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Medicine

Sequentiell doi: 10.3791/51289 Published: May 23, 2014

Summary

Quantitative Messung der Knochenvorläuferfunktion in Frakturheilung erfordert hohe Auflösung Serienbildtechnologie. Hier werden Protokolle für die Verwendung von Intravitalmikroskopie und Osteo-Linie Tracking Bild sequentiell und Quantifizierung der Migration, Proliferation und Differenzierung der knochenbild endogene Stammzellen / Vorläuferzellen in den Prozess der Reparatur von Knochenbrüchen vorgesehen ist.

Abstract

Knochen dreht sich ständig und ist sehr regenerative nach Verletzungen. Osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen haben die Hypothese aufgestellt worden, lange zu existieren, aber in vivo Nachweis solcher Zellen wurde erst kürzlich erreicht. Dabei sind in vivo bildgebende Verfahren, die Rolle von endogenem osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen (OSPCs) und deren Nachkommen in Knochenreparatur zu untersuchen ist. Mit Osteo-Linie Zellverfolgung Modelle und Intravital Bildgebung von induzierten Mikrofrakturen im Knochen Schädel kann OSPCs direkt während der ersten paar Tage nach der Verletzung, in der kritische Ereignisse in der frühen Reparaturprozess auftreten beobachtet werden. Verletzungsstellen nacheinander abgebildet werden enthüllt, dass OSPCs verlagern, um der Verletzung, vermehren und differenzieren sich in knochenbildenden Osteoblasten. Diese Methoden bieten ein Mittel zur Untersuchung der Rolle von Stammzellen-intrinsische und extrinsische molekulare Regulatoren für die Knochenregeneration und Reparatur.

Introduction

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Degenerative Knochenerkrankungen und altersbedingten Knochenverlust führt zu einem hohen Risiko für osteoporotische Fraktur zu einer großen Herausforderung für die öffentliche Gesundheit ein. Knochenerhalt wird von knochenbildenden Osteoblasten und Osteoklasten Knochen gesteuert. Mängel der knochenbildenden Zellen sind die Hauptursache der altersbedingten Knochenverlust und degenerative Knochenerkrankungen 2,3. Während umfangreiche Forschung hat sich auf die Verbesserung der Frakturheilung konzentriert, um die Entdeckung der zuverlässige Medikamente degenerative Knochenerkrankungen zu heilen und die Schwäche der osteoporotischen Frakturen umkehren bleibt ein wichtiges Thema. So studieren die Quelle der knochenbildenden Zellen und ihre Kontrollmechanismen in der Knochenregeneration und Reparatur stellt eine neuartige Einblicke in Skelett-Regeneration zu verbessern und umzukehren Knochenverlust Krankheiten.

Das Vorhandensein von multi mesenchymalen Zellen im Knochenmark wurde basierend auf der Identifikation von klonogenen Populationen vorgeschlagen, könnten unterschiedlicheiate in osteogene, chondrogene adipogene und Ex-vivo-Linien 4. kurzem mehrere Studien haben berichtet, dass Skelett / mesenchymale Stammzellen (SSC / MSC) sind eine natürliche Quelle von Osteoblasten und sind entscheidend für die Knochenumsatz, Umbau-, Reparatur-und Bruch 5,6 . Darüber hinaus unsere Linie-Tracing-Studie ergab, dass reife Osteoblasten haben eine unerwartet kurze Halbwertszeit (~ 60 Tage) und werden kontinuierlich durch ihre Stammzellen / Vorläuferzellen in beiden normalen homöostatischen und Bruchreparaturbedingungen 6 aufgefüllt. Die in vivo-Identität von Stammzellen und wie solche Zellen reagieren jedoch um Verletzungen zu zerbrechen und liefern knochenbildenden Zellen sind unklar. Daher ist es wichtig, eine Methode, die in der Lage, die Migration, Proliferation und Differenzierung endogener SSC / MSCs in unter physiologischen Bedingungen zu analysieren entwickeln.

Bruchreparatur ist ein vielzelliger und dynamischer Prozess durch eine Anordnung von komplexen geregeltZytokine und Wachstumsfaktoren 7. Die beliebteste Ansatz für die Bruch Studien ist es, ein Tiermodell mit langKnochenBruch zu nutzen und Knochen durch Knochen Schnitte und Immunfluoreszenz-Techniken 10.08 analysieren. Dieses Reparaturverfahren kann von mehreren Bildgebungstechniken einschließlich Mikro-CT 11, Nah-Infrarot-Fluoreszenz 12 und Chemilumineszenz Abbildungs ​​13 überwacht werden. Jedoch hat jede dieser Techniken bestimmte Beschränkungen und es wurde keine wirksame Möglichkeit, SSC / MSC-Funktion auf zellulärer Ebene in vivo zu überwachen. Kürzlich, konfokale / Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie wurde entwickelt und verwendet werden, um Krebszellen und transplantierten hämatopoetischen Stammzellen auch bei Single-Cell-Auflösung in lebenden Tieren 14 zu erfassen im Rahmen der ihr Knochenmark-Mikroumgebung. Durch die Kombination dieser Technologie mit einer Reihe von Linienverfolgungsmodelle, waren wir in der Lage, festzulegen, dass osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen genetisch durch transiente ac gekennzeichnetvierung des Myxovirus Widerstand -1 (MX1)-Promotor und Mx1-induzierte Vorläuferzellen können die Mehrheit der reifen Osteoblasten im Laufe der Zeit zu halten, aber nicht in der Erzeugung von Chondrozyten in der erwachsenen Maus 6 zu beteiligen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Mx1-markierten OSPCs liefern die Mehrheit der neuen Osteoblasten in Frakturheilung 6.

Hier mit Osteo-Linie Verfolgungsmodelle und Intravitalmikroskopie wird ein Protokoll vorgesehen, um die in vivo-Kinetik Mx1 + osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchreparatur zu definieren. Dieses Protokoll bietet sequentielle Bildgebung, um die Verlagerung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchstellen und die quantitative Messung der Osteoprogenitorzellen Expansion in der frühen Reparaturprozess zu verfolgen. Dieser Ansatz kann sinnvoll in mehreren Zusammenhängen einschließlich der Bewertung der therapeutischen Kandidaten für die Knochenreparatur zu verbessern.

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Protocol

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1. Mäuse und Präkonditionierung

Hinweis: Alle Mäuse wurden in keimfreien Bedingungen gehalten und alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital genehmigt. Alle Operation sollte unter sterilen Bedingungen mit sterilen autoklaviert Ausrüstung durchgeführt werden. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-Stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP) und Rosa26-loxP-Stop-loxP-tdTomato (Rosa-Tomate), waren von Jackson Laboratories. Osteocalcin-GFP-Mäuse wurden durch Dr. Henry Kronenberg zur Verfügung gestellt. Für die quantitative Analyse der OSPC Migration und Proliferation in vivo wurden Mx1-Cre + Rosa-YFP + (einfarbig-Reporter)-Mäusen verwendet. Für detaillierte Verfolgung von deren Differenzierung in Osteocalcin + reifen Osteoblasten, verwendeten wir trigenic Mx1-Cre + Rosa-Tomate + OCN-GFP +Mäusen.

  1. MX1 +-Zellen in vivo zu kennzeichnen, bereiten Polyinosin-Polycytidylsäure (Pipc, 2,5 mg / ml) in sterile PBS-Lösung und injizieren 200 ul für 20 g Mx1-Cre + Reporter Maus intraperitoneal einmal jeden zweiten Tag für 10 Tage.
  2. Um ansässig Mx1 + hämatopoetischen Zellen zu beseitigen, bestrahlen Mäusen, die mit einer Einzeldosis von 9,5 Gy. Nach 24 Stunden der Bestrahlung, Transplantationswildtyp-Knochenmark-Zellen (1x10 6 Zellen / Maus) intravenös 16. Hinweis: Da Mx1-induzierbare Zellen schließen hämatopoetischen Zellen und hämatopoetischen stammenden Osteoklasten, die Beseitigung von Mx1 + hämatopoetischen Zellen verbessert die Bildqualität und die Quantifizierung von Mx1 + osteogenen Zellen.
  3. Nach Knochenmarktransplantation, überwachen Tiere für vier bis sechs Wochen, um eine erfolgreiche Wiederbesiedlung von Spendermarkzellen zu erreichen.

2. MoVorbereitung nutzen

  1. Maus anästhesiert durch intraperitoneale Injektion von 50 ul Ketamin / Xylazin (100 mg / kg, Xylazin 12 mg / kg Körpergewicht) unter Verwendung eines IACUC-genehmigten Verfahren. Hinweis: Die Dauer der Wirkung kann durch eine zusätzliche Dosis von Ketamin / Xylazin erweitert werden.
  2. Zu bestimmen, ob die Maus vollständig durch die fehlende Reaktion auf Zehe und / oder Schwanz drückt anästhesiert. (Optional) Wenn die Maus narkotisiert, sichern eine Isofluran-Gasmaske über der Nase durch Abkleben. Stellen Sie den Pegel von Isofluran, um sicherzustellen, das Tier völlig ruhig gestellt wird.
  3. Clip der Kopfhaare mit einem elektrischen Trimmer oder kleine Schere. Entfernen Sie die Haare Fragmente und sterilisieren die freiliegende Haut mit 70% Alkoholtupfer. Bewerben Tränen Gel auf der Hornhaut eine Austrocknung zu verhindern.

3. Microfracture Injury

  1. Nachdem sichergestellt wurde, das Tier völlig ruhig gestellt ist, stellen Sie einen einzelnen umgekehrten L-förmigen Einschnitt, um die Kopfhaut zu öffnen. Kurz gesagt, einen ersten Querschnitt (weniger als 1 cm) starting von einem Ohr zum anderen Ohr. Schalten ~ 60 ° und weiter in Richtung der Nase einzuschneiden, bis ~ 2-3 mm von der Nase. Anmerkung: Dieser Schnitt die Bildung von Narbengewebe über dem abzubildenden Bereich minimiert.
  2. Trennen Sie die Hautlappen durch Ziehen zu den Seiten hin mit einer Pinzette. Beide Stirnbeins und der Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Naht sollte klar freigelegt werden.
  3. Reinigen Sie die offene Fläche durch Spülen mit sterilem PBS und sanfte Wisch mit steriler Gaze oder einem Wattestäbchen, bis alle Resthaare werden eliminiert.
  4. Um Mikrofrakturen auf dem Schädeldach zu erzeugen, halten Sie die Mauskopf mit einer Hand und eine 30-G-Nadel mit einer anderen Hand. Machen Sie eine Mikropunktion (~ 0,2 mm Durchmesser Wunde mit <1 mm Tiefe) auf der linken Stirnbein in der Nähe der Kreuzung der sagittalen und Koronarnaht indem Sie die Spitze einer 30 G-Nadel mit sanftem Druck und Drehbewegung. Achtung: Es ist wichtig, um die Nadel am Eindringen in das Gehirn zu vermeiden, wodurch die Minimierung bleeding-und Gewebeschäden.
  5. Wechseln Sie zu einem größeren Nadel (20 oder 25 G) und erweitern das Einstichloch durch Drehen der Nadel (Durchmesser ~ 0,5 mm).
  6. Wiederholen Sie Schritt 3,3 bis 3,5 auf den zweiten Punktion auf der kontralateralen Stirnbein zu generieren.
  7. Wischen Sie die verletzten Stellen durch kontinuierliche Absinken der PBS bis die Blutung aufhört.
    Hinweis: Blutung auf Bruchstellen werden mit entsprechenden Bild stören und Narbenbildung induzieren.
  8. Einen Tropfen steriler physiologischer Kochsalzlösung oder 2% Methocel auf den Schädel, um ein Austrocknen zu verhindern. Hinweis: Lassen Sie keine der Schädeloberfläche, um zu trocknen, die Klarheit des Bildes verringert wird. Es ist wichtig, eine ausreichende Menge an Gel oder Kochsalzlösung verwenden, um den Bereich abzudecken.

4. Intravital Imaging

  1. (Optional) vor der Bilderzeugung, einige Mäuse mit einem Gefäß Farbstoff, um die Blutgefäße injiziert visualisieren. Injizieren retroorbital mit 20 ul von nicht-zielgerichteten Qtracker 705 (2 &mgr; M-Lösung in 50 mM Borat-Puffer), verdünnt in 80 ml PBS. Verwenden Sie eine Insulinspritze zu Reagenz Abfall zu minimieren. Wenn das Signal nicht ausreichend hell ist, könnten zusätzliche Mengen benötigt werden.
  2. Schalten Sie den Scanner. Hinweis: Ein Polygon-basierte Laserscanner ermöglicht die gleichzeitige Mehrkanal-Bildaufnahme in Videorate (30 Bilder pro Sekunde). Video Rate Scannen ist für Live-Tierbildgebung sehr wichtig.
  3. Einschalten des Multiphotonen-Laser (Femtosekunden-Titan: Saphir-Laser). Stellen Sie die Wellenlänge auf 880 nm und stellen die Energie für Erzeugung der zweiten Harmonischen-Bildgebung (440 nm) des Knochens. Für GFP und tdTomato Anregung, schalten Sie die 491 nm und 561 nm Festkörperlaser.
  4. Schalten Sie den PMT (Fotovervielfacherröhre) Detektoren für jedes Signal (ein 435 ± 20 nm Bandpassfilter für die zweite Harmonische ein 528 ± 19 nm Bandpassfilter für GFP, und 590 ± 20 für tdTomato.) (Optional) verwenden eine 638 nm Helium-Neon-Laser und einen PMT mit einer 695 ± 27,5 nm Bandpassfilter zur Detektion Qtracker 705 Signal.
  5. Place das Tier auf einer XYZ-Achsen-motorisierte Mikroskoptisch. Halten Sie die Maus in die bequemste Position mit einem elektrischen Heizkissen zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur (dies reduziert das Risiko von Tierverlust). Verwenden Sie Klebeband, um die Maus zu halten, um die Bewegung während der Bildaufnahme zu minimieren und die Bildfläche so waagerecht wie möglich zu halten.
  6. Einen Tropfen warmen 2% Methylcellulose-Gel oder physiologischer Kochsalzlösung auf den Schädel, um ein Austrocknen zu verhindern. Setzen Sie ein Deckglas auf dem Imaging-Bereich. Verwenden Sie eine niedrige Vergrößerungslinse (30x Wasserimmersionsobjektiv mit 0,9 NA), um die Schädeldecke zu scannen.
  7. Mit der XYZ-Achsen-Steuerung, finden Sie die Oberfläche der Kalotte durch Erfassen der SHG-Signal von Knochen und identifizieren eine entscheidende Meilenstein Lage, wie der Schnittpunkt zwischen der sagittalen Nähten und Koronarnaht. Erwerben Sie ein Bild und notieren Sie die XYZ-Koordinaten.
  8. Weiterhin für den Ort der Verletzung durch die Beobachtung SHG-und Fluoreszenzsignalen.
  9. Wenn Verletzungsstellen oder die Region of Interesse gefunden werden, erhalten ein Bild der besten Fokusebene enthält SHG-und Fluoreszenzsignale von den Zellen von Interesse. Speichern XYZ-Koordinaten und der Abstand zum Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Naht, ihre genaue Position für die nächste Runde der Abbildungs ​​definieren.
  10. Um 3D-Zell-und Knochenstrukturen von Bruchschäden sammelt, speichert Bilder von Z-Stapel (2-5 um Intervall) mit ~ 100 um Tiefe von endostalen Knochenoberfläche. Nach Abschluss der Bildgebung von einer Seite der Verletzung, wiederholen Abbildungsprozesses für die nächste Verletzungsstellen.

5. Beitrag Operation Procedures

  1. Nach der Bild gründlich Bildstelle mit steriler Kochsalzlösung, die Methylcellulose-Gel aus dem Schädel zu entfernen. Mit einem sterilen Wattestäbchen, eine kleine Menge von Triple antibiotische Salbe auf der Oberfläche. Decken Sie die Hautlappen und wieder schließen, die Kopfhaut durch chirurgische Naht. Dies kann mit einer hypoallergenen Nähfaden (resorbierbaren Polyglactin su getan werdentur) und 5-0 Größe Nähnadel. Achtung: Gute Nahttechnik minimiert Narbenbildung.
  2. Behandeln Sie alle Tiere, die mit IP-Injektion von 0,05 bis 0,1 mg / kg alle 12 h Buprenorphin für 48 Stunden nach der Operation. Halten Sie Tiere in einer Wärmerückgewinnung Kammer, bis sie genügend Bewusstsein wieder zu erlangen. Nach 3 bis 5 Tagen, öffnen Sie erneut den Faden und wiederholen Intravital-Bildgebung vor, um die zellulären Veränderungen während der Frakturheilung zu verfolgen.

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Representative Results

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Die stabilisierte lange Knochenbruch-Modell wurde populär in der Bruchstudien. , Lange Knochen oder große Bruch Modelle führen jedoch mehrere Gewebeschäden und daher eine Beschränkung in der quantitativen Messung der Knochenzellfunktion. Wir entwickelten eine minimal invasive Schädigung (weniger als 1 mm Durchmesser mit minimaler oder ohne Eindringen in die Dura mater) am Schädelknochen frontal mit Nadelbohrung (Fig. 1A-1C). Wir wählten eine Draufsicht auf die Schädelstirnbein für in vivo-Bildgebung von Live-Mikrofrakturen, weil dieser Knochen hat eine flache und dünne Knochenstruktur mit Knochenmark, wodurch klare Bilder von verletzten Knochen, Knochenzellen und Gefäßsystem ohne die Einmischung anderer Gewebe ( Figur 1C). Wir beobachteten, dass diese Mikrofraktur rekapituliert viele Eigenschaften von großen Bruchverletzungen einschließlich alkoholHornHautBildung, gefolgt von Mineralabscheidung und Knochenneubildung (Daten nicht gezeigt).

"> Sequential in-vivo-Bildgebung von Mx1 + osteogene Stammzellen Vorläuferzellen. Nächstes testeten wir, ob diese Methode in der Lage, die Verfolgung eines bestimmten osteogenen Zellpopulation während der Frakturheilung ist. Zuvor die trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP Dual Reporter Mäuse entwickelten wir durch Kreuzung Mx1-Cre Mäusen mit Rosa26-Tomate Reporter und Osteocalcin-GFP Mäusen (2A) 6. Vorteil dieses Modells ist der Differenz Kennzeichnung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen und reife Osteoblasten. Durch Pipc Verwaltung, MX1 + OSPCs sind speziell gekennzeichnet von der Tomate Ausdruck, während reife Osteoblasten aus Mx1-induzierte OSPCs differenziert ausdrücken Tomaten und GFP. jedoch bereits bestehenden reifen Osteoblasten und Osteoblasten aus nicht-induzierbaren Mx1 Vorläuferzellen exprimieren GFP allein (Abbildung 2B). Nach der Bestrahlung und Knochenmark-Ersatz, wir GenerATED zwei Mikrofrakturen an den Stirnknochen dieser Mäuse. Wir bestätigten, daß die Fläche jeder Fraktur durch einen einzigen Sichtfeld mit unseren 30x Ziel detektiert. Sequential 3D-Bildgebung von Intravitalmikrofrakturen zeigten die Verlagerung von Tomato + OSPCs in der Website der Fraktur an Tag 2 und ihrer Expansion an Tag 5. Es gab zu dieser Zeit keine oder nicht nachweisbar GFP + Osteoblasten. Am Tag 12 wird eine Teilmenge der osteoprogenitors nahe der Bruchfläche hat die Differenzierung von Osteoblasten (Tomate GFP + +). Anschließend wird die Akkumulation von neuen Osteoblasten und die Knochenneubildung (durch Erzeugung der zweiten Harmonischen analysiert, blau) waren offensichtlich am Tag 21, was anzeigt, dass die Migration und Proliferation von osteogenen Vorläuferzellen ist ein wichtiger Mechanismus, um neue Osteoblasten, die an der Frakturheilung (Abbildung liefern 2C).

Kinetik der osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruch Reparaturen. Um test, ob unsere Methode bietet eine konsistente und quantitative Leistung von Osteoprogenitorzellen Zahlen während der Frakturheilung, die Mx1/YFP Maus verwendeten wir als einfache Linie-Tracking-Modell und verfolgt Mx1 + OSPCs in der frühen Frakturheilung. Nachdem Mx1 + Markzellen von Wildtyp-Knochenmark ersetzt erzielten wir sechs unabhängigen Mikrofrakturen (zwei / Maus) auf Mx1/YFP Maus Schädeldecke. Wenn Mx1/YFP + OSPCs wurden für 14 Tage nach der Verletzung verfolgten wir konsequent beobachtet, dass eine kleine Anzahl von Vorläuferzellen wurden an der Verletzungsstelle um 3 Tagen nachgewiesen. Die Zahlen fortlaufend erhöht am Tag 7, wobei Spitzenpopulation am Tag 10 und 14 erhalt Tage (Fig. 3A). Wir quantifizieren die Kinetik der Osteoprogenitorzellen Zahlen durch Messung YFP Signalintensität (Bildverarbeitung und Analyse mit dem ImageJ-Programm). Wir wiederholten das Experiment mit einem ähnlichen Ausgang, was die Konsistenz unseres Ansatzes (Abbildung 3B).

ss = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 1
1. In-vivo-Bildgebung von Maus-Schädelverletzung. (A) Schematische Darstellung der Mikrorisse auf der Maus frontalen Knochen in der Nähe der Kreuzung der koronalen (CS) und sagittalen Naht (SS) und sequentieller intravitalen Imaging. (B) der chirurgischen Freilegung der Maus Schädeldecke vor Verletzungen. (C) Repräsentative Mikrofraktur Verletzungen am Schädeldecke Maus für Intravital-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. In vivo Verfolgung von OSPCs an den Verletzungsstellen. (A) Schematische Darstellung der trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP Maus. (B) Das Diagramm veranschaulicht mögliche fluoreszierenden Zellpopulationen, die an Verletzungsstellen von trigenic Mx1/Tomato erscheinen / Ocn-GFP-Maus. Rot steht für Mx1 + OSPCs ausdrücken Tomaten. Gelb steht für reife Osteoblasten (Tomate + GFP +) aus Mx1 + OSPCs differenziert wohingegen Grün stellt neue Osteoblasten, die aus bereits bestehenden Osteoblasten (GFP +) oder nicht-induzierbaren Mx1 (MX1 -). Vorläuferzellen (C) Sequential Intravital-Bildgebung von Mx1 + OSPCs und Osteoblasten an den Verletzungsstellen. Tomate + osteoprogenitors und GFP + Osteoblasten in der Nähe der Verletzung auf Mx1/Tomato/Ocn-GFP Maus Schädeldecken wurden unmittelbar nach der Verletzung (Tag 0) und bei t abgebildeter angegebenen Zeiten nach der Verletzung. Die Pfeile zeigen die Osteoblasten aus Mx1 + OSPCs (gelb) abgeleitet. Blau, Knochen. Die gestrichelte Kreis stellt die gesamte (Einzel-) Fraktur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Fig. 3
Abbildung 3. Konsequente und quantitative Messung der Mx1-induzierte OSPCs während der Frakturheilung. (A) Drei unabhängige Verletzungen am Mx1/YFP Maus Schädeldecken wurden nacheinander unmittelbar nach der Verletzung (Tag 0) und zu den angegebenen Zeiten nach der Verletzung abgebildet. (B) Quantitative Messung der Mx1 + osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen. Die Kinetik der Mx1 + OSPCExpansion an Verletzungsstellen wurde von YFP Signalintensität mit ImageJ gemessen. Diagramme zeigen zwei unabhängigen Experimenten mit dem Durchschnitt von sechs Verletzungen in jedem Experiment. Blau, Knochen; grün, Mx1 + osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen; rot, Gefäßen (Q-Punkte). Maßstabsbalken sind 100 um (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Die Regulierung der Skelett Stammzellen von großer Bedeutung für die Definition bessere Methoden, um die Knochenregeneration zu erreichen. Quantitative und sequentielle Bildgebung auf zellulärer Ebene ist technisch anspruchsvoll gewesen. Obwohl die Maus Röhrenknochenfrakturmodell wurde weit verbreitet und eignet sich für biomechanische Studien 17, haben ihre tiefe Gewebestelle, unebene Bruch Größe, Weichteilschaden, und die Anwendung der stabilisierenden Fixateur sequentielle Bildgebung Intravital begrenzt. Hier wird ein Verfahren, diese Einschränkungen durch die Kombination der konfokalen / Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie und eine Mausschädelbruch Modell überwunden wird. Dieser Ansatz mit osteogenen Stammzellen / Vorläufer Linie Tracking demonstriert seine Fähigkeit zur Echtzeit-, in-vivo-Bildgebung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchreparatur.

Eine große technische Herausforderung bei dieser Methode ist es, konsistente und qualitativ hochwertige Bilder über die Zeit zu erhalten. Hohe Qualität imAlter bei maximaler Bildtiefe abhängig von der Helligkeit der Fluoreszenzreporter und dem Gewebezustand des Bilderzeugungsbereichs. Darüber hinaus ist die Laserbelichtung zu minimieren, um Gewebeschäden zu vermeiden und Bleichen wichtig für die langfristige sequentiellen Bildgebung. Schnelles Scannen mit der Videorate Plattform ist hilfreich für diesen Zweck. Wenn eine einzelne Sichtfeld können ganze Verletzungen nicht aus, kann der Bereich, indem Montagebilder, die meisten der Bruchstellen decken abgebildet werden. Es ist wichtig, zwischen der Qualität der Z-Stapel und der Menge an Informationen, die während der gesamten Abbildungssitzung erfasst beeinträchtigen. Beispielsweise sind Z-Stapel mit vielen Schichten (z. B. 1-2 &mgr; m-Schritten) und High-Definition einfacher, weiter zu analysieren; sie erfordern jedoch langfristig die Laserbelichtung, die zu einem höheren Grad der laserinduzierte Photobleichen.

Da sequentielle Bildgebung in vivo Bruchschäden erfordert die wiederholte chirurgische Eröffnung der Haut und Knochenoberfläche,fibrotische Narbenbildung auf der Oberfläche der Schädeldecke ist ein häufiges Problem, das tiefe Gewebe-Bildgebung unterbricht und ergibt hohe Blüte Hintergrund. Handnahttechniken und minimale Blutung ist entscheidend, um die Narbenbildung zu verringern. In der Regel drei bis fünf Zeitwiederholungs Bildgebung ohne wesentlichen Verlust der Bildqualität erreicht werden.

Angesichts der Möglichkeit der Wiederholung Bildgebung, die eine einfache und genaue Steuerung der Bruch Größe und Konsistenz der Reparatur Kinetik kann dieses Verfahren eine hinreichend sichere Mittel zum Testen therapeutische Ziele für die Frakturheilung, Osteoporose und anderen Geweberegeneration, wie Skelettmuskel.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen zu haben.

Acknowledgments

Wir danken C. Park zum Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die Auszeichnung unter NIAMS Anzahl K01AR061434 und Leukemia & Lymphoma Society Fellowship Award (5127-09) zu DP unterstützt und Zuschüsse von den National Institutes of Health zu CPL und DTS Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J (H-2b) Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) 000664
Ketamine Hydrochloride Injection Bionichepharma 67457-001-10  Vial size: 10 ml (50 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution Lloyd Inc. NADA# 139-236
Buprenorphine Hl BEDFORD LAB NDC 55390-100-10 Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg
DPBS, 1X CORNING cellgro 21-031-CV
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) Kendall WEBCOL 5110
Fine Surgical Scissor F.S.T 14568-09
Extra fine Forceps F.S.T 11150-10
VICRYL*Plus Suture Ethicon VCP490G
Qtracker 705 non-targeted quantum dot Invitrogen Q21061
Methocel 2% OmmiVision
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid)   Sigma P0913-50MG 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser Cobolt AB
Radius-635 HeNe laser Coherent

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References

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Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair
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Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).More

Park, D., Spencer, J. A., Lin, C. P., Scadden, D. T. Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair. J. Vis. Exp. (87), e51289, doi:10.3791/51289 (2014).

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