Summary
Dendritiska celler (DC) utsöndrar IL-1β som svar på TLR8 erkännande av syntetisk purin, R848, följt av NLRP3 inflamma aktivering med nigericin därför IL-1β kan användas för att mäta NLRP3 inflamma aktivitet. Intracellulär cytokin färgning, immunoblotting, och ELISA används för att noggrant mäta NLRP3 inflamma priming och aktivering via IL-1β uttryck.
Abstract
Inflammatoriska processer till följd av utsöndring av interleukin (IL) -1 familje cytokiner av immunceller leder till lokal eller systemisk inflammation, vävnadsombildning och reparationer, och virologisk kontroll 1, 2. Interleukin-1β är en viktig del av det medfödda immunförsvaret och bidrar till att eliminera invaderande patogener samtidigt förhindra etableringen av ihållande infektion 1-5.
Inflammasomes är nyckeln signaleringsplattform för aktivering av interleukin-1-omvandlande enzym (ICE eller Caspase-1). NLRP3 inflamma kräver minst två signaler i DCs att orsaka IL-1β sekre 6. Pro-IL-1β-proteinuttryck är begränsat i vilande celler; därför en priming signal krävs för IL-1β-transkription och proteinuttryck. En andra signal som avkänns av NLRP3 resulterar i bildningen av den av flera protein NLRP3 inflamma. Förmågan hos dendritceller att ansvarigtd till de signaler som krävs för IL-1β-utsöndring kan testas med användning av en syntetisk purin, R848, som avkänns av TLR8 i human monocyt-härledda dendritiska celler (moDCs) att prima celler, följt av aktivering av NLRP3 inflamma med bakteriellt toxin och kalium jonofor, nigericin.
Härstammar från monocyter DCs lätt produceras i kultur och ger betydligt fler celler än renade human myeloid DC. Den metod som presenteras här skiljer sig från andra inflamma analyser genom att den använder in vitro människa, i stället för mus härledd, DCs vilket möjliggör studier av inflamma i human sjukdom och infektion.
Introduction
Aktivering av medfödda immunsystemet krävs för att styra adaptiva immunsvaret vid infektion, sjukdom och vaccination 7. Dendritiska celler är de mest potenta antigenpresenterande celler av det medfödda immunsystemet; De är specialiserade för upptag av antigener, migration till lymfkörtlar, och aktivering av naiva CD4 + och cytolytiska CD8 + T-celler 8-10. För att möjliggöra snabb upptäckt patogen det medfödda immunsystemet utnyttjar många könsceller kodad mönsterigenkänningsreceptorer (PRR) som känner igen bevarade patogen härrör motiv eller värd härrör markörer för cell stress och skador. Toll liknande receptorer (TLRs) är membranbundna mönsterigenkännings receptorer som känner igen vissa cellulära fagocytiserade patogener associerade molekylära mönster (PAMPs) och fara molekylära mönster (dämpas). Däremot nicka liknande receptorer (NLRs) är cytosoliskt och svara på en rad olika PAMPs och dämpar. Nicka liknande receptorer relägga fram en andra försvarslinje mot patogener som undgå cellytan och endocytiska PRRs. Interaktionen av patogenen härleds, eller "fara" associerat, faktorer med TLR och NLR ligander leder till ett tillstånd av DC-mognad leder till ökad DC interaktion med andra immunceller och främjande av T-cell-och naturliga mördarcellaktivering 11.
Interleukin-1β är en avgörande komponent i infektionsförsvaret. Vid erkännande av en mikroorganism, den starkt proinflammatoriska cytokiner, IL-1β, utsöndras och fungerar som en cellgifter lockmedel och aktivator av medfödda och adaptiva immunceller. In vivo IL-1β är till stor del ansvarig för den akuta fasen svaret inklusive feber och inflammatoriska cytokiner syntes 12.
De flesta NLRs innehålla en C-terminal leucin-rika upprepningsdomän som är tänkt att fungera i ligand-avkänning, en central nukleo-bindningsdomän (NACHT) som är important för NLRP3 oligomerisering, och en N terminal effector domain (PYD i NLRP3) som medierar signaltransduktion till mål nedströms genom protein-proteininteraktioner. NLRP3 proteinet definierar mest intensivt studerade inflamma komplex. Detta protein är en medlem av NLR familjen och har förmågan att bilda en multi molekylproteinkomplex bestående av NLRP3, adapterprotein PYCARD (även känd som ASC) och is. Vid inflamma aktivering PYCARD binder till NLRP3 N terminalområden och rekryterar ICE via kaspasaktivering och rekryteringsdomän (CARD) domäner. Interleukin-1-omvandlande enzym initialt genererad som en zymogen innehållande en CARD-motivet vid dess N-terminal. Inflammabildning leder föra två ICE molekyler tillräckligt nära för att framkalla deras autokatalytisk aktivering. Det inflamma komplex är nödvändigt för att aktivera ICE vilket gör det möjligt att omvandla cytoplasmatisk pro-IL-1β att mogna cytokin.
Framgångsrik sekretion av IL-1β i utvecklingsländer kräver avkänning av två olika och oberoende varningssignaler. Först TLR avkänning av PAMPs, dämpar, eller cytokin signalering (TNF eller IL-1β) orsakar en uppreglering av cytoplasma pro-IL-1β proteinuttryck. En andra, ofta olika, signalen krävs för inflammakomplexbildning uppströms om ICE mognad. Några inflamma stimulerande signaler inkluderar bakteriella membran porbildande toxiner (t.ex. nigericin), lysosomala störa kristaller (t.ex. mono uratkristaller, MSU) och extracellulärt ATP. Uppströms mekanism som leder till NLRP3 inflamma aktivering av dessa olika aktivatorer är oklart. Studier som undersöker signalerings uppströms av inflammabildning föreslår att intracellulära händelser, såsom induktion av hypokalemi eller reaktiva syreradikaler (ROS) indirekt aktivera inflamma 13-28.
Bland de olika virus aktivatorer av NLRP3 inflamma är influensa, vilket ger bÖvr primär och sekundär signal som krävs för IL-1β sekre 3, 29-33. Använda mus NLRP3 knockout modeller konstaterades det att IL-1β-utsöndring i DCs är NLRP3 beroende 32. Dessutom NLRP3 knockoutmöss lockade färre leukocyter till platsen för infektion och haft en högre dödlighet 2, 5. Två nya tidningarna tyder på en mekanism för NLRP3 inflamma aktivering under influensa virusinfektion; första, primning genom erkännande av viralt RNA genom TLR7 eller TLR8 (beroende på TLR expression av den svarande cell) eller genom avkänning av bakteriefloran genom annan TLRs att inducera cytoplasmatisk pro-IL-1β uttryck, följd av en andra signal, aktivering av NLRP3 inflammabildning genom viral jonkanalsprotein M2 på den trans-Golgi nätverket 33, 34. I det senare steget, utlösning av NLRP3 inflamma åstadkommes genom störning av det intracellulära jonisk <em> miljö som leder till ROS produktion, vilket är, helt enkelt, kände av NLPR3 som en signal för att bilda inflammasome. Emellertid förblir den exakta mekanismen för inflamma aktivering uppströms om ICE-aktivitet under influensainfektion fortfarande oklart.
Detta arbete beskriver en teknik värdefullt för att studera NLRP3 inflamma i mänskliga moDCs som kan användas som en grund för vidare utredning av banan underliggande DC baserat IL-1β sekretion som svar på TLR8 ligation med R848 följt av aktivering av inflamma genom en väl känd aktivator av NLRP3, nigericin. Variationer av denna metod kan användas med andra celltyper, inklusive, men inte begränsat till: monocyter, makrofager, andra DC-undergrupper, och epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Uttalande: Forskningsprov erhålls och lagras för forskning med givarnas samtycke. Alla prover bör kodas eller anonymiseras före användning. Detta protokoll följer riktlinjerna i vår Institutional Review Board.
1. Differentiering av humana perifera blod Monocyter in Monocyte härledda dendritiska celler.
Obs: Mänskliga buffy coats tjäna som källa till humana perifera blodceller (PBMC) och erhölls från New York Blood Center (New York, NY). Blodgivare är friska frivilliga. Den 5 dagars Förfarandet inleds med plätering av humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) på vävnadskultur kolvar 35,36. Noterbara skillnader från de publicerade protokollen är följande:
- Använd 225 cm 2 icke pyrogena polystyren vävnadsodlingsflaskor med en filterlock för att hålla sig totalt 2x10 8 PBMC per kolv i stället för 10 cm polystyren vävnadsodlingsplattas (58 cm 2) (steg 1).
- Förbered media med 5% sammanslaget humant serum (PHS, 30 ml) i 500 ml RPMI-1640 + L-glutamin, 5 ml 1 M HEPES-buffert, och 1,4 ml 50 mg / ml gentamicin (5% PHS media) följt av filtrering genom ett 20 pm filter. Lägg totalt 50 ml 5% PHS media per 225 cm 2 vävnadsodlingskolv.
- Tvätta vidhäftade cellerna tre gånger med 25 ml färskt RPMI-1640. Skaka kraftigt i 5 sekunder vid varje tvätt och aspirera icke vidhäftande celler (steg 4).
- Lägg till 190 l av 400 IE / il IL-4 och 380 pl av 100 IE / l GM-CSF per flaska (steg 3) på dag 0, 2 och 4. Dag 0 definieras som dagen PBMC initialt klädd i steg 1 (steg 8).
- Harvest dag 5 moDCs vid en koncentration av 1x10 6 celler / ml (steg 15).
- Använd moDCs omedelbart i sitt vilotillstånd. Steg 17-22 är aldrig utförs. Obs: Prov bör behandlas så snart som möjligt efter provtagningen för bästa resultat.
- Alikvotera moDCs vid en koncentrationtion av 2x10 5 celler / brunn (200 pl / brunn av 1x10 6 celler / ml) i en 96 brunnars rundbottnad platta (western blot, ELISA, FACS) eller på en poly-L-lysin behandlas chamberslide (mikroskopi) för experiment . OBS: Det finns minst 4 villkor: Helt ostimulerade (negativ kontroll), priming bara, bara aktivering och priming följt av aktivering. Villkor kan utökas till att omfatta utspädnings kontroller för R848 och nigericin om så önskas. Om nedströms analys är ICS, dubbletter är nödvändiga för isotypkontroller.
. 2 Kontroll av inflamma - Signal 1
- Rekonstituera frystorkad R848 i DMSO enligt tillverkarens anvisningar. Späd arbets lager vid RT med RPMI-1640.
- Lägg R848 vid en 10 ^ M slutlig koncentration till lämpliga brunnar i 18 timmar. Placera cellerna i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
3 Aktivera NLRP3 inflamma -. Signal2
- Rekonstituera frystorkad nigericin i etanol enligt tillverkarens anvisningar. Späd arbets lager vid RT med RPMI-1640 innan du lägger på lämpliga villkor.
- Lägg nigericin vid en 20 fiM slutlig koncentration och återgå till inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 under 6 timmar. Inga tvättsteg sker mellan primning och under aktivering. Anm: Utsöndring av IL-1β ökas genom närvaron av kalcium jonoforer, brefeldin A, monensin, dinitrofenol, eller karbonyl cyanid chlorophenylhydrazone 37, 38. Därför är tillägg av dessa sekretoriska hämmare rekommenderas inte vid analys inflamma priming eller aktivitet eftersom det kommer att förändra sekretion av IL-1β.
4. IL-1ß Provtagning
- Centrifugera plattan med celler och supernatanterna vid 974 xg under 3 min.
- Utan att störa cellpelleten, aspirera supernatanten och överför till somn separat rundbottnad platta i syfte att mäta cytokinutsöndring från supernatanterna. Anm: Supernatanter temporärt kan lagras vid -20 ° C eller -80 ° C för långtidsförvaring.
- Tvätta de cellulära pellets tre gånger med 200 l av 1x PBS vid 974 xg under 3 min för att avlägsna eventuella extracellulärt IL-1β från cellprov. Obs: När du tvättar cellpellets från en platta med 96 brunnar, ta bort tvätten genom snabb platta inversion i en uppsamlingsbehållare för att inte störa provet.
5. Att mäta IL-1ß Från Cellular och Supernatant Prov
- Intracellulär cytokin färgning (ICS): ICS-protokollet beskrivs nedan 39, 40. OBS: inte suspendera cellerna, om nedströms-analysen är mikroskopi. Alla tvättningar och strävanden bör göras utan att störa cellskiktet / pellet (beroende på den nedströms analys).
- Tillsätt 100 l av 5% PHS media i lämpliga brunnar. Lägglämplig mängd (ungefär 1 μl/2x10 5 celler eller 1 | il / brunn) av fluorescensmärkt α-CD11c och α-CD14 (fenotyp markörer; klon B-ly6 och MφP9, respektive) eller isotypkontroll till cellerna under 10 min vid RT i mörker.
- Tvätta tre gånger med 1 x PBS vid 974 x g under 3 min.
- Fixera cellerna genom tillsats av 100 ul av 4% PFA under 20 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Paus Punkt: Tvätta med 100 l 1x PBS vid 974 xg under 3 min och förvara vid 4 ° CO / N i 1x PBS.
- Addera 100 pl av permeabilization buffert till cellerna under 30 min. Anm: permeabilization buffert består av 1x PBS med 0,3% Triton X-100 och 1% bovint serumalbumin (BSA) för permeabilisering. Stör ej vidhäftande celler när nedströms analys är mikroskopi.
- Lägg till lämplig volym (ca 62 ng antibody/2x10 5 celler, ungefär eller 2,5 l / brunn) av α-IL-1β-FITC (klon 8516) eller isotypkontroll för2 h i en inkubator vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna tre gånger med 200 ul av permeabilization buffert vid 974 x g under 3 minuter i mörker.
- Valfritt: Stain med DAPI, tillsätt monteringsmedel och placera täckglaset försiktigt på toppen av en glasplatta. Låt monteringsmedel för att bota O / N innan du tar mikroskopi bilder.
- Förvärva data genom FACS eller mikroskopi. OBS: Jämför isotypen för varje tillstånd till lämplig färgning vid analys genom FACS eller mikroskopi.
- FACs: Skaffa ett prov åt gången. Ställ FSC / SSC porten på levande celler, följt av gating på CD11c + CD14 - celler innan analysera moDC befolkningen pro-IL-1β färgning.
- Mikroskopi: Ställ in exponeringstid med hjälp av positiv färgning provet - R848 behandlad. Använd DAPI + pro-IL-1β + och DAPI + pro-IL-1β - att bestämma andelen pro-IL-1β + uttrycker moDCs.
- SDS-Sida: Immunoblotting utförs för att upptäcka pro-IL-1β. Obs: Den teknik som beskrivs nedan kombinerar standard immunoblotting teknik, lutning 4-20% polyakrylamidgel, och fluorescerande eller kemiluminescerande detektering 41, 42.
- Lyse celler direkt i 10 l denaturelyseringsbuffert (5 pl β-mercaptoethanol/950 il Laemmli provbuffert följt av spädning 1:1 med cellysbuffert). Överför lysatet till 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Värme lysat på torr platta under 10 minuter vid 100 ° C.
- Centrifugera lysatet vid 20.800 x g i en minicentrifuge under 1 min för att koncentrera vätskevolymen. Paus Punkt: prover kan frysas vid -20 ° C för korttidslagring.
- Fyll på den totala volymen på polyakrylamidgel. Kör 140 V genom gelboxen under ca 1 timme, eller tills färgen rinner från botten av gelén.
- Överföring av proteinet från polyakrylamidgelen på ett PVDF Immobilon-FL membrane för 90 minuter vid 100 V. Block membranet med 5% BSA i Tris-buffrad saltlösning / 0,1% Tween-20 (TBS-T) under 1 timme. OBS: PVDF Immobilon-FL är bäst för användning med fluorescerande detektion. Ett membran med en annan sammansättning rekommenderas för andra detektionstekniker för att öka signal-till-bakgrundsförhållandet.
- Späd primära och sekundära antikroppar i 10 ml 5% BSA / TBS-T. Utför primära inkubationer antikroppar vid 4 ° CO / N under omskakning och sekundär antikropp vid rumstemperatur i 1 timme under omskakning.
- Tvätta membranet 3 gånger med TBS-T i 5 minuter under omskakning mellan primär-och sekundär inkubationer antikropps och åter mellan sekundära inkubationer och bildbehandling. Not: Band kan detekteras med användning av fluorescerande eller kemiluminescerande detektion. Följ tillverkarens instruktioner för upptäckt.
- ELISA: Prover som fryses för lagring behöver jämvikt till rumstemperatur före analys. Spinn ner prover i en centrifug för att konsolidera supernatant kondensation. Följ tillverkarens anvisningar för mätning av IL-1β. OBS: I detta protokoll IL-1β specifikt mäts; emellertid samtidig mätning av TNFa, IL-6, och den immunmodulerande cytokin IL-10 säkerställa lämpliga betingelser primades.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa tekniker mäter TLR8 priming med R848. Intracellulär cytokin färgning för pro-IL-1β tillåter mikroskopi och FACS avläsning från CD14 - CD11c + moDCs. Båda teknikerna kan kvantifieras i förhållande till en icke primade, eller vila, cellkontroll liksom en isotyp kontroll (fig. 1 och 2). Procent av pro-IL-1β + färgningsceller multipliceras med den geometriska symmetri av denna population för att åstadkomma medianfluorescensintensitet (MFI). MFI är jämförbar med den mängd av pro-IL-1β närvarande i de positiva färgningsceller.
Immunoblotting åtgärder pro-IL-1β från cellysatet, som sedan kvantifieras i förhållande till en intern cellulär kontroll såsom β-tubulin eller β-aktin (fig 3). Immunoblotting för pro-IL-1β i nigericin behandlade celler bör avslöja en minskning av pro-IL-1β. Detta kompletteras av ensamtidig ökning av IL-1β i supernatanter, mätt med ELISA, endast i R848 följt av nigericin förhållanden (figurer 3 och 4). Alla andra villkor bör leda till någon extracellulära IL-1β närvarande. Samtidig mätning av andra inflammatoriska cytokiner, såsom TNF, IL-10 och IL-6, se till att nigericin är specifik i att orsaka utsöndring av IL-1β. Graden av primning är tid (Figur 3) och dos (figur 4) beroende, ett svar återspeglas i graden av intracellulära pro-IL-1β i R848 primas och extracellulärt IL-1β (liksom TNFa, IL-10, och IL-6) utsöndring i alla R848 behandlade förhållanden (Figur 4).
Figur 1. Cytoplasmisk pro-IL-1β detekteras av f låg cytometri. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cytoplasmisk pro-IL-1β upptäcks av mikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Cytoplasmisk pro-IL-1β detekteras genom SDS-PAGE.res.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Utsöndrat IL-1β detekteras med ELISA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inflammatoriska cytokiner är integrerad i styrningen av medfödda och adaptiva immunförsvaret att bekämpa virusinfektion. Utsöndrad IL-1β har visats öka under influensainfektion 3, 43, 44. De exakta mekanismerna genom vilka dessa cytokiner bearbetas som svar på viral erkännande i humana dendritiska celler är inte helt klarlagda. Myeloid DC isolering kit är dyrt och tidskrävande. Isolation kit och FAC sortering kan oavsiktligt stress eller aktivera cellerna. Dessutom finns det ofta otillräcklig mängd av isolerade celler för experiment. Lyckligtvis, biologi mänskliga moDCs modeller nära att av primära humana myeloida DCs in vitro 45, 46. Båda celltyper kräver två signaler, TLR priming och NLRP3 aktiverande, för att uppnå mogen IL-1β-utsöndring. Därför moDCs tillhandahålla och prisvärd och enkel DC-modellen celltyp att studera och satsater förstå relevansen och roll NLRP3 inflamma i människors hälsa och sjukdom.
Upptäckten av IL-1β utnyttjar de metoder som beskrivs här ger olika enkla och effektiva immunanalyser för att studera sjukdomar med inflammatorisk associerade sjukdomar, däribland virus-RNA-infektion; specifikt, hur man mäter IL-1β i en mängd olika sätt som svar på R848 och nigericin stimulering. Andra TLR-agonister (såsom poly (I: C) och LPS) och NLRP3 inflamma aktivatorer (såsom ATP och MSU) kan användas för att mäta denna aktivitet vid stimulering i samband med andra patologier sjukdom; Men, kan stimuleringstider och villkor behöva justeras. Reagens exponeringstider och koncentrationer skulle också behöva justeras när du ändrar detta protokoll för användning i andra typer och arter cell.
Samtliga villkor bör köras i tre exemplar och svaret vägde noga för kvalitetskontroll; det är vanligt attstor donator variabilitet att existera. Som härstammar från monocyter DCs är en celltyp, inte en cellinje, och heterogenitet existerar inom ett moDC kultur.
Priming kan bekräftas med ICS för pro-IL-1β och jämföra vila moDCs till R848-primas tillstånd. Vilande moDCs bör inte leda till positiv färgning. Priming kan också valideras genom immunoblotting för expression av pro-IL-1β. Framgångsrika R848 priming resulterar i utsöndring av proinflammatoriska cytokiner TNFa, IL-6, och den immunmodulerande cytokin IL-10 med minimal utsöndring av IL-1β. Inflamma aktiverade celler bör inte uppvisa en ytterligare ökning av TNFa, IL-6 och IL-10-sekretion, men kommer att ha en ökning av utsöndrade IL-1β-koncentrationer i jämförelse med icke aktiverade celler.
Pro-IL-1β kan passivt släpps under nekrotisk celldöd därför biotillgänglighet analyser kan vara av intresse. Alternativt kan immunoblotting utföras på supernatants för att bestämma molekylvikten av utsöndrat IL-1β att säkerställa aktivt IL-1β är den form av cytokinet utsöndras; moget IL-1β är 17 kDa medan föregångaren är 31 kDa. För att mäta IL-1β från supernatanter, kommer cellkoncentrationen måste justeras för att uppnå en positiv signal över detektionsgränsen. Caspase-1-aktivering kan också mätas genom en mängd olika metoder för att fastställa inflamma aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., och Meagan O'Brien, VD för deras stöd och feedback. Denna forskning stöds av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar och avslutade med finansiering från NIH bidrag Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards för enskilda predoctoral stipendier (F31) för att främja mångfald i Hälsorelaterade forskning (AI089030) och RO1 (AI081848 ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12 well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96 well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12% polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| Laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| Human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| Nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| Goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| Donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol - 4 L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
References
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O'Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
