Elektrisk Cell-substrat Impedans Sensing for kvantifisering av endotel Proliferation, barrierefunksjon, og Motilitet

Summary

Denne protokollen vurderinger Elektrisk celle-substrat-impedans Sensing, en metode for å registrere og analysere impedans spekteret av adherente celler for kvantifisering av cellefesting, spredning, motilitet, og cellulære responser til farmakologiske og toksiske stimuli. Påvisning av endothelial permeabilitet og vurdering av celle-celle og celle-substrat kontakter er vektlagt.

Abstract

Elektrisk celle-substrat-impedans Sensing (ECIS) er en in vitro-impedans-målesystemet for å kvantifisere oppførselen til cellene i løpet av adherente cellelagene. For dette formål blir cellene dyrket i spesielle kulturen kamre på toppen av motstående, sirkulære gullelektroder. En konstant liten vekselstrøm tilføres mellom elektrodene og den potensielle faren måles. De isolerende egenskapene til cellemembranen opprette en motstand mot den elektriske strøm som resulterer i en økt elektrisk potensial mellom elektrodene. Måling av cellulær impedans på denne måte tillater automatisert undersøkelse av cellefesting, vekst, morfologi, funksjon og motilitet. Selv om ECIS målingen i seg selv er grei og lett å lære, er den underliggende teorien kompleks og valg av riktige innstillinger og riktig analyse og tolkning av data er ikke selvinnlysende. Likevel, en klar protokoll som beskriver de enkelte skritt fra den eksperimentelledesign til forberedelse, realisering, og analyse av eksperimentet er ikke tilgjengelig. I denne artikkelen grunnmåleprinsipp, samt mulige bruksområder, er eksperimentelle vurderinger, fordeler og begrensninger av ECIS system diskutert. A guide er anordnet for studiet av celleadhesjon, spre og proliferasjon; kvantifisering av celle oppførsel i et sammenflytende lag, med hensyn til barrierefunksjon, celle motilitet, kvaliteten på celle-celle-og celle-substrat-adhesjon, og kvantifisering av sårheling og cellulære responser til vasoaktive stimuli. Representative resultatene er omtalt basert på menneskelig microvascular (MVEC) og humane navlestrengsvenen endotelceller (HUVEC), men gjelder for alle heft voksende celler.

Introduction

ΩΩΩHere presenterer vi Elektrisk celle-substrat-impedans Sensing, kjent som ECIS, en spesifikk metode for å måle og analysere impedans spektrum av adherente celler i kultur ^1.. Målet med denne protokollen er å tilby en generelt anvendbar guide for bruk av denne typen impedans basert cellulære analyser og gi protokoller for noen av de viktigste funksjonene fra den stadig økende antall søknader. Det vil være fokus på studiet av celleproliferasjon, barrierefunksjon, celle veikryss, og cellemotilitet.

Siden ECIS og tilhørende modell for å transformere impedansspektroskopi data i biologisk relevante parametere ble innført i sin nåværende form til det vitenskapelige miljøet ved Giæver og Keese i 1991 ^2, har det ofte blitt referert til som et system for måling av Teer (trans -epitelial elektrisk motstand), noe som ikke er nøyaktige. Forskjellene synes marginale i første, mener viktig for tolking. For klassiske Teer målinger, er celler dyrket på permeable filtrene til å karakterisere paracellular transportmekanismer, som er dominert av epitel trange veikryss eller endothelial adherens veikryss ^tre. Vanligvis er to elektroder som er plassert over og under filteret som brukes til å søke en likestrøm (DC) flyte over cellelaget og to andre elektroder for å måle den resulterende spenningsfall ^4.. Den elektriske motstand er beregnet ved hjelp av Ohms lov, noe som gir en numerisk beskrivelse av kvaliteten av cellebarrieren.

ECIS følger dette grunnleggende prinsippet, og utvider den. I ECIS system, blir cellene dyrket på motstående, sirkulære gull-elektroder som er innleiret i bunnen av spesielle celledyrkingsskåler. Antallet elektroder per kultur er også variable, avhengig av anvendelsen, og elektrodene har en standarddiameter på 250 um, i noen tilfeller en større motelektrodenbrukes til å fullføre kretsen. ECIS bruker en konstant vekselstrøm (AC) med en μA med en gitt frekvens i stedet for en likestrøm. Impedansen blir beregnet fra de tilsvarende endringer i spenning (i mV) mellom elektrodene. ECIS gir mulighet til å måle den impedans over et område av frekvenser for å studere frekvensavhengige cellulære egenskaper, noe som har flere fordeler i forhold til teer og vil bli forklart i detalj i denne artikkelen. Først måle kompleks impedans kan skille den totale impedansen i celle barriere motstand og celle kapasitans. I tillegg, ved å ta data på flere frekvenser, og å anvende en matematisk modell, kan man skille mellom junctional impedans (tetthet i celle-celle-kontakter), og impedansen forårsaket av celle-substrat-vekselvirkninger (avstand av basalcellemembran til underliggende matrise) samt bidraget fra cellemembranen kapasitans. For det andre kan celleproliferasjon og motilitet vurderes, siden cellens er i direkte kontakt med elektrodene. For det tredje substrat, og elektroder er tilstrekkelig tynn til å tillate lyse felt og fasekontrastmikroskopi.

Grunnlag for impedansmålinger: Den komplekse impedansen

Til grunn for måling av den elektriske impedans av biologiske gjenstander (f.eks celler) er Ohms lov, en grunnleggende elektroteknisk prinsipp, som beskriver forholdet mellom motstanden (R), strøm (I) og spenningen (U) i en elektrisk krets på et gitt tidspunkt (t).
Gjelder i DC kretsen: R (t) = U (t) / I (t)

Når du arbeider i AC system, strøm og spenning ikke bare ulik amplitude, men også i sin fase (φ). Nå er motstanden ikke lenger tilstrekkelig å beskrive disse relasjonene. I stedet, den komplekse impedans (Z), eller i de fleste tilfeller av størrelsen av impedansen (| Z |) benyttes, inneholdende den tidligere beskrevne ohmsk motstand plus reaktans (X), noe som retater fra AC strømme gjennom kondensatorer og induktorer kjørefaseforskyvning mellom spenning og strøm ^5.
Gjelder i AC krets: | Z (f) | = √ (R ² + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Ved utførelse av impedansmålinger for intakte celler, på grunn av karakteristikkene av deres membran, cellene fungerer som en parallellkobling av motstand og kondensator. Her representerer motstanden til motstand mot strømgjennomgang, mens kapasitansen (C) beskriver separering av elektriske bærere på det isolerende bi-sjikt av cellemembranen som fører til polarisering av cellen. Derved X er dominert av de kapasitive egenskaper av cellemembranen.
X (f) ≈ (2 * Pi * f * C _Cell) ^-1

Siden X er frekvensavhengig, variasjon av målefrekvens muliggjør studium av forskjellige funksjonelle og strukturelle egenskaper av cellen. ECIS Enheten måler både R og X, slik at beregningav | Z |, C og φ.

Kvantifisering hele cellelag med impedansspektroskopi: Den elektriske tilsvarende krets.

Som tidligere forklart, når en celle er brakt inn i et elektrisk felt, det viser egenskaper for passive elektroniske komponenter. Hvis nå, i stedet for en enkelt celle, en hel cellelaget dyrket på toppen av elektrodene og supplert med cellekulturmedium blir undersøkt, må den enkle modell av motstand og kondensator som skal utvides til en hel elektriske nettet. I denne såkalte ekvivalent krets, motstanden i kulturmediet (R _Med) så vel som kondensatoren (C _Electr) og motstanden (R _Electr) som karakteriserer den elektrode / elektrolytt-interaksjon må vurderes ^3,6.

En forenklet, generelt eksempel på en slik ekvivalent krets for en fastsittende voksende celle laget kan finnes i figur 1. Fordelen med en slik matematisk enpproach å beskrive et biologisk system er at disse kretser kan være raffinert ad libitum og tilpasset de spesifikke eksperimentelle spørsmål, blant annet ved å vurdere impedans forårsaket av intracellulære organeller eller å skille påvirkninger av celle-celle (R _Junc) og celle-substrat voksninger (R _Sub) på total impedans ^7,8. Likevel sikte for modellering bør alltid være å bruke den minste antall elementer som beskriver alle funksjonene i målt impedans spektrum for å tillate meningsfulle sammenhenger.

Figur 1. Skjematisk av ECIS systemet og representative ekvivalent krets for en adherente celler i vekst lag. A) tverrsnitt av et ECIS kulturen godt. Cellene vokser på toppen av sense-og motelektroden, og enre dekket med kulturmedium. Elektrodene er forbundet med en lock-in-forsterker, og en AC-signal tilføres via en 1 MΩ resistor for å skape en konstant strøm-kilde. Stimuli kan legges direkte til kultur medium til enhver tid. B) ECIS måler summen av alle individuelle bidrag til impedans. Resistens av kulturmediet (R _Med) samt impedans forårsaket av elektrode / elektrolytt-grensesnittet, som er for enkelhets skyld presentert som en parallellkombinasjon av en motstand (R _Electr) og en kondensator (C _Electr), og også de elektriske egenskaper av cellemembranen, som beskrives av en parallellkobling av motstand (R _celle) og kapasitans (C _Mem), som alle må tas i betraktning. R _Cell er variabel, da den er avhengig av celle permeabilitet mot strømmen. Den tilsvarende krets kan bli utvidet og raffinert ad libitum. Som et eksempel junctional (R _Junc) somsamt subendotel (R _Sub) resistens ble lagt til kretsen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Impedans parametere og deres biologiske betydning

De to mest direkte parametre avledet fra impedansmålinger er motstand og kapasitans av celler. Motstand representerer kvaliteten og funksjon av cellebarrieren og således tar hensyn til motstand mot para-og trans-cellulær strøm. Kapasitans gir en samlet mål på elektrode dekning. Den karakteristiske trekk ved ECIS er at med hjelp av tilsvarende kretser og modellering de globale parametere gi innsikt på mange flere cellulære egenskaper, inkludert celle-celle og celle-substrat voksninger, som vil bli diskutert senere i denne artikkelen.

Før du begynner: Eksperimentell betyderasjoner

Setup måling - Oppsettet består av flere separate komponenter: ECIS enhets med måle elektronikk, PC for datainnsamling, utvalg holder for 8 - eller 96-godt system; ECIS arrays og cellekultur av valget. Matrisen holderen må plasseres i en inkubator og koblet til ECIS enheten utenfor inkubatoren. Den PC-en må være utstyrt med ECIS programvare (1.2.123.0 14 februar 2013) og koblet til ECIS enheten.

Array utvalg - Det er et stadig voksende utvalg av ECIS arrays, designet for flere bruksområder. Standard-matriser er de 8W1E og 8W10E matriser, som er sammensatt av åtte kulturbrønner (angitt med W) som består av en eller 10 måleelektroder (angitt med E), henholdsvis. Et stort motelektroden en lukket krets, men dens impedans er i det vesentlige neglisjerbar i selve målingen ^6.. Standarden 8-godt utvalg holderen kan være vert for to enrrays, noe som resulterer i et totalt antall på 16 kulturbrønnene. Gullelektroder er 50 nm tykt, avgrenset med en isolerende film, og som er montert på enten en optisk klar Lexan substrat eller et kretskort (PCB). PCB arrays er mer robust og kostnadseffektiv. Det transparente lysbilder tillate lys og immunfluorescens mikroskopi. Det må tas i betraktning er at 1E matrisen forbedrer svingninger i motstanden signalet forårsaket av cellebevegelser og som er nødvendig for sårheling studier. Videre enkeltelektroder tillate korrelasjon av elektriske og optiske signaler. I flerelektrode matriser, er signalet i gjennomsnitt over flere elektroder, som på grunn av den økte måleområdet omfatter flere celler i målingen, begrenser skjevhet av dataene ved ujevn inokulering og vekst av cellene og reduserer uskarphet av signalet på grunn av celle bevegelser. Derfor er de flerelektrode arrays er nyttige for å studere celleproliferasjon og barrieredannelse. Ved siden avvanlige matriser er det spesielle matriser som er tilgjengelige for anvendelse av skjærspenning ^9, for å studere chemotaxis ^10, cellemigrasjon, og spredning, så vel som 96-brønners plater for høy gjennomstrømning screeninger. For å konkludere, er matrisen som skal brukes sterkt avhengig av vitenskapelig spørsmålet og celletype, og bør velges og testes grundig.

Målefrekvens - Modellering av Rb og alfa (se dataanalyse) krever multi frekvensmålinger (MFT). Ellers impedans kan måles over tid ved en celletype spesifikk frekvens (SFT), med den fordel at data kan samles inn med en høyere tidsmessig oppløsning. Den mest følsomme målefrekvens for en spesifikk celletype kan finnes ved å frekvens-skanninger. Ved plotting impedans henholdsvis motstand vs frekvens i et log-log diagram frekvens hvor forskjellen mellom cellefri og celledekket elektrode er størst er frekvensen hvor cellene blokkere than dagens mest effektivt. I tilfelle av endotelceller (EC) denne frekvensen er på omtrent 4 kHz.

Såing Tetthet - Som i enhver vanlig cellebasert forsøk seeding tetthet avhenger av den vitenskapelige problem. Når man studerer adhesjon og spredning eller hindring formasjon, bør endotelceller blir podet med en høy tetthet av 40.000-60.000 celler / cm ² for å sikre en sammenflytende, stabil barriere etter 48 timer. Ved fokus for forsøket er den spredning, bør endotelceller blir podet med en lav tetthet på ca 2,000-10,000 celler / cm ^2.

Protocol

En. Utarbeidelse av målesystem

1. Prewarm matriseholderen i en inkubator til 37 ° C før forsøket for å hindre kondensering.
2. Fyll vann kiste av inkubatoren med destillert vann for å unngå uttørring av brønnene.
3. Utføre alle manipulasjoner på celler og matriser i en laminær strømningsskap under sterile betingelser.

2. Utarbeidelse av matriser og Inoculation av celler

MERK: ECIS arrays må rengjøres og stabilisert før et eksperiment for å hindre elektrode drift, for å forbedre vel-til-brønn reproduserbarhet og signal-til-støy-forhold. Derfor finnes to alternativer: A) forbehandling av elektrodene med L-cystein og B) stabilisering funksjon av ECIS.

Alternativ A: L-cystein er anbefalt som den mest konsekvente forbehandling, men kan i noen spesielle tilfeller samhandle med protein belegggs på elektrodene. De volumer som presenteres benyttes for standard 8-brønn matriser.

1. Tilsett 200 ul / brønn 10 mM L-cystein. Cystein renser og modifiserer den elektrodeoverflate som gir en høy og reproduserbar elektrode kapasitans.
2. Inkuber 15 minutter ved romtemperatur (RT).
3. Vask to ganger 500 mL / brønn med ultrarent vann (type 1). Ikke bruk fosfat buffere, som kan forstyrre med absorpsjon av enkelte proteiner. Også unngå serum-inneholdende løsningene før belegget, ettersom det gulloverflaten vil adsorbere de første makromolekyler bringes i kontakt.
4. Frakk med 200 mL / vel varm 1% gelatin.
5. Inkuber 30 min ved 37 ° C.
6. Fjern gelatin, men ikke la overflaten tørke. Dette kan skade elektrodene.
7. Vask en gang med ultrarent vann (type 1).
8. Tilsett 400 ul / brønn komplett cellekulturmedium (inneholdende serum, antibiotika og alle vekstfaktorer).
9. Bilde matrisen i matrisen holder end sørge for at matrisen er plassert slik at de ni gull firkantede putene er skikkelig kontaktet av de fjærbelastede pogo pins og skrue fix justering for hånd. Vær forsiktig med gjennomsiktige matriser, kan gull laget lett bli skadet.
10. Åpne måling programvare og trykk på Setup fulgt av Check i "Samle data" til å utføre en rask impedans måling av hver enkelt brønn. De resulterende verdier er målelinjen og vil automatisk bli lagret i «Kommentarer».
11. Brønnen sjekk vil automatisk bestemme hvilken type ECIS arrays brukes. Kontroller de valgte arrays i "Well Configuration"-delen.
12. Matrisen diagram lyser grønt for korrekt tilkoplede brønner og rødt for tomme eller feil tilkoblede brønner. Likevel, alltid sørge for at arrays ble plassert riktig i holderen.
    MERK: Hvis rengjøring og belegg var vellykket de 8W1E ECIS arrays har acapacitance på omtrent 5 nF og 8W10E matriser av 50 nF, hvilket resulterer i en utgangsmotstand på omtrent 2000 og 200 Ω hhv.
13. Fjern utvalg fra holderen.
14. Seed celler som en enkelt cellesuspensjon i 400 pl / brønn komplett cellekulturmedium.

Alternativ B: Stabiliserings funksjon av ECIS kan brukes som et alternativ til eller i kombinasjon med L-cystein behandlingen og hvis problemer med elektrodedrift eller store forskjeller i brønn-til-brønn motstand og kapasitans oppstå.

1. Utfør cystein behandling (valgfritt) og forhåndsbelegning elektroder med protein (valgfritt).
2. Tilsett 200 ul / brønn i komplett medium til hver brønn og plassere matrisen i matriseholderen.
3. Åpne måling programvare og trykk Setup etterfulgt av å sjekke behovet for matrisen er riktig tilkoblet og å måle innledende Z, R, og C.
4. Stabil elektrodene ved å trykke (ca. 3 mA), høy-frekvens (64 kHz) puls for å rense elektrodene.
5. Sjekk elektroder igjen. Kapasitans bør økes og motstandsverdier bør være i en sammenlignbar utvalg.
6. Hvis kapasitans og motstand verdier er fortsatt ikke tilfredsstillende, gjenta stabilisering.
7. Fjern-matrisen fra holderen og inokulere cellene.

Tre. Sette opp Måling Programvare og Data Acquisition

1. Plasser matrisen i matriseholderen, som beskrevet tidligere.
2. Åpne måling programvare og trykker på Oppsett-knappen i "Samle data" for å koble ECIS programvare til ECIS instrument og kjøre en annen brønn Sjekk.
3. Kontroller de valgte arrays i "Well Configuration"-delen.
4. Velg brønnene som skal måles i "Well KONFIGURASion "-delen.
5. Velg målemodus fra "samle inn data" alternativer:
   1. For en tidsserie på en fast frekvens, velger du Enkel Freq. / Time (SFT) og velg målefrekvens fra rullegardinmenyen.
   2. For måling av elektrode dekning og modellering av Rb og Alpha, velge flere Freq. / Time (MFT). Den ECIS enheten vil måle automatisk på alle tilgjengelige frekvenser.
   3. For micromotion (se dataanalyse) velg Rapid Tid Collect (RTC) og justere målefrekvens og samplingsfrekvens. Her standard tidsmessig oppløsning er en prøve pr sekund (1 Hz), men samplingsfrekvensen kan også økes for å spore raske endringer i impedans på opptil 25 Hz (for Z-Theta). Viktig merknad: i RTC modus bare en enkelt brønn måles.
      MERK: Hvis micromotion må måles på flere brønner senere, gå til Hjelp> elementer Vis ekspert verktøylinje / meny> Acquire> Multi-Vel RTC. Angi tidsbegrensning (HR) i å samle inn data delen, den ECIS vil nå måle de utvalgte brønner i nummerrekkefølge. Etter å ha startet målingen programvaren vil be om å angi antall sykluser. Angi verdien for hvor ofte målingen må gjentas.
6. For SFT og MFT, velge tidsintervallet (sek) mellom målinger eller hvis data trenger å bli kjøpt opp så fort som mulig lar dette alternativet være umerket.
   MERK: For å skaffe data på ECIS enheten benytter en multiplekser å bytte fra én brønn til en annen med et minimum SFT oppkjøpet rate på 0,25 sek og 7,5 sek for MFT. Betydning intervallet er avhengig av antall utvalgte brønner og frekvenser. For målinger på langsomme prolifererende celler eller en enkel registrering av motstand mot tid, bruker intervaller på 600 sek eller mer.
7. Trykk på Start, gi filen et navn, og velg sted å lagre data.
   MERK: Fil størrelse bør ikke være et problem, siden ECIS data lagres i en form for ren tekst format som heter *. ABP, som aldri overstiger flere hundre MB, selv med alle måle frekvenser og antall brønner utvalgte.
8. Stopp kjøre ved å trykke på Fullfør.

4. Medium Change and Cell Manipulasjon

1. Trykk Pause, vil dette stoppe datainnsamlingen, men fortsetter å kjøre den eksperimentelle klokke.
2. Fjern matrisen fra holderen og manipulere den under en laminær strømningsbenk (dvs. endring medium).
3. Plasser rekke tilbake i holderen, og enten klikke Kontroller tilkobling eller Gjenoppta eksperiment for å fortsette datainnsamling. Målingen programvare vil plassere en tidstegn i datasettet.

5. Akutt stimulering under Data Acquisition

MERK: En annen mulighet er å manipulere celler under datainnsamling å følge umiddelbare endringer. Dette er bare mulig, Når prøvene ikke må være sterilt i ytterligere løpet av eksperimentet.

1. Legg stimulans direkte til godt og sørg for å blande forsiktig med en 200 mL pipette.
2. Mark tid peke manuelt ved å trykke på Mark og legge til en kommentar.

6. Elektrisk såret

MERK: Finne de rette innstillingene for den brukte celletype er nøkkelen for elektrisk såret. Dersom såret er for kort og dette kan føre til utilstrekkelig fjerning av cellene, mens hvis såret er for lang og / eller grov dette kan skade elektrodene (spesielt på de gjennomsiktige arrayer). Derfor er flere kort såret pulser anbefales. For HUVEC kulturer to 10-20 sek lange såret pulser av 5 V ved 60 kHz hvert har blitt funnet optimal bruk av ECIS 1600R. Generelt er det anbefalt å bruke høye frekvenser> 20 kHz for å opprettholde ensartede høye felt over cellene og for å unngå enhver skade på elektrodene.

1. Utfør såret during en aktiv ECIS måling.
2. Aktiver Wound / electroporate Setup, klikk deretter Wound og fyll i tid (sek), sår spenning (V for 1600 R) eller strøm (μA for Z og Z-Theta) og frekvens (Hz). De viste standardverdiene er basert på den type array og ECIS enhet.
3. Velg brønnene til sår i "Well Configuration"-delen. Bare de sjekket brønnene vil bli såret.
4. Aktiver Tid før Hour og fyll i forsinkelsestiden for å aktivere forsinkelsen såret funksjon. Denne funksjonen kan stoppes når som helst ved å trykke på Stopp eller påføre et sår manuelt. Kun én forsinkelse kommandoen kan være aktiv om gangen.
5. Trykk Aktiver og klikker OK i pop-up vindu for å starte såret.
6. Sørg for at motstanden signalet faller til offset impedans etter såret, ellers gjenta såret.

7. Data Analysis

Data representasjon og eksport.

1. Finish måling eller last datasett via Fil -> Åpne.
2. Velg brønner som skal vises fra "Well Configuration"-vinduet. Gruppe individuelle brønner for å presentere gjennomsnittet.
3. Valgte parameter som skal vises fra øvre knapperad (Z, R eller C).
4. Velg graftype fra øvre knapperad (T = tid, F = frekvens, 3D = foss blot).
5. Definer grafen offset og utvalg med glidebryterne under grafen vinduet eller fylle ut de eksakte verdiene i de tilstøtende kontroller.
6. Velg fra de grunnleggende "Alternativer for Time-serien" i "Analyze"-delen for å utføre standardavvik, løpende gjennomsnitt eller normalisering av dataene.
7. Aktiver Expert Toolbar i Hjelp-menyen for mer avanserte operasjoner som Nyuist tomten og Fourier transformasjon.
8. Bruk "Display Options" i "Analyze"-delen til å definere range av x-og y-aksene og eksport grafen.
9. Eksporter valgte data til en Excel-fil via File -> Export data -> Til Excel (valgt), og bruke en tredjeparts programvare av valget for grundig analyse, statistikk og representasjon etter behov.

Modellering av Rb og Alpha.
MERK: For modellering er det anbefalt å bruke en celle-fri, medium fylt godt som referanse.

1. Finish MFT måling eller last MFT datasett.
2. Hvis en celle-fri referansen vel er tilgjengelig trykk enten Finn for å velge referanseverdi eller Set for å velge cellen fritiden punkt manuelt fra "Freq. Scan Modeling" i "Analyserer"-delen automatisk.
3. Hvis det ikke er noen celle-frie referanse, importere en referanseverdi fra et annet datasett. Åpne referansen datasett (sørg for at den samme matrise og medium ble brukt) og bruke Finn eller Set for å velge referanseverdien.Deretter navigerer til de målte data og pressen kommer.
4. Hvis det ikke er cellefrie referanse tilgjengelige datasettene bruk fabrikkstandard.
5. Trykk Model å starte beregningene. Modellering kan ta flere minutter, avhengig av størrelsen av datasettet.

Beregning av micromotion.
MERK: Denne beregningen er ikke en del av målingen programvare, men kan utføres med noe signal prosessering programvare.

1. Avslutt RTC måling eller laste RTC datasett.
2. Normaliser datasett ved snitt motstanden av hele perioden.
3. Bryt datasett inn i segmenter med en lengde på 256-datapunkter og rengjøre hvert segment av en Hanning vindu.
4. Kjør en 256-punkts Fourier-transformasjon og gjennomsnittlig resulterende frekvensspektra til en ensidig 129-punkts effektspekteret for å redusere tilfeldig støy og forbedret biologisk signal.
5. Plot frekvens mot amplitude i en log-log graf og anvendeminst firkantet lineær tilpasning.
6. Helningen av det lineære form er et mål for total støy i signalet og dermed micromotion av cellene.

Representative Results

Justering av et eksperiment er ganske enkel og målingen i seg selv er helt automatisk, men som ofte er tilfelle, korrekt analyse og tolkning av dataene er avgjørende. I det representative data seksjonen en guide er gitt for tolkningen av de viktigste parametrene som tilbys av impedansspektroskopi med ECIS. Dette vil være nyttig for å avgjøre hvilken type vitenskapelig problem en ECIS måling kan være nyttig og hvilke parametere som bør registreres.

En typisk eksperimentelt avlesing kan generelt deles i en vekstfase etter celle inokulering og en platå-fase når cellene når løpet. Hver av disse fasene gir informasjon om ulike cellulære egenskaper. En representativ måling er vist i figur 2, og delt i fire subphases å analysere A) celle adhesjon, spredning og proliferasjon, b) dannelse av en modning EC barriere, C) cellemigrasjon etter genereringen av et elektriskal viklet, og d) den cellulære respons på stimulering med det vasoaktive middel trombin. Fase-kontrast og immunofluorescence bildene ble kjøpt direkte fra måleelektrode under de ulike subphases å illustrere sammenhengen mellom elektrode dekning, mobilstatus, og innspilt impedans signal.

Vedheft, spredning og spredning

Hver celletype har sin karakteristiske adhesjon og vekstkurve som kan manipuleres ved å variere seeding tetthet, belegging med ekstracellulære matriks-proteiner eller andre stimuli. En av de store vanskelighetene å studere disse prosessene er å skille mellom heft, spredning og spredning. Wegener et al ^11.. Gitt en detaljert beskrivelse av bruken av en kombinasjon av motstand og kapasitans til å skille mellom disse parametrene og i figur 3 blir det tydelig hvordan motstand og kapasitans kan utfylle hverandre. Det er viktigstudiet av adhesjon og spredning for å forstå påvirkning av målefrekvensen, fordi her det elektriske feltet forårsaker en polarisering av cellemembranen av cellene i suspensjonen ^8, som tvinger strømmen til å strømme utelukkende rundt cellene. Når cellene feste de begynner å begrense strømmen ved å spre over elektroden og kapasitans avtar lineært med prosentandelen av åpent areal på elektroden (brøk-området). Derfor kan adhesjon, spredning og proliferasjon kvantifiseres best, når opptaket kapasitans med en frekvens høyere enn 40 kHz (figur 3B), hvor reduksjonen i kapasitansen er direkte proporsjonal med elektrode-dekning. Alternativt motstand ved dens mest følsomme frekvensmåling er et direkte mål for differensiering og modning av cellene inn i en konfluent barriere (figur 3A). I tillegg til den fraksjonelle område, Wegener et al. Innføres andre toparametre for å kvantifisere adhesjon og elektroden dekning: t _1/2 (en halv maksimal kapasitans), som er tiden frem til 50% av elektroden er dekket med celler (figur 3B, innsetting), og hellingen av den kurve kapasitans (s, Ikke vist) som frekvensen av cellespredning og proliferasjon.

Resistance som et mål på barriere kvalitet

Motstand er den del av impedansen som beskriver barrierekvaliteten og funksjon best, fordi den neglects kapasitive komponenter fra membran, elektrode og medium. Her begrepet barrierekvaliteten og ikke permeabilitet er i bruk, ettersom permeabiliteten er per definisjon bare er avhengig av celle-celle-kontakter. Motstand imidlertid bestemmes av evnen til celler og deres celle-celle og celle-matriks-interaksjoner for å blokkere strømmen. Følgelig forskjellige celletyper (kloner og passasjer) har sine spesifikke motstandsverdier (Figur 4A). Selv om motstanden gir en mye Clearer idé om cellebarriere, må impedans-signalet alltid tas i betraktning.

Modellering av Rb og Alpha

Den ECIS programvare huser en spesiell egenskap, evnen til å modellere to parametre, som skiller mellom celle-celle-og celle-matrise-adhesjon (figurene 4B og 4 C). Rb (i cm x ² ohm), er den spesifikke motstand av celle-celle-kontakter til strømgjennomgang og derved et inverst mål på klassisk permeabilitet. Høy Rb betyr lav permeabilitet mot strømgjennomgang. Alpha (i cm x ohm ^0,5), er et mål for de impedans bidrag som kommer fra de celle-elektrode veikryss. Modellen for å kvantifisere celle-celle og celle-matrix kontakter ble innført 1991 av Giæver og Keese og er basert på en forutsetning om at cellene er sirkulære, skiveformede objekter som har en isolerende membran, sveve over elektroden og er fylt med å gjennomføre elektrolytt ² . Denisolerende egenskap cellemembranen later bare tre veier til den gjeldende: a) mellom ventrale overflaten av cellene og elektrode, b) mellom de celle-celle-kontakter, og c) gjennom cellene (bare sannsynlig når en høy målefrekvens blir brukt ). En mer detaljert utledning og forklaring kan finnes i avisene av Lo et al ^3,12.

Micromotion

Det har vist seg at små variasjoner i motstanden signal (figur 4A) er på grunn av små, tilfeldige cellebevegelser i konfluent cellelag, så vel som celler som beveger seg på og av elektroden i sparsom kultur ^2. Dette aspektet av ECIS tid-kurs data beskrevet av Lo og Opp et al. ^13,14 blir ofte oversett og best sett ved måling med de 1E arrays og på det mest følsomme frekvens å gjøre rede for para-og subcellulære gjeldende-stier. Beregningen av denne cellen forårsaket støy (micromotion) er ikke en del av the standard måling programvare, selv i den nyeste versjonen Fast Fourier Transformation (FFT) er integrert. Opptak RTC data med en samplingfrekvens på 1 Hz for en time ved 4 kHz gir tilstrekkelig oppløsning for beregning av EF micromotion. Denne beregningen gir en enkelt verdi, og kan bli direkte benyttet for statistisk analyse. En utvidet diskusjon om bruken av frekvensanalyse for micromotion kan finnes andre steder ^15. Alternativt til FFT andre analyse strategier kan anvendes, slik som variansen av inkrementer. Varians er mer følsom overfor små endringer i micromotion, men på grunn av denne følsomhet sammenligning av de enkelte eksperimenter blir vanskelig. Bakkene i effektspekteret er en mer robust måling av micromotion (Figur 4D). Her området under kurven kan bli sett på som den mengden micromotion eller støy cellene skape. Derfor brattere helling av strøm spekteret jo mindre område under kurvenog jo mindre micromotion.

Elektrisk sårheling assay

Å studere migrasjon av celler, er vanligvis mekaniske sår påføres ved å skrape celler av kultur plate med pipettespisser, celle skraper eller bestemte frimerker og følge deres remigration mikroskopisk ^16. Denne metode har den åpenbare ulempe at størrelsen på bunnen varierer og er vanligvis for stort til å overse påvirkning av celleproliferasjon på sårhelingsprosessen. Den såret funksjon av ECIS benytter en høy spenning, høyfrekvent puls for å få en celle fri elektrode, og deretter følger remigration av tilgrensende celler for å erstatte døds celler (figur 5A). En fordel ved automatisert fremgangsmåte i forhold til standard, arbeidskrevende skrape assays er at ECIS frembringer en reproduserbar såret med en nøyaktig diameter på 250 mikrometer, som lukker i løpet av noen få timer, for å studere ren migrasjon. Videre er den elektriske puls gjøres ikke fjerne protein belegg og skilles ekstracellulære matrise. Under forutsetning av at cellene remigrate på elektroden fra alle sider, kan migreringshastighet lett kan beregnes ved å dividere viklet radius ved tiden som kreves for lukking av sår ^17.. Som et alternativ til elektrisk såret, nylig den såkalte elektrisk gjerde Metoden ble introdusert (ikke vist). Her høye strømpulser forhindre feste og migrering av celler på elektrodene etter inokulering. Cellene vil vokse rundt målelektroden, og å migrere innover så snart de elektriske pulser er slått av. Fordelen med det elektriske gjerdet over elektriske såret er at elektrodeoverflaten ikke har blitt endret av cellevekst eller celle fjerning, noe som er viktig for å måle påvirkninger av forskjellige belegg på cellemigrasjon.

Cell stimulering

I tillegg til studiet av cellemigrasjon, er impedans-spektroskopi perfekt tilpassetmåle effekten av legemidler og toksiner for cellene. Figur 5B presenterer en klassisk stimulering / hemming eksperiment, hvor trombin ble anvendt for å indusere hyper-permeabilitet i det sammenflytende EC barriere ved sammentrekning og gap dannelse av celler, som manifesterer seg som et forbigående fall i motstanden . Etter preinkubering med Rho-kinase inhibitor Y-27632 meste av trombin responsen er svekket ved å senke basalcellespenningen ¹⁸ og blokkerende belastning fiberdannelse ^19. Deretter Rho-kinase blokker ble anvendt ved ulike tidspunkt etter trombin tillegg, som fører til en umiddelbar og total utvinning av EC-barrieren. Her fordelen av en kontinuerlig impedans målesystem for å studere akutte cellulære responser blir klart. I faste endepunkt assays (f.eks immunfluorescens farging eller makromolekyl passasje), ville dette akutt respons til den brukte blokker være meget vanskelig hvis ikke umulig å detektere og kvantifisere. Viktig å merke seg er at med jegmpedance målinger permeabiliteten mot ioner er beskrevet og ikke mot makromolekyler. Vennligst referer til Aman et al. ^20, hvor en utmerket sammenligning mellom ECIS målinger og makromolekyl passasje eksperimenter er gitt.

Figur 2. Representant måling. MVEC ble dyrket på en gelatin belagt 8W1E arrays med lav seeding tetthet av 5000 celler / cm ² og MFT opptaket ble utført over 10 dager. Målingen illustrerer de forskjellige avlesinger av en ECIS eksperiment: A) adhesjon, spredning og spredning, b) dannelse og modning av en konfluent cellebarriere, C) sårheling etter påføring av et elektrisk sår, D) stimulering med vasoaktive agenten trombin. De to pilene viser medium forfriskninger, som ble utført i intervaller på fire dager, og gir en idé om følsomheten av målingene mot mekaniske stimuli og endringer i temperatur og pH. Bildene i toppanelet svarer til målingen, og ble anskaffet direkte fra målelektroden. Den fasekontrast bildet til venstre viser endotelceller 24 timer etter vaksinasjonen, begynner å dekke elektroden. De immunfluorescens bilder i midten og på den høyre liggende F-aktin farging av konfluent endotelial lag før og etter stimulering med trombin (1 U / ml). Trombin fører til sammentrekning av endotelceller ved dannelsen av såkalte stress-fibre og den forbigående åpning av inter-endothelial hull (piler og bilde inserts), gjenkjennelige i ECIS signal ved en nedgang i motstand mot baseline. Her følsomheten av målingen blir klart, og hvor endringer i cellelaget korrelerer med impedans-signalet.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Cellebinding og vekst. MVEC fra samme donor ble sådd med tre forskjellige tettheter på gelatin belagt 8W10E arrays og cellevekst ble spilt inn på flere frekvenser for 60 hr. A) Motstandsverdiene for de tre forholdene på deres optimal frekvens på 4 kHz for å måle barrieredannelse. Alle tre seeding tettheter etablert en konfluent barriere av ca. 1200 Ω ved utgangen av målingen;. Spredning priser men (skråningene av kurver) skiller seg markant B) Måling av kapasitans på 64 kHz gir innsikt i heft og spredning. Vedheft er det iitial platåfasen i kapasitans kurven (mellom 2-8 timer). Spre, som er i lineært forhold til elektroden dekning, er representert ved helningen av kurven og er fullført etter 10-30 timer, avhengig av seeding tetthet. Tidspunktet t _1/2 (halv maksimal dekning) kan brukes for statistisk analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Karakterisering av de sammenflytende barriere. To MVEC donorer med forskjellige passasje nummer (passasje 3 og 6) ble utsådd på gelatinbelagt 8W1E matriser og en MFT måling ble utført i 30 timer for å karakterisere EC-barrieren. A) Motstand Målingene viser at den yngre donor en har en høyere motstand på ca. 11 000 Ω i forhold til ca. 7500 Ω av den eldre donor to. BC) Modellerings mulighetene i ECIS har blitt brukt til å finne årsaken til den lavere motstand. Modellering viste en sammenlignbar celle-celle-interaksjon Rb og indikerte et svekket celle-matriks interaksjoner Alfa som en mulig årsak. D) RTC ble utført for å kvantifisere micromotion innenfor konfluent cellelag etter Fourier-transformasjonen, hvor arealet under kurven er proporsjonalt med micromotion . Analyser av spektra viser mindre micromotion av eldre donor 2 og dermed støtte det kan allerede være antatt fra motstanden signal (mindre varians). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

5 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
Figur 5. Cellemigrasjon etter elektrisk såret og effekter av trombin stimulering. Impedans-opptak ble utført ved 4 kHz med maksimal tidsmessig oppløsning. A) MVEC donor 1 ble brukt i passasjen 3 og giver 2 i passasjen 6 på gelatinbelagt 8W1E matriser og dyrket til konfluens. Så en elektrisk såret ble opprettet ved anvendelsen av to 5 V pulser på 60 kHz med en varighet på 20 sek hver. Den yngre donor 1 viste bedre evne til sårheling basert på en raskere sårheling (migrasjon, bakkene i kurvene) og en høyere motstand etter såret i forhold til den eldre donor to. B) HUVEC ble dyrket på gelatin belagt 8W10E arrays. Ved sammenløpet cellene har blitt serum sultet i 1,5 timer ved å erstatte den fullstendige kulturmedium med basalmedium pluss 1% humant serum albumin (HSA). Ossalder på vanlig medium med HSA er et kritisk punkt, siden serumkomponenter blokkere trombin respons. Så snart en stabil motstand platå ble detektert, ble trombin tilsatt direkte til brønnene, og blandes omhyggelig med 200 ul pipette. Den maksimale trombin virkning er synlig etter 30 min, karakterisert ved et forbigående fall i motstandsevne mot grunnlinjen, og et ca. 30-50% lavere motstand etter bedring. Cellene ble enten preinkuberes med Rho kinase blocker Y-27632 for 30 min eller blocker ble lagt 20, 30, eller 40 min etter trombin tillegg, noe som svekket trombin kraft umiddelbart. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Discussion

ECIS er et utmerket verktøy for screening av celle egenskaper og oppførsel, så vel som for kvantifisering av virkningene av kjente og ukjente stoffer. Derved blir cellene holdt under standard dyrkningsbetingelser, kan impedansen kontinuerlig overvåkes med en høy tidsmessig oppløsning, og korrelert til optiske signaler. På den måten det optimale tidspunkt for celle manipulasjoner kan velges på grunnlag av de morfologiske og funksjonelle celletilstand. Uheldigvis kommer denne høye oppløsning måling med prisen for at små forandringer i temperatur, pH eller mekanisk stimulering av celler (medium forandring) vil påvirke den impedans-signalet umiddelbart.

Anvendelsen av den lille målestrømmen til cellene gjør ECIS måling invasiv, ikke-destruktiv, og label-fri, men som et resultat bare passive bioelektriske egenskaper kan måles (ingen aksjonspotensialer). Et viktig trekk er at en rekke parametere kan være der ived fra en enkelt måling, ved å kombinere informasjon fra flere klassiske analyser, som permeabilitet eller sårtilheling analyser. Her bestemt interessant aspekt er at matematisk modellerte data kan brukes til å utforske endringer i motstand og kapasitans og henvise dem til forskjellige cellulære strukturer (f.eks celle-kontakter eller cellemembran). Viktig å merke seg er at impedansspektroskopi gir alltid et gjennomsnitt signal fra alle cellene på sensing elektrode, som ikke tillater for studier av enkeltceller og også den matematiske modellen er kun gyldig i konfluente cellelag. Derfor endotelceller bør bli holdt i sammenflytende tilstand i minst en dag før brukt for modellering for å sikre modne celle-adhesjoner og hvilende celler. Likeledes bør elektriske sårene bare anvendes for sammenflytende cellelag ved hjelp av flere korte såret pulser med høye frekvenser, for å oppnå optimal effektivitet såret og forhindre skader på elektrodene.

jove_content "> For å få den maksimale mengde av informasjon fra en ECIS måling, som i hver analyse ble flere parametere som for eksempel kombinasjonen av matrisen substratet, belegging og såing densitet for den enkelte celletype må testes og optimaliseres før et eksperiment.

En større begrensning av ECIS er at måling ikke gir direkte informasjon på det molekylære nivå. Dermed ECIS målinger er vanligvis mest informative i begynnelsen av en eksperimentell serie å hjelpe knytte et vitenskapelig problem med mobilnettet strukturer eller egenskaper og gi betydelig innspill for generering av en testbar hypotese. Derfor den modulære utformingen av ECIS tilbyr et bredt spekter av applikasjoner med mulighet for skreddersydde arrays. De siste array-utvikling tilsier en fremtidig fokus på høy gjennomstrømning impedans screenings for celleproliferasjon og elektrisk såret og den forkant av spesielle strømnings arrays for simulering av in vivo

Ytterligere litteratur
Det vises for øvrig til websiden of Applied biofysikk (www.biophysics.com) for søknad notater, webinarer og en detaljert liste over publikasjoner som dekker hele ECIS spekteret.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Bovine Thrombin	Merck Millipore	604980
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Pen/Strep	Lonza	17-602E