Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Sekvensiell doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

Kvantitativ måling av benet progenitor-funksjonen i bruddheling krever høy oppløsning serieavbildningsteknologi. Her er protokoller gitt for å bruke intramikroskopi og osteo-avstamning sporing å sekvensielt bilde og kvantifisere migrasjon, spredning og differensiering av endogene osteogenic stilk / stamceller i prosessen med å reparere beinbrudd.

Abstract

Bone svinger over kontinuerlig og er sterkt regenerativ etter skade. Osteogene stammen / stamceller har lenge vært antatt å eksistere, men in vivo demonstrasjon av slike celler har nylig blitt oppnådd. Her er in vivo imaging teknikker for å undersøke hvilken rolle endogene osteogenic stilk / stamceller (OSPCs) og deres avkom i bein reparasjon gitt. Ved hjelp av osteo-avstamning celle tracing modeller og intra avbildning av indusert mikrofrakturer i calvarial bein, kan OSPCs observeres direkte i løpet av de første dagene etter skade, hvor kritiske hendelser i tidlig reparasjonsprosessen oppstår. Skadeloka kan sekvensielt avbildes avsløre at OSPCs omplassering til skaden, øke i antall og differensiere i bein forming osteoblaster. Disse metodene gir et middel for å undersøke hvilken rolle stamcelle-indre og ytre molekylære regulatorer for bein regenerering og reparasjon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Degenerative bein sykdommer og aldersrelaterte beintapet fører til en høy risiko for osteoporotiske brudd har blitt en stor utfordring i folkehelse en. Bone vedlikehold styres av bendannende osteoblaster og bein-resorbing osteoklaster. Defekter av bein forming celler er en viktig årsak til aldersrelatert bentap og degenerative bein sykdommer 2,3. Mens omfattende forskning har fokusert på forbedring av bruddtilheling, til oppdagelsen av pålitelige narkotika kurere degenerative bein sykdommer og for å reversere den svakhet av osteoporotiske brudd er fortsatt en viktig sak. Således studere kilden til skjelettdannende celler og deres kontrollmekanismer i benet regenerering og reparasjon tilveiebringer en ny innsikt for å øke skjelett regenerering og omvendt bentap sykdommer.

Eksistensen av multipotente mesenchymale celler i benmargen er foreslått basert på identifisering av clonogenic populasjoner som kunne annerledesIate inn osteogent, adipogenic og chondrogenic linjene ex vivo fire. Nylig, flere studier har rapportert at skjelett / mesenchymale stamceller (SSCS / MSCS) er en naturlig kilde til osteoblaster og er kritiske for bein omsetning, ombygging, og brudd reparasjon 5,6 . I tillegg er våre avstamning-tracing studie viste at modne osteoblasts har en uventet kort halveringstid (~ 60 dager) og blir kontinuerlig etterfylles av sine stilk / stamceller i både normale homeostatiske og brudd reparasjon forhold seks. Imidlertid er in vivo identiteten av stamceller, og hvor slike celler reagerer på brudd skade og leverer bendannende celler er uklar. Derfor er det viktig å utvikle en fremgangsmåte som er i stand til å analysere migrering, proliferasjon og differensiering av endogene SSCS / MSC på under fysiologiske forhold.

Fracture reparasjon er en multi-mobilnettet og dynamisk prosess regulert av en rekke kompleksecytokiner og vekstfaktorer 7. Den mest populære metode for fraktur-studier er å bruke en dyremodell med lang benbrudd og for å analysere ben ved ben seksjonering og immunofluorescent teknikker 8-10. Denne reparasjonsprosessen kan overvåkes av flere bildeteknikker inkludert mikro-CT 11, nær-infrarøde fluorescens 12, og kjemiluminescens avbildning 13.. Imidlertid har hver teknikk visse begrensninger, og det har ikke vært noen effektiv måte å overvåke SSCS / MSC-funksjon på cellenivå in vivo. Nylig har konfokal / to-foton intravital mikros blitt utviklet og brukt for å detektere transplanterte kreftceller og hematopoetiske stamceller i forbindelse med deres benmarg mikromiljøet selv ved encellede oppløsning i levende dyr 14. Ved å kombinere denne teknologien med en rekke avstamning tracing modeller, var vi i stand til å definere at osteogent stilk / stamceller kan være genetisk preget av forbigående acaktiverings av myxoviruset motstand -1 (MX1) promoter og MX1-indusert stamfedre kan opprettholde de fleste modne osteoblaster over tid, men deltar ikke i den generasjonen av chondrocytes i voksen mus seks. I tillegg viste vi at MX1-merket OSPCs forsyne flertallet av nye osteoblaster i bruddtilheling seks.

Her, ved hjelp av osteo-avstamning sporing modeller og intramikroskopi, er en protokoll for å definere in vivo kinetikk av MX1 + osteogenic stilk / stamceller i brudd reparasjon. Denne protokollen tilbyr sekvensiell avbildning å spore flytting av osteogenic stilk / stamfedre til bruddsider og kvantitativ måling av osteoprogenitor ekspansjon i tidlig reparasjonsprosessen. Denne fremgangsmåten kan være nyttig i flere sammenhenger, inkludert evalueringen av terapeutiske kandidater for å forbedre ben reparasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Mus og Forbehandling

Merk: Alle mus ble opprettholdt i patogen frie forhold og alle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Massachusetts General Hospital. All kirurgi bør utføres under sterile hjelp autoklaveres sterilt utstyr. MX1-Cre 15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), og Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomat), var kjøpt fra Jackson Laboratories. Osteocalcin-GFP mus ble gitt av Dr. Henry Kronenberg. For kvantitativ analyse av OSPC migrasjon og spredning in vivo, ble MX1-Cre + Rosa-YFP + (én farge-reporter) mus brukes. For mer detaljert sporing av deres differensiering i osteokalsin + modne osteoblaster, brukte vi trigenic MX1-Cre + Rosa-Tomato + OCN-GFP +mus.

  1. Å merke MX1 + celler in vivo, forberede polyinosinic-polycytidylic syre (pIpC, 2,5 mg / ml) i sterile PBS løsning og injisere 200 mL for 20 g MX1-Cre + reporter mus intraperitonealt en gang annenhver dag i 10 dager.
  2. For å eliminere bosatt MX1 + hematopoetiske celler, strålebehandling mus med en enkelt dose på 9,5 Gy. Etter 24 timers bestrålings, transplantasjon vill type benmargceller (1x10 6 celler / mus) intravenøst ​​16. Merk: Siden MX1-induserbare celler inkluderer blodkreft celler og blodkreft-avledet osteoklaster, eliminering av MX1 + hematopoetiske celler forbedrer bildekvaliteten og kvantifisering av MX1 + osteogenic celler.
  3. Etter benmargstransplantasjon, overvåke dyr i fire til seks uker for å oppnå en vellykket repopulation av donor marg celler.

2. Mobruke Forberedelse

  1. Anesthetize mus ved intraperitoneal injeksjon av 50 pl av ketamin / xylazin (100 mg / kg, xylazin 12 mg / kg kroppsvekt) ved bruk av en IACUC godkjent prosedyre. Merk: Varighet av effekten kan forlenges med en ekstra dose ketamin / xylazin.
  2. Finn ut om musen er fullt bedøvet av mangel på respons på tå og / eller hale klyper. (Valgfritt) Når musen er bedøvet, sikre en isofluran gassmaske over nesen ved taping. Justere nivået av isofluran for å sikre at dyret er fullstendig bedøvet.
  3. Klem hodehår ved hjelp av en elektrisk trimmer eller liten saks. Fjern håret fragmenter og sterilisere den eksponerte huden med 70% spritserviett. Påfør tåre gel for å hindre at hornhinnen dehydrering.

Tre. Microfracture Injury

  1. Etter å sikre at dyret er fullstendig bedøvet, gjør en enkelt omvendt L-formet innsnitt for å åpne hodebunnen huden. Kort, lage en første tverrgående snitt (mindre enn 1 cm) starting fra det ene øret til en annen øret. Slå ~ 60 ° og fortsette å incise mot nesen til ~ 2-3 mm bort fra nesen. Merk: Dette snittet minimerer dannelsen av arr vev over området som skal avbildes.
  2. Separer hudlapper ved å trekke mot sidene med pinsett. Både frontal bein og krysset av sagittal og koronale suturene bør være tydelig eksponert.
  3. Rengjør den åpne overflaten ved å skylle med sterilt PBS og skånsom visking med sterilt gasbind eller bomullspinner til alle de gjenværende hårene er eliminert.
  4. For å generere mikrofrakturer på calvarium, hold muse hodet med den ene hånden og en 30 G nål med en annen hånd. Lag en mikro-punktering (~ 0,2 mm diameter såret med <1 mm dybde) på venstre frontal bein nær krysset av sagittal og koronale suturene ved å stikke spissen av en 30 G kanyle med lett trykk og vridning bevegelse. Forsiktig: Det er viktig å unngå at nålen fra å trenge inn i hjernen, og derved minimere bleeding og vevsskade.
  5. Bytt til en større nål (20 eller 25 G) og utvide punktering hullet ved å vri nålen (~ 0,5 mm diameter).
  6. Gjenta trinn 03.03 til 03.05 for å generere andre punktering på motsatt frontal bein.
  7. Tørk ut den skadde flekker ved kontinuerlig dropping av PBS inntil blødningen stopper.
    Merk: Blødning på brudd områder vil forstyrre hensiktsmessig bildebehandling og indusere arrdannelse.
  8. Påfør en dråpe steril fysiologisk saltløsning, eller 2% Methocel på skallen for å unngå tørking. Merk: Ikke la skallen overflaten tørke, noe som vil redusere bildeklarhet. Det er viktig å bruke en tilstrekkelig mengde av gel-eller saltvann for å dekke området.

4. Intravital Imaging

  1. (Valgfritt) Før bildebehandling, er noen mus injisert med en vaskulær fargestoff til å visualisere blodårene. Injisere retro transorbitalt med 20 mL av ikke-målrettede Qtracker 705 (2 mikrometer løsning i 50 mM borat buffer) fortynnet i 80 ml av PBS. Bruk en insulinsprøyte for å minimere reagens avfall. Hvis signalet ikke er tilstrekkelig sterkt, kan ytterligere mengder være nødvendig.
  2. Slå på skanneren. Merk: En polygon-basert laserskanner tillater samtidig flerkanals image oppkjøpet på video rate (30 bilder per sekund). Video rente skanning er svært viktig for levende dyr bildebehandling.
  3. Slå på multi-foton laser (femto-andre titan: safir laser). Sett bølgelengde på 880 nm og justere kraften for andre harmoniske generering imaging (440 nm) av benet. For GFP og tdTomato eksitasjon, skru på 491 nm og 561 nm solid-state laser.
  4. Slå på PMT (fotomultiplikatorrør) detektorer for hvert signal (en 435 ± 20 nm band-pass filter for andre harmonisk generasjon, en 528 ± 19 nm band-pass filter for GFP, og 590 ± 20 for tdTomato.) (Valgfritt) Bruk en 638 nm helium-neon laser og en PMT med en 695 ± 27.5 nm band-pass filter for å oppdage Qtracker 705 signal.
  5. Place dyret på en XYZ-aksen motorisert mikroskop scenen. Hold musen i den mest komfortable posisjonen med en elektrisk varmepute for å opprettholde kroppstemperaturen (dette reduserer risikoen for dyr tap). Bruk tape til å holde musen for å minimere bevegelse under bildebehandling og å holde fotografert området så horisontalt som mulig.
  6. Påfør en dråpe av varm 2% metylcellulose gel eller fysiologisk saltløsning på skallen for å unngå tørking. Sett en dekkglass på bildeområdet. Bruk en lav forstørrelsesglass (30x vann-nedsenking objektiv med 0,9 NA) for å skanne calvaria.
  7. Ved hjelp av XYZ-aksen kontrolleren, finner overflaten av calvaria ved å påvise SHG-signalet fra bein og identifisere en avgjørende landemerker sted, for eksempel i skjæringspunktet mellom de sagittale suturer og koronale suturer. Tak i et bilde og registrere XYZ koordinater.
  8. Fortsett å søke etter plasseringen av skaden ved å observere SHG og fluorescens-signaler.
  9. Når skadeloka eller regionen of interesse er funnet, å erverve et bilde av de beste fokusplan som inneholder SHG og fluorescens-signaler fra cellene av interesse. Lagre XYZ koordinater og avstanden til krysset av sagittal og koronale suturene å definere sin nøyaktige plassering for de neste rundene av bildebehandling.
  10. For å samle inn 3D-mobilnettet og bein strukturer av bruddskader, ta bilder av Z-stacks (2-5 mikrometer intervall) med ~ 100 mikrometer dybde fra endosteal bein overflaten. Etter gjennomføring av avbildning av den ene siden av skade, gjenta bildeprosessen for neste skadeloka.

5. Post driftsprosedyrer

  1. Etter bildebehandling, skyll bildeside med sterilt saltvann for å fjerne methylcellulose gel fra skallen. Ved hjelp av en steril bomullspinne, påfør en liten mengde trippel antibiotisk salve på overflaten. Dekk huden flaps og re-lukke hodebunnen ved kirurgisk suturering. Dette kan gjøres med en allergi suturering tråd (absorberbare polyglaktin suture) og 5-0 størrelse sutur nål. Forsiktig: Good suturering teknikken reduserer arrdannelse.
  2. Behandle alle dyr med IP-injeksjon av 0,05 til 0,1 mg / kg buprenorfin hver 12. time i 48 timer etter operasjonen. Holde dyr i en varm utvinning kammer før de gjenvinne tilstrekkelig bevissthet. Etter 3 til 5 dager, gjenåpne sutur og gjenta intra bildebehandling skritt for å spore mobil endring under brudd healing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den stabiliserte lang beinbrudd modellen har vært populært i bruddstudier. Det lange ben eller store bruddmodeller forårsake multiple skader vev, og derfor er det en begrensning i kvantitativ måling av ben cellefunksjon. Vi har utviklet en minimal invasiv skade (mm diameter med minimal eller ingen invasjon i dura mater mindre enn 1) på frontpartiet calvarial ben med nål boring (figurene 1A-1C). Vi valgte en topp utsikt over calvarial frontal bein for in vivo direkte avbildning av mikrofrakturer fordi dette benet har en flat og tynn benbygning med benmarg, tillater klar avbildning av skadet bein, beinceller, og blodkar uten forstyrrelser av andre vev ( Fig. 1C). Vi har observert at denne microfracture sammenfatter mange egenskaper ved store bruddskader inkludert myke callus dannelse etterfulgt av mineral-avsetning og ny bendannelse (data ikke vist).

"> Sequential in vivo avbildning av MX1 + osteogent stilk stamceller. Vi neste testet om denne metoden er i stand til å spore en bestemt osteogent cellepopulasjon under brudd healing. Tidligere har vi utviklet de trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP dual reporter mus ved krysset MX1-Cre mus med Rosa26-Tomato reporter og osteokalsin-GFP mus (Figur 2A) 6. Fordelen med denne modellen er differensial merking av osteogenic stilk / stamfedre og modne osteoblaster. Av pIpC administrasjon, er det MX1 + OSPCs spesielt merket av tomat uttrykk, mens modne osteoblasts differensiert fra MX1-indusert OSPCs uttrykke Tomat og GFP. Men, pre-eksisterende osteoblaster og modne osteoblasts fra MX1 ikke-induserbare progenitors uttrykker GFP alene (figur 2B). Etter bestråling og benmarg erstatning, vi genererte to mikrofrakturer på frontal bein av disse musene. Vi har bekreftet at arealet av hver fraktur ble detektert ved ett enkelt synsfelt med vår 30x objektiv. Sekvensiell 3D-intra avbildning av mikrofrakturer viste flytting av Tomato + OSPCs i stedet av bruddet på dag 2 og deres ekspansjon på dag fem. Det var ingen eller undetectable GFP + osteoblasts på dette tidspunktet. På dag 12, en undergruppe av osteoprogenitors nærheten bruddflaten initiert differensiering av osteoblaster (Tomato + GFP +). Deretter akkumulering av nye osteoblaster og ny bendannelse (analysert ved hjelp av andre harmonisk generering, blå) ble tydelig på dag 21, noe som indikerer at migrering og proliferasjon av osteogene stamceller er en viktig mekanisme for å levere nye osteoblaster som deltar i bruddheling (figur 2C).

Kinetics av osteogenic stilk / stamfedre i brudd reparasjoner. Test om vår metode gir en konsekvent og kvantitativ produksjon av osteoprogenitor tall under brudd healing, brukte vi Mx1/YFP mus som en enkel avstamning-sporing modell og spores MX1 + OSPCs i tidlig brudd reparasjon. Etter MX1 + marg cellene ble erstattet av vill type marg, genererte vi seks uavhengige mikrofrakturer (to / mus) på Mx1/YFP muse calvaria. Når Mx1/YFP + OSPCs ble sporet i 14 dager etter skaden, vi konsekvent observert at et lite antall forfedre ble oppdaget på skadestedet etter tre dager. Tallene kontinuerlig økt på dag 7, og nådde topp befolkning på dag 10 og opprettholde etter 14 dager (figur 3A). Vi kvantifisert kinetikken av osteoprogenitor tall ved å måle YFP signalintensitet (bildebehandling og analyse med ImageJ program). Vi gjentok dette eksperimentet med en tilsvarende effekt, noe som tyder på konsistensen av vår tilnærming (Figur 3B).

ss = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 1
Figur 1. In vivo avbildning av mus calvarial skade. (A) Skjematisk fremstilling av mikrofrakturer på musen frontal bein nær skjæringspunktet mellom de koronale (CS) og sagittal suturer (SS) og sekvensiell intra bildebehandling. (B) Kirurgisk eksponering av mus calvaria før skaden. (C) Representative microfracture skader på mus calvaria for intra bildebehandling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

51289fig2.jpg "/>
Figur 2. In vivo sporing av OSPCs på skadesteder. (A) Skjematisk fremstilling av trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP mus. (B) Dette diagrammet illustrerer mulige fluorescerende cellepopulasjoner som vises på skadeloka av trigenic Mx1/Tomato / ocn-GFP mus. Red representerer MX1 + OSPCs uttrykke Tomato. Gul representerer modne osteoblaster (Tomato + GFP +) skiller seg fra MX1 + OSPCs mens grønt representerer nye osteoblasts fra pre-eksisterende osteoblaster (GFP +) eller MX1 ikke-induserbar (MX1 -). Stamfedre (C) Sekvensiell intra avbildning av MX1 + OSPCs og osteoblaster på skadesteder. Tomat + osteoprogenitors og GFP + osteoblasts nærheten skaden på Mx1/Tomato/Ocn-GFP mus calvaria ble fotografert umiddelbart etter skaden (dag 0) og på than antydet ganger etter skade. Pilene angir osteoblaster avledet fra MX1 + OSPCs (gul). Blå, bein. Den stiplede sirkelen representerer hele (single) bruddstedet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Jevn og kvantitativ måling av MX1-indusert OSPCs under bruddheling. (A) Tre uavhengige skader på Mx1/YFP mus calvaria ble det i rekkefølge avbildes umiddelbart etter skade (dag 0) og ved de indikerte tidspunkter etter skade. (B) Kvantitativ måling av MX1 + osteogenic stilk / stamceller. Kinetikken MX1 + OSPCekspansjon på skadeloka ble målt ved YFP signal intensitet ved hjelp ImageJ. Grafene viser to uavhengige eksperimenter med gjennomsnittet av seks skader i hvert forsøk. Blå, bein; grønne, MX1 + osteogenic stilk / stamceller; rød, blodkar (Q-punkter). Scale barer er 100 mikrometer (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Reguleringen av skjelett stamceller kan være av stor betydning for å definere bedre metoder for å oppnå ben regenerering. Kvantitativ og sekvensiell avbildning på cellenivå har vært teknisk utfordrende. Selv om musen lang beinbrudd modellen har vært mye brukt og passer for biomekaniske studier 17, har sin dype vev beliggenhet, ujevn brudd størrelse, mykt vev skade, og anvendelsen av stabiliserende fixators begrenset sekvensiell intra bildebehandling. Her er en metode for å overvinne disse begrensningene ved kombinasjonen av konfokal / to-foton intravital mikroskopi og en mus calvarial bruddmodell tilgjengelig. Denne tilnærmingen med osteogent stilk / stamfar avstamning sporing demonstrerer sin evne til real-time, in vivo avbildning av osteogenic stilk / stamfedre i brudd reparasjon.

En viktig teknisk utfordring i denne fremgangsmåten er å fremskaffe bilder konsistente og høy kvalitet over tid. Høy kvalitet imaldre med maksimal bildedybde avhenger av lysstyrken av de fluorescerende reportere og vevet tilstanden til bildeområdet. I tillegg reduserer lasereksponering for å unngå vevskade og fotobleking er viktig for langtids sekvensiell avbildning. Rapid skanning ved hjelp av video rente plattformen er nyttig for dette formålet. Hvis en enkelt synsfelt ikke kan dekke hele skaden, kan området kartlegges ved å ta montasjen bilder for å dekke det meste av brudd nettsteder. Det er viktig å inngå kompromiss mellom kvaliteten av Z-stakken, og mengden av informasjon som erverves i løpet av hele avbildnings økt. For eksempel Z-stabler med mange skiver (f.eks 1-2 mikrometer trinn) og høy definisjon er enklere å analysere videre; men de krever langvarig lasereksponering som fører til en høyere grad av laser-induserte fotobleking.

Siden sekvensiell in vivo avbildning av bruddskade nødvendiggjør gjentatt kirurgisk åpning av skinn og ben overflate,fibrotisk arrdannelse på overflaten av calvaria er et vanlig problem som avbryter dype vev avbildning og gir høy bakgrunn florescence. Dyktige sutur teknikker og minimum blødning er avgjørende for å redusere arrdannelse. Generelt kan 04:57 tid gjentar avbildning oppnås uten vesentlig tap av bildekvalitet.

Med muligheten for gjentatt avbildning, den er lett og nøyaktig styring av bruddstørrelse og konsistens av reparasjons-kinetikk, kan denne fremgangsmåte gi en rimelig anordning for testing av terapeutiske mål for bruddheling, osteoporose og andre vev regenerering slik som skjelettmuskulatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker C. Park for å lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av den NIAMS henhold Award Antall K01AR061434 og leukemi og lymfom Society Fellowship Award (5127-09) til DP og tilskudd av National Institutes of Health til CPL og DTS Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer de offisielle visningene av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
Sekvensiell<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging av osteogent Stem / stamceller under brudd Repair
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter