Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Séquentiel doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

La mesure quantitative de la fonction progénitrices de l'os dans la guérison des fractures nécessite haute résolution technologie d'imagerie de série. Ici, les protocoles sont fournies à l'aide de la microscopie intravitale suivi et l'ostéo-lignée pour quantifier séquentiellement l'image et la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes dans le processus de réparation de fracture osseuse.

Abstract

Os tourne en permanence et est fortement régénération suite à une blessure. Cellules souches / progénitrices ostéogéniques ont longtemps été émis l'hypothèse d'exister, mais sur une démonstration in vivo de ces cellules a récemment été atteints. Ici, les techniques d'imagerie in vivo dans d'enquêter sur le rôle des cellules souches / progénitrices ostéogéniques endogènes (OSPCs) et leur progéniture dans la réparation osseuse sont fournis. Utilisation de cellules ostéo-lignée traçage modèles et imagerie intravitale de microfractures induites dans les os de la voûte crânienne, OSPCs peut être directement observée au cours des premiers jours après l'accident, dans lequel les événements critiques dans le processus de réparation se produisent tôt. sites de blessures peuvent être visualisés en séquence révélant que OSPCs déplacer à la blessure, d'augmenter en nombre et se différencier en ostéoblastes formation osseuse. Ces méthodes offrent un moyen d'étudier le rôle des régulateurs moléculaires des cellules souches intrinsèques et extrinsèques pour la régénération et la réparation osseuse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Maladies dégénératives des os et la perte osseuse liée à l'âge, entraînant un risque élevé de fracture ostéoporotique est devenue un enjeu majeur de santé publique 1. maintien de l'os est contrôlée par les ostéoblastes formant l'os et les ostéoclastes de résorption osseuse. Défauts de cellules osseuses formant sont une cause principale de la perte osseuse liée à l'âge et les maladies dégénératives osseuses 2,3. Alors que de nombreuses recherches ont porté sur l'amélioration de la guérison de la fracture, la découverte de médicaments fiables pour guérir les maladies dégénératives osseuses et d'inverser la faiblesse des fractures ostéoporotiques reste un problème important. Ainsi, l'étude de la source de formation de cellules osseuses et de leurs mécanismes de contrôle de la régénération osseuse et la réparation concerne une nouvelle idée pour améliorer la régénération du squelette et inverser les maladies de perte osseuse.

L'existence de cellules mésenchymateuses multipotentes dans la moelle osseuse a été proposée sur la base de l'identification des populations clonogéniques différente qui pourraitLiée en ostéogénique, lignées adipogéniques et chondrogènes ex vivo 4. Récemment, plusieurs études ont montré que les cellules souches du squelette / mésenchymateuses (SSC / MSC) sont une source naturelle d'ostéoblastes et sont essentiels pour le renouvellement osseux, le remodelage et la réparation de fracture 5,6 . En outre, notre étude de la lignée de traçage révélé que les ostéoblastes matures ont une demi-vie de façon inattendue à court (~ 60 jours) et sont continuellement renouvelées par leurs cellules souches / progénitrices dans les conditions homéostatiques et la réparation des fractures normales 6. Cependant, l'identité in vivo de cellules souches et de la manière dont ces cellules réagissent pour fracturer des blessures et de fournir des cellules formant l'os ne sont pas claires. Par conséquent, il est important de développer un procédé qui est capable d'analyser la migration, la prolifération et la différenciation des cellules souches mésenchymateuses / SSC endogènes dans des circonstances physiologiques.

réparation de fracture est un processus multi-cellulaire et dynamique régie par un ensemble de complexecytokines et des facteurs de croissance 7. L'approche la plus populaire pour les études de fracture est d'utiliser un modèle animal avec fracture des os longs et d'analyser les os par sectionnement de la moelle et des techniques d'immunofluorescence 8-10. Ce processus de réparation peut être surveillée par plusieurs techniques d'imagerie, y compris les micro-CT 11, la fluorescence dans le proche infrarouge 12, et la chimioluminescence imagerie 13. Cependant, chaque technique a certaines limites et il n'y a pas moyen efficace de surveiller la fonction SSC / MSC au niveau cellulaire in vivo. Récemment, confocale / deux photons microscopie intravitale a été développé et utilisé pour détecter des cellules cancéreuses transplantées et les cellules souches hématopoïétiques dans le cadre de leur microenvironnement de la moelle osseuse, même à une seule cellule de résolution dans les animaux vivants 14. En combinant cette technologie avec une série de modèles lignée de recherches, nous avons pu définir que les cellules souches ostéogéniques / progénitrices peuvent être génétiquement marqués par ac transitoirevation de la résistance de myxovirus -1 (MX1), le promoteur et les progéniteurs induite MX1 peut maintenir la majorité des ostéoblastes matures au cours du temps, mais ne participent pas à la production de chondrocytes chez la souris adulte 6. En outre, nous avons démontré que OSPCs Mx1 marqués fournissent la majorité des nouveaux ostéoblastes dans la guérison des fractures 6.

Ici, en utilisant des modèles de suivi ostéo-lignage et la microscopie intravitale, un protocole est prévue pour définir la cinétique in vivo de Mx1 + cellules souches / progénitrices ostéogéniques dans la réparation des fractures. Ce protocole offre imagerie séquentielle pour suivre le déplacement de ostéogéniques souches / progéniteurs dans les sites de fracture et la mesure quantitative de l'expansion de ostéoprogénitrices dans le processus de réparation rapide. Cette approche peut être utile dans de multiples contextes, y compris l'évaluation des candidats thérapeutiques pour améliorer la réparation osseuse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Souris et préconditionnement

Remarque: Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes et tous les protocoles ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l'Hôpital général du Massachusetts. Toute chirurgie doit être réalisée dans des conditions stériles en utilisant du matériel stérile à l'autoclave. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), et Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-tomate), étaient achetées auprès de Jackson Laboratories. souris ostéocalcine-GFP ont été fournies par le Dr Henry Kronenberg. Pour l'analyse quantitative de la migration et de la prolifération OSPC in vivo, + (couleur unique journaliste) souris Mx1-Cre + Rosa-YFP ont été utilisés. Pour un suivi plus détaillé de leur différenciation en ostéoblastes ostéocalcine + matures, nous avons utilisé trigenic Mx1-Cre + Rosa-tomate + OCN-GFP +les souris.

  1. Pour marquer Mx1 cellules + in vivo, préparer l'acide polyinosinique-polycytidylique (PIPC, 2,5 mg / ml) dans une solution de PBS stérile et injecter 200 pi pour 20 g de Mx1-Cre + souris par voie intrapéritonéale reporter une fois tous les deux jours pendant 10 jours.
  2. Pour éliminer les cellules hématopoïétiques MX1 + résidentes, irradier les souris avec une seule dose de 9,5 Gy. Après 24 heures d'irradiation, les cellules de greffe de type sauvage de la moelle osseuse (1x10 6 cellules / souris) par voie intraveineuse 16. Remarque: Comme les cellules Mx1 inductibles comprennent les cellules hématopoïétiques et les ostéoclastes hématopoïétiques dérivés, l'élimination de Mx1 + cellules hématopoïétiques améliore la qualité d'image et la quantification de Mx1 + cellules ostéogéniques.
  3. Après la transplantation de moelle osseuse, de surveiller les animaux pendant quatre à six semaines pour atteindre une repopulation réussie de cellules donneur de moelle osseuse.

2. MoPréparation utiliser

  1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de 50 ul de la kétamine / xylazine (100 mg / kg, xylazine 12 mg / kg de poids corporel) en utilisant une procédure IACUC approuvé. Remarque: La durée de l'effet peut être prolongée par une dose supplémentaire de kétamine / xylazine.
  2. Déterminer si la souris est totalement anesthésié par l'absence de réponse aux pieds et / ou de la queue pincées. (Facultatif) Lorsque la souris est anesthésiée, obtenir un masque à gaz isoflurane sur le nez en collant. Réglez le niveau de l'isoflurane à s'assurer que l'animal est entièrement sous sédation.
  3. Couper les poils du cuir chevelu à l'aide d'une tondeuse électrique ou de petits ciseaux. Retirer les fragments de cheveux et stériliser la peau exposée avec 70% tampon imbibé d'alcool. Appliquer le gel lacrymogène pour empêcher la déshydratation de la cornée.

3. Microfracture blessures

  1. Après s'être assuré que l'animal est entièrement sous sédation, faire une incision unique en forme de L inversé pour ouvrir la peau du cuir chevelu. En bref, faire une première incision transversale (moins de 1 cm) starting d'une oreille à l'autre oreille. Tournez ~ 60 ° et continuer à inciser vers le nez jusqu'à ~ 2-3 mm de nez. Remarque: cette incision minimise la formation de tissus cicatriciels au-dessus de la zone à imager.
  2. Séparez les lambeaux de peau en tirant vers les côtés avec une pince. Les deux os frontaux et l'intersection des sutures coronale et sagittale devront être clairement exposés.
  3. Nettoyer la surface ouverte par rinçage avec du PBS stérile et essuyage doux avec gaze ou de coton-tige stérile jusqu'à ce que tous les poils résiduels sont éliminés.
  4. Pour générer des microfractures sur la calotte crânienne, tenir la tête de la souris avec une main et une aiguille G 30 avec une autre main. Faire une micro-perforation (~ plaie de 0,2 mm de diamètre <1 mm de profondeur) sur l'os frontal gauche près de l'intersection des sutures sagittale et coronale en insérant la pointe d'une aiguille 30 G avec une légère pression et mouvement de torsion. Attention: Il est essentiel d'éviter l'aiguille de pénétrer dans le cerveau, réduisant ainsi bleeding et des lésions tissulaires.
  5. Passez à une plus grosse aiguille (20 ou 25 G) et élargir le trou de perforation en tournant l'aiguille (~ de 0,5 mm de diamètre).
  6. Répétez l'étape 3.3 à 3.5 pour générer deuxième ponction sur l'os frontal controlatéral.
  7. Essuyez les taches blessés par la chute continue de PBS jusqu'à ce que le saignement s'arrête.
    Remarque: Bleeding sur les sites de fracture va interférer avec l'imagerie appropriée et induire la formation de cicatrices.
  8. Appliquer une goutte de solution stérile de sérum physiologique ou de 2% Methocel sur le crâne pour éviter le séchage. Remarque: Ne laissez pas la surface du crâne à sécher, ce qui réduira la clarté d'image. Il est important d'utiliser une quantité suffisante de gel ou de solution saline pour couvrir la zone.

4. Imagerie intravitale

  1. (Facultatif) Avant imagerie, certaines souris sont injectés avec un colorant vasculaire pour visualiser les vaisseaux sanguins. Injecter rétro-orbitale avec 20 pi de Qtracker non ciblé 705 (2 uM solution dans 50 mM de tampon borate) dilué dans 80 ml de PBS. Utiliser une seringue à insuline pour réduire les déchets de réactif. Si le signal n'est pas suffisamment clair, des montants supplémentaires pourraient être nécessaires.
  2. Mettez le scanner. Remarque: Un scanner laser à base de polygones permet multi-canal d'acquisition d'image simultanée à la cadence vidéo (30 images par seconde). balayage de taux de la vidéo est très important pour l'imagerie des animaux vivants.
  3. Allumez le laser multi-photons (femto-seconde titane: saphir laser). Régler la longueur d'onde de 880 nm et d'ajuster la puissance pour la deuxième imagerie par génération d'harmoniques (440 nm) de l'os. Pour la GFP et tdTomato excitation, tournez sur la 491 nm et 561 lasers à l'état solide nm.
  4. Allumez le PMT (photomultiplicateurs) détecteurs pour chaque signal (a ± 20 nm de filtre 435 passe-bande pour la deuxième génération d'harmoniques, un ± 19 nm filtre 528 passe-bande pour la GFP, et 590 ± 20 pour tdTomato.) (Facultatif) Utilisez une 638 nm laser hélium-néon et un PMT avec un ± 27,5 nm filtre 695 passe-bande pour détecter Qtracker 705 signaux.
  5. Place l'animal sur une platine de microscope motorisée axes XYZ. Gardez la souris dans la position la plus confortable avec un coussin chauffant électrique pour aider à maintenir la température du corps (ce qui réduit le risque de perte de l'animal). Utilisez du ruban adhésif pour maintenir la souris pour minimiser le mouvement lors de l'imagerie et de maintenir la zone imagée aussi horizontale que possible.
  6. Appliquer une goutte de gel de méthylcellulose à chaud de 2% ou une solution saline physiologique sur le crâne pour éviter le séchage. Mettre une lamelle couvre-objet sur la zone de formation d'image. Utilisez un objectif de faible grossissement (30x objectif immersion dans l'eau à 0,9 NA) pour numériser la calotte crânienne.
  7. Utiliser le contrôleur axes XYZ, trouver la surface de calotte crânienne par détection du signal SHG à partir d'os et d'identifier un emplacement de point de repère essentiel, comme l'intersection entre les sutures sagittale et coronale sutures. Acquérir une image et enregistrer les coordonnées XYZ.
  8. Continuer à rechercher l'emplacement de la blessure en observant les signaux de SHG et de fluorescence.
  9. Lorsque les sites de blessures ou la région of intérêt se trouvent, acquérir une image de la meilleure plan focal contenant les signaux de fluorescence à partir de SHG et les cellules d'intérêt. Sauvegarder coordonnées XYZ et la distance à l'intersection des sutures sagittale et coronale de définir leur emplacement précis pour les prochains cycles de l'imagerie.
  10. Pour recueillir des structures 3D cellulaires et des os de blessure de fracture, d'enregistrer des images par Z-piles (2 - 5 Intervalle de um) avec ~ 100 um de profondeur de la surface de l'os endostéale. Après l'achèvement de l'imagerie d'un côté de la lésion, répéter le processus d'imagerie pour venir sites de blessures.

Procédures 5. Opération de post

  1. Après l'imagerie, rincer site d'imagerie avec une solution saline stérile pour enlever le gel de méthylcellulose à partir de la boîte crânienne. L'utilisation d'un coton-tige stérile, appliquer une petite quantité d'onguent antibiotique triple sur la surface. Couvrir les lambeaux de peau et re-fermer le cuir chevelu par suture chirurgicale. Cela peut être fait avec un fil de suture hypoallergénique (de polyglactin absorbable suture) et 5-0 taille aiguille de suture. Attention: Bonne technique de suture minimise la formation de cicatrices.
  2. Traiter tous les animaux avec injection IP de 0,05-0,1 mg / kg toutes les 12 heures de la buprénorphine pendant 48 heures après la chirurgie. Gardez les animaux dans une chambre de récupération à chaud jusqu'à ce qu'ils reprennent conscience suffisante. Après 3 à 5 jours, rouvrir la suture et répétez les étapes d'imagerie intravitale pour suivre le changement cellulaire pendant la guérison des fractures.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Le long modèle de fracture osseuse stabilisé a été populaire dans les études de fracture. Cependant, l'os long ou grands modèles de fracture causer des dommages aux tissus multiples et, par conséquent, avoir une limitation dans la mesure quantitative de la fonction des cellules de l'os. Nous avons développé une blessure mini-invasive (moins de 1 mm de diamètre avec peu ou pas d'invasion dans la dure-mère) sur la voûte du crâne avec os frontaux forage d'aiguille (figures 1A-1C). Nous avons choisi une vue de dessus des os frontaux calotte crânienne pour l'imagerie en temps réel in vivo de microfractures, car cet os a une structure osseuse plat et mince avec de la moelle osseuse, permettant image claire de l'os blessé, cellules osseuses, et le système vasculaire sans l'interférence d'autres tissus ( Figure 1C). Nous avons observé que cette microfracture récapitule les caractéristiques de nombreuses grandes lésions de rupture, y compris la formation d'un cal mou suivie par le dépôt de minéraux et formation de nouvel os (données non présentées).

"> Séquentielle dans l'imagerie in vivo de cellules souches + ostéogénique progénitrices Mx1. Nous avons ensuite testé si cette méthode est capable de suivre une population de cellules ostéogéniques particulier pendant la guérison des fractures. Auparavant, nous avons développé les souris double rapporteurs Mx1/Tomato/Ocn-GFP trigenic par croisant des souris Mx1-Cre avec Rosa26-tomate journaliste et souris ostéocalcine-GFP (figure 2A) 6. L'avantage de ce modèle est l'étiquetage différentiel de ostéogéniques souches / progéniteurs et les ostéoblastes matures. par l'administration PIPC, MX1 + OSPCs sont spécifiquement étiquetés par l'expression de la tomate, alors que les ostéoblastes matures différenciées des OSPCs Mx1 induites expriment tomate et GFP. Cependant, les ostéoblastes pré-existants et les ostéoblastes matures de Mx1 progéniteurs non inductibles expriment la GFP seule (figure 2B). Après le remplacement irradiation et la moelle osseuse, nous généralementATED deux microfractures sur les os frontaux de ces souris. Nous avons confirmé que la surface de chaque fracture a été détectée par un seul champ de vue notre objectif 30x. Séquentiel imagerie 3D-intravitale de microfractures a montré la relocalisation de tomate + OSPCs sur le site de la fracture au jour 2 et leur expansion au jour 5. N'y avait pas ou GFP indétectable + ostéoblastes en ce moment. Au jour 12, un sous-ensemble de ostéoprogéniteurs proches de la surface de rupture a initié la différenciation des ostéoblastes (tomate GFP + +). Par la suite, l'accumulation de nouveaux ostéoblastes et la formation de nouveaux os (analyse par génération de second harmonique, bleu) étaient évidentes au jour 21, ce qui indique que la migration et la prolifération des cellules progénitrices ostéogéniques est un mécanisme important pour fournir de nouveaux ostéoblastes qui participent à la guérison des fractures (figure 2C).

Cinétique de ostéogéniques souches / progéniteurs dans les réparations de fracture. TEst si notre méthode fournit une sortie cohérente et quantitative des numéros de ostéoprogénitrices pendant la guérison des fractures, nous avons utilisé le Mx1/YFP souris comme modèle lignée de suivi simple et traqué Mx1 + OSPCs au début de la réparation de la fracture. Après que les cellules de la moelle Mx1 + ont été remplacés par de type sauvage osseuse, nous avons généré des six microfractures indépendants (deux / souris) sur calvaria de souris Mx1/YFP. Lorsque Mx1/YFP + OSPCs ont été suivis pendant 14 jours après la blessure, nous avons constamment observé qu'un petit nombre de progéniteurs ont été détectés à l'endroit de la blessure de 3 jours. Les chiffres en continu a augmenté au jour 7, atteignant population de pic au jour 10 et le maintien de 14 jours (Figure 3A). Nous avons quantifié la cinétique de numéros ostéoprogénitrices en mesurant l'intensité du signal YFP (de traitement et d'analyse de l'image du programme ImageJ). Nous avons répété cette expérience avec une sortie similaire, ce qui suggère la cohérence de notre approche (figure 3B).

ss = "jove_content" fo: keep-together.within page = "always"> Figure 1
Figure 1. L'imagerie in vivo de blessure crânienne de la souris. (A) Représentation schématique des microfractures sur les frontales os de souris près de l'intersection des sutures coronale (CS) et sagittale (SS) et l'imagerie intravitale séquentielle. (B) exposition chirurgicale de la souris calvaria avant blessure. (C) les blessures de microfractures représentatifs sur calvaria de souris pour l'imagerie intravitale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

51289fig2.jpg "/>
Figure 2. Du suivi in vivo de OSPCs sur les sites de blessures. (A) Représentation schématique de trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP souris. (B) Ce schéma illustre les populations de cellules fluorescentes possibles qui apparaissent sur ​​les sites de blessures de trigenic Mx1/Tomato / ocn-GFP souris. Le rouge représente Mx1 + OSPCs exprimer tomate. Le jaune représente les ostéoblastes matures (tomate + GFP +) différenciés de Mx1 + OSPCs que représente vert de nouveaux ostéoblastes ostéoblastes (GFP +) ou Mx1 non inductible (MX1 -) pré-existants. Progéniteurs (C) Imagerie intravitale séquentielle de Mx1 + OSPCs et les ostéoblastes sur les sites de blessures. Tomate + ostéoprogéniteurs et GFP + ostéoblastes près de la blessure sur calvaria de souris Mx1/Tomato/Ocn-GFP ont été imagées immédiatement après la blessure (jour 0) et à til a indiqué à la suite de blessures. Les flèches indiquent les ostéoblastes dérivés de Mx1 OSPCs + (jaune). Bleu, os. Le cercle en pointillés représente la totalité (seul) site de la fracture. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Mesure cohérente et quantitative de OSPCs Mx1 induites pendant la guérison des fractures. (A) Trois blessures indépendants sur calvaria de souris Mx1/YFP ont été successivement imagés immédiatement après la blessure (jour 0) et aux moments indiqués après l'accident. (B) quantitative mesure de cellules souches / progénitrices ostéogéniques Mx1 +. La cinétique de Mx1 + OSPCl'expansion des sites de préjudice a été mesurée par YFP intensité de signal en utilisant ImageJ. Les graphiques montrent deux expériences indépendantes avec la moyenne des six blessés dans chaque expérience. Bleu, l'os; MX1 + cellules souches / progénitrices ostéogéniques verts; rouge, vasculaire (Q-points). Barres d'échelle sont 100 um (A). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La régulation des cellules souches du squelette peut être d'une grande importance pour définir de meilleures méthodes pour atteindre la régénération osseuse. Imagerie quantitative et séquentielle au niveau cellulaire a été un défi technique. Bien que le long os modèle de fracture de la souris a été largement utilisé et adapté pour les études biomécaniques 17, son emplacement profond des tissus, la taille de fracture inégale, lésions des tissus mous, et l'application des fixateurs de stabilisation ont limité l'imagerie intravitale séquentiel. Ici, un procédé pour surmonter ces limitations par la combinaison des confocale / deux photons microscopie intravitale et un modèle de fracture crânienne de la souris est disponible. Cette approche avec ostéogénique suivi souches / progénitrices lignée démontre sa capacité en temps réel, l'imagerie in vivo de ostéogéniques souches / progéniteurs dans la réparation des fractures.

Un défi technique majeur de cette méthode est d'obtenir des images cohérentes et de qualité au fil du temps. Im haute qualitéâges avec la profondeur d'imagerie maximale dépend de la luminosité des rapporteurs fluorescents et de l'état du tissu de la zone d'imagerie. En outre, en minimisant l'exposition du laser pour éviter des dommages aux tissus et photoblanchiment est important pour l'imagerie séquentielle à long terme. Balayage rapide en utilisant la plate-forme de cadence vidéo est utile à cette fin. Si un seul champ de vue ne peut pas couvrir les dommages ensemble, la zone peut être mappé en prenant des images montage pour couvrir la plupart des sites de fracture. Il est important de faire un compromis entre la qualité de la Z-pile et le nombre d'informations acquises au cours de la totalité de la session de formation d'image. Par exemple, Z-piles avec de nombreuses tranches (par exemple 1-2 um étapes) et haute définition sont plus faciles à analyser plus en détail; Toutefois, ils requièrent l'exposition au laser de longue durée qui conduit à un plus haut degré de photoblanchiment induite par laser.

Depuis séquentielle en imagerie in vivo de lésions de la fracture nécessite l'ouverture chirurgicale répétitif de la peau et la surface de l'os,formation d'une cicatrice fibreuse sur la surface de calotte crânienne est un problème commun qui interrompt l'imagerie des tissus profonds et donne fond grande floraison. Techniques de suture qualifiés et des saignements minimum est essentielle pour réduire la formation de cicatrices. En général, trois à cinq fois la répétition d'image peut être obtenue sans perte significative de la qualité de l'image.

Compte tenu de la possibilité d'une formation d'image répétée, la commande facile et précise de la taille de la fracture et la consistance de la cinétique de réparation, ce procédé peut fournir un moyen raisonnable pour tester des cibles thérapeutiques pour la guérison de fractures, l'ostéoporose, et d'autres la régénération des tissus tels que les muscles du squelette.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions C. Park pour la lecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIAMS sous Award Nombre K01AR061434 et un prix Leukemia & Lymphoma Society Bourse (5127-09) à DP et des subventions des Instituts nationaux de la santé pour le CPL et DTS Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Harada, S., Rodan, G. A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature. 423, 349-355 (2003).
  2. Manolagas, S. C., Parfitt, A. M. What old means to bone. Trends Endocrinol Metab. 21, 369-374 (2010).
  3. Khosla, S., Riggs, B. L. Pathophysiology of age-related bone loss and osteoporosis. Endocrinol Metab Clin North Am. 34, 1015-1030 (2005).
  4. Friedenstein, A. J., Chailakhyan, R. K., Latsinik, N. V., Panasyuk, A. F., Keiliss-Borok, I. V. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation. 17, 331-340 (1974).
  5. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  6. Park, D., et al. Endogenous Bone Marrow MSCs Are Dynamic, Fate-Restricted Participants in Bone Maintenance and Regeneration. Cell Stem Cell. 10, 259-272 (2012).
  7. Schindeler, A., McDonald, M. M., Bokko, P., Little, D. G. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin Cell Dev Biol. 19, 459-466 (2008).
  8. Holstein, J. H., et al. Rapamycin affects early fracture healing in mice. Br J Pharmacol. 154, 1055-1062 (2008).
  9. Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell. 19, 329-344 (2010).
  10. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30, 187-196 (2012).
  11. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  12. Kovar, J. L., et al. Near-infrared-labeled tetracycline derivative is an effective marker of bone deposition in mice. Anal Biochem. 416, 167-173 (2011).
  13. Mayer-Kuckuk, P., Boskey, A. L. Molecular imaging promotes progress in orthopedic research. Bone. 39, 965-977 (2006).
  14. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  15. Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
  16. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, 11-22 (2009).
  17. Tu, Q., et al. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone. Tissue Eng. 13, 2431-2440 (2007).
Séquentiel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des cellules souches / progénitrices ostéogéniques lors de la réparation de la fracture
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter