse e representa a área de contato físico entre os dois neurônios. A maioria das espinhas dendríticas funcionalmente maduros consistem em uma ponta globular, denominado cabeça e um pescoço fino que liga a cabeça ao eixo dendrítica. No entanto, as espinhas não são estáticos e mover e alterar a sua morfologia ainda continuamente no cérebro adulto 2 activamente. Dentro de um período de 2 semanas de tempo, ratos culturas de neurônios do hipocampo primários derivados de tempo pós-natal embrionária ou início de tarde desenvolver árvores dendríticas complexas com inúmeras saliências membrana que evoluem a partir de filipodia cedo para estruturas da coluna-como 3. Com base nesse comportamento dinâmico e outras características, espinhas dendríticas são pensados para proporcionar um substrato anatômico para o armazenamento de memória e 4,5 transmissão sináptica.
Dada ªe papel crítico que o tamanho da espinha dendrítica e forma têm em função sináptica, é importante para medir com precisão as suas dimensões. Espinhas variam de cerca de 200 a 2000 nanómetros de comprimento e pode ser facilmente identificado por microscopia de fluorescência confocal de varrimento laser. No entanto, outras dimensões do que o comprimento da coluna vertebral são geralmente abaixo de resolução dos sistemas ópticos convencionais, teoricamente fixo por difração de cerca de 200 nanômetros de 6. Esses poderes são insuficientes para resolver imaginando pequenos detalhes, como a largura da coluna pescoços e cabeças. Muito trabalho foi dedicado a resolver este problema e muitos relativamente novas técnicas de microscopia de super-resolução proporcionaram um progresso substancial. Em particular, é possível obter uma resolução para além do limite clássico sem descartar qualquer emissão de luz por meio de microscopia de iluminação estruturada lateralmente (SIM), numa vasta área, microscópio confocal não 7-10. Usando esta técnica, em combinação com os não-lineatécnicas de microscopia de r, que é teoricamente possível a melhorar a resolução lateral do microscópio óptico de um factor 11 ilimitado. No entanto, na maioria das circunstâncias experimentais, de SIM permite ultrapassar o limite de resolução por um factor de dois 1. Outros super-resolução técnicas de microscopia óptica, tais como esgotamento emissão estimulada (STED) microscopia 12 e microscopia localização foto-ativação (PALM) 12 foram aplicadas à imagem das espinhas dendríticas. Métodos baseados em localização, como PALM requerem um grande número de imagens raw para atingir super-resolução e, portanto, são limitados em velocidade. Por outro lado, STED pode alcançar alta velocidade de imagem, embora a contagem relativamente baixos de fótons e pequenos campos de visão, que podem não ser o caso do SIM 13.
Neste artigo, o objetivo é fornecer um protocolo de trabalho para imagem espinhas dendríticas de neurônios do hipocampo de ratos primários cultivados in vitro
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram otimizados para reduzir o sofrimento dos animais e foram aprovados pela Comissão de Experimentação Animal da Universidade de Amsterdã, DEC protocolo # DED204 e DED250.
1. Coverslip Preparação
- Corta-se as lamelas a um tamanho de 15 mm x 15 mm utilizando um carboneto ou escriba de diamante, de modo a que eles se encaixam nas cavidades de uma placa de 12 poços.
- Enquanto trabalhava em um exaustor, comece revestimento lamela submergindo totalmente lamelas em solução de ácido nítrico concentrado (70% p / p) em um recipiente de vidro. Para assegurar uma distribuição de trepidação, depois incubar por um período mínimo de 4 horas. É possível reutilizar a solução de ácido nítrico concentrado durante cerca de 2 vezes, mas pode perder a cor por exposição à luz.
- Remover a solução de ácido nítrico concentrado e lava-se as lamelas quatro vezes em água destilada durante 30 minutos, agitando cuidadosamente após cada lavagem.
- Com cuidado retire oágua.
Nota: os próximos três etapas são realizadas em um estéril câmara de fluxo laminar. - Mergulhe as lamelas em 96% EtOH. Retirar as lamelas da solução de EtOH e deixe-os secar.
- Inflamar as lamelas e colocá-los em um recipiente de vidro. Use uma pinça fina para lidar com as lamelas (fórceps no.5 estilo Dumont, por exemplo).
- Cubra o recipiente com papel alumínio e asse em forno de calor seco para 12-16 horas a 180 ° C. Lamelas cozidas podem ser armazenados em temperatura ambiente por até 1 mês, se cobriu com força.
2. Coverslip Coating
O procedimento de revestimento lamela favorece neurónio fixação à superfície do vidro e arborização dendrítica 14.
- Em um capuz laminar estéril, use pequenas pinças esterilizadas para colocar as lamelas individuais em poços individuais de uma placa de 12 poços.
- Adicionar 500 mL de poli-L-lisina solução (ou uma quantidade suficiente para submergir as lamelas).
- Enrole tele placa em folha de alumínio para evitar a evaporação e deixá-lo durante a noite à temperatura ambiente.
- Antes de iniciar a cultura, aspirar o-Poly L-lisina solução cuidadosamente em uma capa laminar estéril.
- Lavar cada poço com 1 ml de água esterilizada, duas vezes, enquanto que os impede de secar.
- Aspirar água completamente, adicionar 1 ml de chapeamento de médio e deixar as lamelas na cultura de tecidos incubadora até que esteja pronto para a chapa das células. Recomenda-se para a placa das células dentro de 24 horas.
3. Remoção dos cérebros de rato E16-E19 Embriões
- Esterilizar os instrumentos cirúrgicos por aquecimento em estufa seca durante a noite ou lavá-las com etanol 70%. Seque bem se EtOH é usado.
- Preparar vários pratos de 30 mm com 1x tampão HBSS e mantê-los em gelo.
- Eutanásia barragem ratos com uma injecção intraperitoneal de Euthasol (160 mg / kg Euthasol em um volume de ± 0,4 ml).
- Verifique se há ausência de reflexos.
- Pulverizar o abdômen da barragem com etanol 70%.
- Faça uma incisão ao longo do abdômen e retirar o útero.
- Retire os embriões do útero e colocá-los em um diâmetro de 100 mm placa de Petri.
- Retire as cabeças dos embriões com grandes tesoura e coloque as cabeças em uma nova placa de petri contendo 1x tampão HBSS frio.
Nota: a partir daqui para o passo 7.1 do processo é realizado sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. - Mantenha pressionada a cabeça ao longo dos lados com grandes pinças.
- Com uma tesoura pequena, faça um corte sagital na pele em cima da cabeça, em seguida, lateralmente descascar a pele para baixo com um grande fórceps.
- Utilizar a mesma abordagem tal como no passo 3.10 a remover o crânio. Faça um corte sagital a partir do final caudal; abrindo suavemente o crânio, sem danificar o tecido cerebral. Dobrar as duas metades do crânio afastado lateralmente, expondo o cérebro.
- Com a espátula sem corte, retire o cérebro e colocá-lo em fresco frio 1x HBSS. 4. Dissecção dos hipocampos
- Remova e descarte o cerebelo com a tesoura fina.
- Separe os dois hemisférios do cérebro por meio de corte sagital ao longo da linha média.
- Tome cada hemisfério e coloque ambos em um novo prato 30 milímetros contendo fresco frio 1x HBSS.
- Colocar cada hemisfério de tal modo que o lobo temporal está virado para o fundo do prato.
NOTA: A partir daqui, é recomendado o uso de um microscópio de dissecação. - Gentilmente segure o mesencéfalo usando um pequeno fórceps e remova o mesencéfalo com outro par de fórceps. Adicione o restante do hemisfério intacto contendo o córtex e o hipocampo.
- Virar o tecido, de modo que o hipocampo é agora virada para o fundo do prato.
- Gentilmente segure o hemisfério em prendas com uma pinça fina. Usando outro pinça fina, com cuidado e retire cuidadosamente as meninges. É mais fácil começar no bulbo olfatório. Tenha cuidado para não danificar o hipocampo.
- Posicione o tecido de modo que o hipocampo está agora virada para cima. O hipocampo pode agora ser visto por sua característica estrutura em forma de C.
- Usando uma pinça fina, dissecar o hipocampo. Recolha-o em um novo prato 30 milímetros contendo fresco frio 1x HBSS.
- Contar o número total de hipocampos, então corte-os em pedaços pequenos.
- Recolher as peças num tubo de centrífuga de 15 ml contendo 3 ml de 1x HBSS.
- Centrifugar a 300 xg durante 5 min e remover cuidadosamente o sobrenadante.
- Adicionar 6 mL de tripsina por hipocampo.
- Incubar durante 20 min no máximo a 37 ° C. Agitar após 3 min.
- Lave duas vezes com 5 ml de fresco frio 1x HBSS e descartar o sobrenadante.
- Depois de o montnd lavar, adicionar 1,5 ml de meio de plaqueamento, pré-aquecido a 37 ° C. O soro no meio chapeamento irá inativar a atividade de tripsina.
- Lentamente triturar 30x com uma pipeta Pasteur polida-fogo até que todos os pedaços de tecido são homogeneamente dispersos em células individuais. Evite qualquer borbulhante.
- Adicionar 5 ml de meio de plaqueamento pré-aquecido a 37 ° C.
- Contar as células usando uma coloração vital azul de Tripan.
- Semente de 50.000 células por poço de uma placa de 12 poços em 1 ml de meio de chaparia, preparados na Secção 2 (volume total de 2 ml).
- Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente as células.
- Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. Depois de 2-3 dias, substituir metade do meio de plaqueamento (0,5 ml) com meio de cultura contendo 10 ^ M FUDR.
Nota: imagem espinha dendrítica é realizada 16-17 dias após o plaqueamento (16-17 dias in vitro, DIV). - Preparar DNA de plasmídeo expressando GFP e meio de incubação (10 ml de meio Neurobasal com 100 ul de glutamax).
- Pré-aquecer o meio de incubação a 37 ° C.
- Prepare mistura DNA (tubo A). Para cada lamela adicionar 1 mg de DNA em 100 ul de meio Neurobasal simples. Misture suavemente.
- Prepare mix Lipofectamina (tubo B). Para cada lamela adicionar 2 mL Lipofectamina em 100 ul de meio Neurobasal simples. Misture suavemente.
- Adicionar a mistura de Lipofectamine gota a gota à mistura de ADN.
- Incubar na câmara de fluxo laminar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 1 ml de meio de incubação pré-aquecido para a chapa 1.
- Placa da loja 2 durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Adicionar cuidadosamente gota a gota 200 ul de ADN / Lipofectamina misturar a cada poço e incubar durante 45 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Com o uso de uma pequena pinça levantar o coverslips contendo os neurônios e lavá-los mergulhando-os em um prato de três centímetros contendo meio Neurobasal quente fresco e movê-los para a chapa 2.
- Incubar os neurónios transfectadas a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
- Entrada para a eficiência de transfecção de 24 horas após a transfecção.
- Prepare PFA a 4% e 0,05 M TBS.
- Aquece-se a solução de 4% de PFA a 37 ° C.
- Suavemente aspirar o meio dos poços contendo as lamelas.
- Adicionar 500 mL de quente 4% PFA com cuidado para evitar danificar os dendritos.
- Incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar com HBSS 1x 3 vezes por 5 min.
NOTA: neste momento amostras podem ser armazenadas até 3 semanas a 4 ° Cou immunostaining pode ser iniciado imediatamente. - Se as amostras foram armazenadas, lava-se com 0,05 M TBS 3 vezes durante 5 min.
- Bloco com solução de TBS-BSA (1%) à temperatura ambiente durante 30 min.
- Lavar com TBS 0,05 M 3 vezes por 5 min.
- Adicionar o anticorpo primário diluído em mistura de incubação.
- Incubar as placas durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Além disso, a incubar durante a noite a 4 ° C com agitação suave.
- Remover o anticorpo primário.
- Lava-se com 0,05 M TBS 3x durante 5 min.
NOTA: a partir deste ponto, mantenha as lamelas protegido da luz. - Adicionar o anticorpo secundário conjugado fluorescente diluído em mistura de incubação.
- Incubar à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Remover o anticorpo secundário.
- Lavar com TBS 0,05 M 3 vezes por 5 min.
- Lavar com 1X TB 2 vezes por 5 min.
- Use uma pinça fina para remover a lamelas dos poços.
- Seque o excesso de TB com um lenço de papel e monte o coverslips utilizando meio de montagem.
- Selo com unha polonês para evitar a evaporação do meio de montagem.
- Ligue o laser de 488 nm, a lâmpada de mercúrio, o controlador de fase, o controlador de piezo, a lâmpada de halogéneo por luz transmitida eo PC e inicie o software SIM no modo "ANDOR para N-SIM".
- Limpe o objeto TIRF 100xive com etanol 95% três vezes, e se necessário com éter de petróleo.
- Use as seguintes configurações de filtro: 520 LP com uma dicróica 488.
- Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o objectivo. Verifique se não há bolhas de ar no óleo soltar. Mover o objectivo para cima até que o óleo atinge a amostra.
Nota: Coloque a cobertura sobre o palco para proteger a amostra da luz ambiente e diminua as luzes da sala, tanto quanto possível. - Coloque o anel de correção do objetivo de 37 ° C, 200 mM, para obter a melhor simetria de PSF. A fim de definir a posição de colarinho correto, a primeira posição do anel de objetivo na posição nominal ideal e, em seguida, verifique uma amostra talão 100 nm. De acordo com a simetria do melhor PSF, alterar um pouco a posição de um colar em volta do nominal.
- Para a iluminação, usar o 3D-SIM grade (3D 1layer 100X/1.49 todos os comprimentos de onda). Para começar o lugar alinhamento grade do bloco grade selecionada para o iluminador SIM, com o 100X 1,49 objetivo no lugar. Use uma amostra do grânulo 100 nm montado nos meios de comunicação, com uma concentração que pode permitir isolar 10-15 contas para um campo de visão (FOV). Depois de definir o colar objetivo de correção para a posição desejada, selecione a iluminação 3D-SIM e iniciar o procedimento de alinhamento guiada por software. Ele será executado (5 fases) x (1 direção) x (100 z-aviões) imagens, a partir do qual ele vai reconstruir o FOV com miçangas. Depois de selecionar uma única gota através de um ROI adequado, cobrindo todo o cordão incluindo a luz turva fora de foco, o software irá iniciar um PSF automático montagem e ele irá ajustar a posição de grade de acordo com o resultado.
- Para verificar o desempenho do microscópio, repita o alinhamento de grade a cada 2 semanas, por causa do possível desalinhamento causado por movimentos de mesa e / ou temperatura deriva. Além disso, verifique também a intensidade do laser e de estabilidade de acordo com as sugestões do fabricante.
- Limpe a superfície da amostra com 95% de ethanol três vezes.
Nota: Para os próximos passos ver figura 3 para uma visão geral dos painéis de controle e as configurações corretas dentro do software SIM. - No software SIM, selecione a configuração óptica Eye FITC e selecione um bloco de filtro vazio na Torre 1 para inspeção visual com luz branca.
- Defina a velocidade do foco e da velocidade de deslocamento da tabela XY para "Fine".
- Abra o obturador e rapidamente se concentrar na amostra.
- Feche o obturador de novo e definir o Z-coordenar a zero.
- Selecione o filtro verde na Torre 1 para inspeção visual utilizando o canal verde.
- Definir a intensidade da lâmpada de mercúrio para a configuração mais baixa.
- Mover-se para a fronteira da amostra com cuidado, certificando-se de que o objetivo não toca o selante.
- Abra o obturador e rapidamente fazer a varredura através da amostra com a menor intensidade possível.
- Ao encontrar um dendrito suficientemente brilhante de interesse e de centralização de um segmento de interesseno campo de visão, a fechar o obturador.
- Defina o software de configuração óptica 3D-SIM 488 e as configurações da câmera para ler-out modo EM, ganha 1 MHz de 16 bits, o tempo de exposição de 100 ms, a potência do laser 5% e EM ganhar 200.
NOTA: Verifique se o filtro verde na Torre 2 está selecionado e que Turret 1 está vazio. - Verifique se a grade é definida como 'Mudar' e clique em Live para ver a amostra com luz laser e através da câmera.
- Ative o Up Table Veja.
- Centralize o objeto de interesse, se necessário, e concentrar-se com a velocidade com foco definido para Belas Extra.
NOTA: no modo de leitura-out EM ganha 1 MHz 16-bit, a intensidade alvo de uma imagem de boa SIM-se entre 30,000-45,000. - Ajustar rapidamente as configurações da câmera para obter um valor de intensidade entre 30,000-45,000 no modo read-out EM ganha 1 MHz de 16 bits. Inicialmente usar:
- Potência do laser: 0% - 20% (com amostras preparadas como descrito acima, de 5% ou de 2,6 mW é suficiente)
- Tempo de exposição:50 mseg-2 seg
- Modo de leitura-out: EM ganha 1 MHz 16-bit
- EM ganhar: 0-300
- Ganho de conversão: 1x - 5.1x
- Formato para o Live: Não binning
- Formato para captura: No binning
NOTA: com essas configurações de 6,3% ± 1,3% de branqueamento é rotineiramente alcançados, dentro de um limite de 10% de clareamento máximo aceitável, o que poderia afetar de forma significativa a qualidade da imagem 15.
- Clique em Parar para desligar vista ao vivo.
- Defina as configurações da pilha 3D Z no painel Sequence ND para:
- Faixa: 2 m
- Defina o tamanho: 120 nm
- Plano Z
- Clique posição inicial
- Selecione a configuração óptica 3D-SIM 488 na seção Lambda
- Selecione 3D-SIM, como o modo de aquisição no bloco N-SIM.
- Executar a aquisição Sequence ND e salvar os dados brutos.
- Selecione a configuração Optical Eye FITC novamente e repita os passos de 8,15-8,27 até que toda a amostra foi fotografada
- Reconstrução 3D Image: Os dados adquiridos na etapa 8.23 pode ser reconstruído imediatamente ou mais tarde. Comece por reconstruir a pilha Z com as configurações padrão de reconstrução no modo Reconstruir Slice ou Reconstruir Stack e ajustar se necessário.
NOTA: para obter melhores resultados, pilhas Z deve ser feita com o tamanho do passo indicado e reconstruído no modo Reconstruir Stack. Sempre verificar a validade da imagem reconstruída, comparando-a com os dados em bruto ou, de preferência, uma imagem de campo amplo. Os parâmetros que podem ser ajustados para o processo de reconstrução são o contraste ea supressão de ruído de alta freqüência. Ambos influenciam a forma como diferentes propriedades de imagem RAW são levados em conta durante o processo de reconstrução. Em caso de baixa profundidade de modulação de dados brutos, o parâmetro de contraste desempenha um papel importante. Se o usuário tiver conjuntos de dados com uma baixa relação sinal-ruído, então o parâmetro de supressão de ruído de alta frequência podem influenciar a qualidade de reconstrução severely. - Quando imagens em acabado, o centro de estágio XY e mova o objetivo todo o caminho até à sua posição de repouso.
- Desmontar a amostra e limpar tanto a amostra como objectivo, com etanol a 95%.
- Encerre o software eo PC e desligue todos os outros dispositivos.
- Reconstrução e espinha classificação 3d das imagens adquiridas podem ser realizadas depois de converter os arquivos para TIFF como descrito antes de usar software NeuronStudio (ver Figura 4) 16.
- Utilize os seguintes parâmetros para a reconstrução no software NeuronStudios:
- Volume: dimensões Voxel: X: 0,03 m; Y: 0,03 m; Z: 0,120 m.
- Detecção Dendrite: Anexar ratio: 1,3; Comprimento mínimo: 5 mm; Razão Discretização: 1; Realinhar junções: sim.
- Espinha de detecção: Altura mínima: 0,2 m; Altura máxima: 5.001 m; Largura máxima: 3 mM; Tamanho atarracado mínima: 10 voxels; Tamanho mínimo não atarracado: 5 voxels.
- Espinha Classificador: relação Neck (relação cabeça-pescoço): 1,1; Proporção fina: 2,5; Tamanho Cogumelo: 0,35 m;
- Parâmetros utilizados para a prestação de NeuronStudio: forma vértice Neurite: eclipse sólido; Cor neurite vértice: por tipo; Forma borda neurite: linha; Cor da borda de neurite: única cor; Espinha forma eclipse sólidos; Cor Spine: por tipo.
Nota: Após a reconstrução 3D é também possível ajustar o volume de render. O limite padrão foi definido para 20 com a opção 'Regenerar o volume rendering "ativo. Opacidade foi criado por 'Intensidade Automatic' marcada. "Superfície só 'e as opções' Use ponto pré-renderização 'também foram ativos
É muito importante que a dissecção é feita tão rapidamente quanto possível, em condições estéreis, para assegurar a viabilidade das células. Mantenha as amostras de frio no gelo.
5. Dissociação celular e chapeamento
6. Rat Hippocampal primária Neuron transfecção utilizando Lipofectamina
7. Imunocoloração e montagem de Rato hipocampo primárias Neurônios
Para melhorar a intensidade de fluorescência em células transfectadas, executar um protocolo de imunocoloração para melhorar a detecção de GFP 48 h após a transfecção.
8. Dendríticas Spine imagem usando Estrutura Illumination Microscopy
Imagiologia espinha dendrítica utilizando o sistema SIM descrito nos materiais tem uma resolução lateral valor (XY) de aproximadamente 85-110 nm e um valor axial (Z) resolução entre 200-250 nm, proporcionando um factor de 2 vezes de melhoria em relação ao resolução microscopia de campo amplo.
NOTA: imagem espinha dendrítica usando SIM é feito normalmente de 2 dias após passo 7,22, mas poderia ser feito até 3 semanas mais tarde, se as amostras são mantidas no escuro e sob uma temperatura controlada de 22-23 ° C.
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Representative Results
Descrito aqui é um protocolo de trabalho padronizado para imagens espinhas dendríticas de neurônios do hipocampo de ratos primários in vitro utilizando SIM. O fluxo de trabalho de protocolo e os seus passos cruciais são mostrados na Figura 1. Geral, o protocolo de demora cerca de 2 semanas de trabalho experimental separadas numa primeira fase de preparação da amostra, incluindo a cultura, o desenvolvimento e a transfecção de neurónios do hipocampo de rato primários e imuno-histoquímica, e segunda fase de imagens de amostra usando SIM. Os neurônios do hipocampo de ratos primários são fixas cerca de 2 semanas após o início da cultura, quando os neurônios desenvolveram árvores dendríticas complexos tendo inúmeras espinhas dendríticas 3,5. Usando o protocolo descrito em detalhe nas secções 1-8, é possível sistematicamente imagem espinhas dendriticas com super-resolução. Em comparação com um método de imagem espinha dendrítica convencional, utilizando microscopia de fluorescência confocal que é descrito antes de 16,17, o protocolo aqui descrito usando SIM fornece significativamente melhor resolução de imagem e reconstrução 3D, permitindo a identificação e classificação das saliências da membrana do neurônio que variam de filipodia cedo para estruturas da coluna vertebral-like.
Figura 1. O esquema mostra um workflow protocolo, seus passos e tempo.
Figura 2. Micrografias representativas dos dendritos e espinhas dendríticas fotografada com confocal (A) e microscopia SIM (B). A micrografia SIM representante foi adquirido como descrito no capítulo 8, a micrografia confocal representante foi adquirida ucantar tamanho pinhole física: 30 mm potência do laser 2,6 mW, sem média. Aquisições foram reconstruídos a partir de imagens confocal e SIM (C e D, respectivamente) usando o software NeuronStudio como descrito anteriormente 16. Dendritos foram localizados e as espinhas foram classificados automaticamente com o software depois de ajustar os principais parâmetros tais como o comprimento do pescoço, diâmetro do colo e diâmetro da cabeça. As áreas em caixa mostrar uma espinha dendrítica indivíduo fotografada com confocal (A) e SIM (B) e reconstruído a partir de suas respectivas pilhas Z (C e D), descrevendo as diferenças de resolução e precisão das reconstruções 3D resultantes. De acordo com a resolução mais alta do SIM, análise quantitativa de ambos cabeça (E) e pescoço (F) diâmetro revela que mede SIM dimensões significativamente menores do que a microscopia confocal para os mesmos espinhas dendríticas, indicando que SIM é capaz de detectar pequenas mudanças na morfologia espinha dendrítica. D ata em E e F são normalizados para as medições de referência confocal. Os resultados são apresentados como média ± SD de três espinhas dendríticas extraídas de 5 segmentos dendríticas fotografada em ambos os modos de microscópio confocal e SIM. Para diâmetro pescoço havia uma diferença significativa (p = 0,0049 **) entre confocal (100,0 ± 4,296 unidades normalizadas) e SIM (50,61 ± 7,642 unidades normalizadas) imagens, como testado com uma t-teste Estudantes (E). Para diâmetro de cabeça havia uma diferença significativa (p = 0,0209 *) entre confocal (100,0 ± 6.255 unidades normalizadas) e SIM (58,12 ± 9,451 unidades normalizadas) imagens, como testado com uma t-teste Estudantes.
Figura 3. Screenshot do NiS Elements pacote de software 6.14 SIM da Nikon com as configurações descritas neste protocolo.
Figura 4. Tela de reconstrução NeuronStudio 3D e software de classificação da coluna de uma imagem representativa de um dendrito.
Tabela 1. Lista de reagentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste artigo um protocolo de trabalho para imagem espinhas dendríticas de neurônios do hipocampo de ratos primários cultivados in vitro utilizando SIM é descrito. O método de cultura de neurônios do hipocampo principal é uma adaptação do método original descrito por Kaech e Banker 18. As principais diferenças são a utilização de meio de cultura Neurobasal/B27, o que elimina a necessidade de culturas astrogliais alimentadoras, e a adição do inibidor mitótico FUDR no dia 3, que promove a sobrevivência neuronal, enquanto suprime a proliferação glial, como descrita por Brewer et ai 19.
Há muitos passos críticos no protocolo. A espessura das lamelas utilizados para a chapa das células é essencial para um ensaio exacto de SIM. Esterilidade durante a preparação lamela e revestimento é importante. Não deixe lamelas de poli-L-lisina-tratados secar durante 2.3 e 2.4. O diâmetro da pipeta polida à chama utilizada no passo 5.8 é crucial.Muito estreita uma dica irá resultar em baixa viabilidade das células em fases posteriores. Isolamento dos hipocampos o mais rápido possível vai garantir a viabilidade das células de altura. O tempo de incubação e as concentrações de tripsina são cruciais para garantir a viabilidade das células de altura. A perda de atividade enzimática de tripsina também podem afetar a viabilidade celular. Finalmente, a adição de FUDR no passo 5.14 é crucial para promover a sobrevivência de neurónios e inibir a proliferação glial.
A fase de imagem da amostra é simples quando realizado seguindo rigorosamente o protocolo descrito aqui e resulta na aquisição de imagens de super-resolução que podem ser facilmente reconstruído em 3D para analisar e classificar espinhas dendríticas de acordo com suas características morfológicas. Como mostrado na Figura 2, a qualidade das imagens adquiridas no modo SIM é substancialmente melhor do que as imagens de exactamente os mesmos segmentos dendríticas e as espinhas individuais adquiridos utilizando o modo confocal da mesma microscópio. Este resultado sugere that o uso de SIM pode fornecer uma excelente oportunidade de imagem mais do que mudanças sutis na morfologia espinha dendrítica, como quantificados nas Figuras 2E e 2F.
Até agora, na maior parte de microscopia de campo amplo (fluorescente) foi utilizado para as células vivas da imagem, devido à sua baixa fototoxicidade. Da mesma forma, devido aos seus baixos efeitos phototoxic e boa combinação com (genéticas) fluophores convencionais, o SIM permite que as células vivas de imagem e identificação das espinhas dendríticas em baixo fluophore expressando células de super-resolução. Em comparação com outros métodos de microscopia de super-resolução, como STED ou PALM, SIM fornece um método rápido e acessível para a imagem das espinhas dendríticas de neurônios do hipocampo de ratos primários in vitro. Embora na prática SIM só aumenta resolução por duas vezes em comparação com a microscopia confocal convencional.
Um exemplo de uma limitação do SIM é que ele se baseia na fluorescência, em quealgumas configurações experimentais pode ser difícil de aplicar. Para este fim, as técnicas de microscopia que não dependem de fluorescência, tais como a microscopia de electrões pode proporcionar uma solução possível. No entanto, microscopia eletrônica, em especial, é um cara um método tedioso, lento. Além disso, a microscopia electrónica só pode ser realizada em amostras fixadas. Portanto, SIM é mais adequado para super-resolução de imagem de células vivas. A base racional para a aplicação de uma proteína fluorescente plasmídeo de transfecção é que resulta numa escassa, ainda reprodutível rotulagem citoplasmática de células isoladas, evitando a sobreposição dos dendritos de células diferentes, e a identificação das espinhas dendriticas individuais. Combinação de transfecção com imunocoloração foi mostrado anteriormente para aumentar a fluorescência 17. No entanto, outras técnicas fluorescentes também poderia ser aplicável à imagem das espinhas dendríticas com SIM, por exemplo, coloração fluorescente suficiente poderia ser adquirida usando recentemente desdesenvolvidos actina sondas de ligação 20.
Desde desenvolvimentos técnicos recentes têm permitido a aplicação de SIM para imagens de células dinâmica, demonstrando que a alta velocidade-iluminação estruturada microscópio é capaz de uma resolução de 100 nm a taxas de quadros até 11 Hz 13, um aplicativo futuro muito lógica do protocolo aqui descrito poderia ser a sua aplicação para time-lapse SIM de rato primários neurônios do hipocampo ao vivo ea análise de mudanças dinâmicas rápidas na morfologia espinha dendrítica. Um próximo desafio para esta aplicação poderia ser a fototoxicidade acumulado esperado associado com longos intervalos de tempo de microscopia ao vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma H64.09.016 VIDI número de concessão da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO) para CPF. CPF é grato ao Dr. Silvina A. Fratantoni por seus comentários críticos e correções sobre o manuscrito final. GMRDL / Emmm são suportados pelo holandês Tecnologia Fundação STW (12151 projeto e 11350), que faz parte da NWO, e que é parcialmente financiado pelo Ministério dos Assuntos Económicos. Agradecemos a Catherine Cristóvão e Peter Drent da Nikon Instruments Europe BV para a assistência e apoio. HX foi apoiado pela Royal Dutch Academia de Artes e Ciências (concessão 11CDP10) e WT foi apoiado pela concessão da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (concessão 820.02.006).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
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