Elektrisk cell-substrat Impedans Sensing för kvantifiering av Endothelial Proliferation, barriärfunktion, och Motility

Summary

Detta protokoll omdömen elektrisk cell-substrat Impedans Sensing, en metod för att spela in och analysera impedansspektrumet vidhäftande celler för kvantifiering av cellvidhäftning, proliferation, motilitet och cellulära svaren på farmakologiska och toxiska stimuli. Detektion av endotelial genomtränglighet och bedömning av cell-cell-och cell-substratkontakter betonas.

Abstract

Elektrisk cell-substrat Impedans Sensing (ECIS) är ett in vitro impedans mätsystem att kvantifiera cellers beteende inom vidhäftande cellskikt. För detta ändamål odlas celler i speciella odlingskammare ovanpå motstående, cirkulära guldelektroder. En konstant liten växelspänning appliceras mellan elektroderna och potentialen över mäts. De isolerande egenskaperna hos cellmembranet skapar ett motstånd mot elektriskt strömflöde som resulterar i en ökad elektrisk potential mellan elektroderna. Mätning cellulär impedans på detta sätt medger den automatiserade studien av cellvidhäftning, tillväxt, morfologi, funktion och motilitet. Trots att ECIS mätningen i sig är enkel och lätt att lära sig, är den bakomliggande teorin komplexa och val av rätt inställningar och korrekt analys och tolkning av data är inte självklart. Men en tydlig protokoll som beskriver de olika stegen från den experimentelladesign till förberedelse, genomförande och analys av experimentet inte är tillgänglig. I den här artikeln princip den grundläggande mätningen samt möjliga tillämpningar, är experimentella överväganden, fördelar och begränsningar ECIS systemet diskuteras. En styrning är anordnad för studier av cellvidhäftning, spridning och proliferation; kvantifiering av cellbeteende i ett sammanflytande skikt med avseende på barriärfunktionen, cellmotilitet, kvalitet på cell-cell-och cell-substrat adhesioner, och kvantifiering av sårläkning och cellulära svaren på vasoaktiva stimuli. Representativa resultat diskuteras utifrån mänskliga mikrovaskulära (MVEC) och mänskliga umbilikalvensendotelceller (HUVEC), utan gäller för all vidhäftande växande celler.

Introduction

ΩΩΩHere presenterar vi Electric Cell-substrat Impedans Sensing, känd som ECIS, en särskild metod för att mäta och analysera impedansspektrumet av vidhäftande celler i kultur ^1. Syftet med detta protokoll är att erbjuda en allmängiltig vägledning för användningen av denna typ av impedans baserade cellulära analyser och tillhandahålla protokoll för några av de viktigaste funktionerna från det ständigt växande antalet ansökningar. Man kommer att fokusera på studiet av celldelning, barriärfunktion, cell korsningar, och cellrörlighet.

Eftersom ECIS och dess tillhörande modell för att omvandla impedans spektroskopi data i biologiskt relevanta parametrar infördes i sin nuvarande form till den vetenskapliga världen genom Giaever och Keese 1991 ^2, har det ofta kallas ett system för mätning av TEER (trans -epitelial elektriskt motstånd), vilket inte är korrekt. Skillnaderna verkar marginella i början, menär viktiga för tolkning av data. För klassiska Teer mätningar, celler odlas på genomsläppliga filter för att karakterisera paracellulär transportmekanismer, som domineras av epitelceller tight junctions eller endotelceller adherensgränssnitten junctions ^3. Vanligen är två elektroder placerade ovanför och under filtret används för att applicera en likström (DC) strömma över cellskiktet och två andra elektroderna för att mäta det resulterande spänningsfallet ^4. Det elektriska motståndet beräknas med Ohms lag, som tillåter en numerisk beskrivning av kvaliteten av cellbarriären.

ECIS följer denna grundläggande princip och förlänger den. I ECIS systemet odlas celler på motstående, cirkulära guldelektroder som är inbäddade i botten av speciella cellodlingsskålar. Antalet elektroder per odlingsbrunn är variabel, beroende på tillämpningen och elektroderna har en standarddiameter av 250 | im, i vissa fall en större motelektrodanvänds för att fullborda kretsen. ECIS använder en konstant växelström (AC) av 1 iA med en given frekvens i stället för en likström. Impedansen räknas från motsvarande förändringar i spänning (i mV) mellan elektroderna. ECIS erbjuder möjligheten att mäta impedansen över ett frekvensområde för att studera frekvensberoende cellulära egenskaper, som har flera fördelar jämfört TEER och kommer att förklaras i detalj i denna artikel. Först mäta komplexa impedans gör att separera den totala impedansen i cellbarriär motstånd och cell kapacitans. Dessutom, genom att ta data vid flera frekvenser och tillämpa en matematisk modell, kan man skilja mellan Junktional impedans (täthet av cell-cellkontakter) och impedans orsakas av cell-substrat interaktioner (avstånd av basalcellmembranet till underliggande matris) samt bidraget av cellmembranets kapacitans. För det andra, kan bedömas cellproliferation och motilitet, eftersom cellens är i direkt kontakt med elektroderna. För det tredje substratet och elektroderna är tillräckligt tunna för att möjliggöra ljusa fältet och faskontrastmikroskopi.

Grund för impedansmätningar: Den komplexa impedansen

Till grund för mätningen av den elektriska impedansen hos biologiska objekt (t.ex. celler) är Ohms lag, en grundläggande elektroteknisk princip, som beskriver förhållandet mellan resistansen (R), ström (I) och spänning (U) i en elektrisk krets vid en viss tidpunkt (t).
Användbar i likströmskretsen: R (t) = U (t) / I (t)

När du arbetar i AC-systemet, ström och spänning inte bara skiljer sig åt i sin amplitud, men också i sin fas (φ). Nu är motståndet inte längre tillräckligt för att beskriva dessa förbindelser. Istället den komplexa impedansen (Z) eller i de flesta fall magnituden av impedans (| Z |) används, som innehåller den tidigare beskrivna resistiva motståndet plus reaktansen (X), som återsultat från AC strömma genom kondensatorer och induktorer driv fasförskjutningen mellan spänning och ström ^5.
Användbar i AC-krets: | Z (f) | = √ (R ² + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Vid utförande av impedansmätningar på intakta celler, på grund av egenskaperna hos deras membran, celler fungerar som en parallellkoppling av motstånd och en kondensator. Här motstånd representerar motstånd mot strömflöde, medan kapacitansen (C) beskriver separation av elektriska bärare vid den isolerande dubbelskikt av cellmembranet som orsakar polarisationen av cellen. Därmed X domineras av de kapacitiva egenskaper hos cellmembranet.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C _Cell) ^-1

Eftersom X är frekvensberoende variationen av mätfrekvensen möjliggör studie av olika funktionella och strukturella egenskaper hos cellen. Åtgärderna ECIS enhet både R och X, möjliggör en beräkningav | Z |, C och φ.

Kvantifiera hela cellager med impedansspektroskopi: Den elektriska ekvivalenta kretsen.

Såsom tidigare förklarats, när en cell bringas i ett elektriskt fält, det visar egenskaperna för passiva elektroniska komponenter. Om nu, i stället för en enda cell, en hel cellskiktet odlades på toppen av elektroderna och kompletterat med cellodlingsmedium undersöks behöver enkel modell av motstånd och en kondensator för att utsträckas till ett helt elektriskt nätverk. I denna så kallade ekvivalenta kretsen, motstånd av odlingsmediet (R _Med) samt kapacitans (C _Elektr) och resistans (R _Elektr) karakterisera elektrod / elektrolyt interaktion måste beaktas ^3,6.

En förenklad, allmänt exempel på en sådan ekvivalent krets för en vidhäftande växande cellskikt kan hittas i figur 1. Fördelen med en sådan matematisk aILLVÄGAGÅNGSSÄTT att beskriva ett biologiskt system är att dessa kretsar kan förfinas efter behag och anpassas till de specifika experimentella frågor, t.ex. genom att överväga impedans orsakas av intracellulära organeller eller för att särskilja påverkan av cell-cell (R _Junc) och cell-substrat sammanväxningar (R _Sub) på den totala impedansen ^7,8. Trots målet för modellering bör alltid vara att använda det minsta antalet element som beskriver alla funktioner i den uppmätta impedansspektrum att göra meningsfulla samband.

Figur 1. Schematisk av ECIS systemet och representativ ekvivalent krets för en fastsittande växande celler lager. A) Tvärsnitt av en ECIS kulturen väl. Cellerna växer på toppen av avkänning och motelektrod och enåter täckt med odlingsmedium. Elektroderna är anslutna till en lock-in-förstärkare och en AC-signal matas via en 1 Mohm motstånd för att skapa en konstant strömkälla. Stimuli kan tillsättas direkt till odlingsmediet vid någon tidpunkt. B) ECIS mäter summan av alla enskilda bidrag till impedansen. Resistans i odlingsmedium (R _Med) samt impedans orsakad av elektrod / elektrolyt-gränsytan, som är för enkelhetens skull presenteras som en parallellkombination av ett motstånd (R _Elektr) och en kondensator (C _Elektr), och även de elektriska egenskaperna av cellmembranet, som beskrivs av en parallellkoppling av motstånd (R _Cell) och kapacitans (C _Mem), alla måste beaktas. R _Cell är variabel, eftersom den är beroende av cellens permeabilitet mot strömmen. Den ekvivalenta kretsen kan utökas och förfinas efter behag. Som ett exempel Junktional (R _Junc) såsomliksom subendoteliala (R _Sub) motstånd sattes till kretsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Impedans parametrar och deras biologiska betydelsen

De två mest direkta parametrar härledda från impedansmätningar är resistans och kapacitans av celler. Resistance står för kvalitet och funktion av cellbarriären och tar hänsyn till motståndet mot para-och trans-cellulär strömflöde därför. Kapacitans ger ett övergripande mått på elektrodtäckning. Det utmärkande för ECIS är att med hjälp av motsvarande kretsar och modellering de globala parametrar ger insikter om många fler cellulära egenskaper, inklusive cell-cell och cell-substrat sammanväxningar, som kommer att diskuteras senare i denna artikel.

Innan du börjar: Experimentell consideransoner

Mätning inställning - Installationen består av flera separata komponenter: ECIS enhet med mätningselektronik, PC för datainsamling, array hållare för 8 - eller 96-bra-system, ECIS arrayer och cellkultur val. Matrisen Innehavaren måste placeras i en inkubator och anslutna till ECIS enhet utanför inkubatorn. Datorn måste vara utrustad med ECIS programvara (1.2.123.0 14 februari 2013) och ansluts till ECIS enhet.

Array val - Det finns ett ständigt växande utbud av ECIS matriser, avsedda för flera program. De schablon arrayer är den 8W1E och 8W10E arrayer, som består av åtta odlingsbrunnar (indikeras med W) innefattande ett eller 10 mätelektroder (anges med E), respektive. En stor motelektrod sluter kretsen, men dess impedans är i huvudsak försumbar i själva mätningen ^6. Standarden 8 brunnar array innehavaren kan vara värd två enrrays, vilket resulterar i ett totalt antal av 16 odlingsbrunnar. De guldelektroderna är 50 nm tjockt, avgränsas med en isolerande film och monteras på antingen en optiskt klar Lexan polykarbonatsubstrat eller ett tryckt kretskort (PCB). PCB-arrayer är mer robust och kostnadseffektiv. De genomskinliga diabilder tillåter ljus och immunofluorescensmikroskopi. Vad måste beaktas är att 1E array förbättrar fluktuationer i motståndssignalen orsakade av cellrörelser och krävs för sårläkning studier. Dessutom enstaka elektroder tillåter korrelation av elektriska och optiska signaler. I multielektrodanordningar, är signalen som medelvärde över flera elektroder, vilket beror på den ökade mätområdet innehåller flera celler i mätningen, begränsar förspänningen av data genom ojämn inokuleringen och tillväxten av cellerna och minskar suddigheten av signalen på grund av cell rörelser. Därför är de multielektrodanordningar är användbara för att studera cellproliferation och barriärbildningen. Bredvidvanliga arrayer finns särskilda matriser tillgängliga för tillämpningen av skjuvspänningen ^9, för att studera chemotaxis ^10, cell migration och spridning samt 96-brunnar för hög genomströmning filmvisningar. Avslutningsvis, är starkt beroende av vetenskapliga frågor och celltyp matrisen som ska användas och bör väljas och testas noggrant.

Frekvensmätning - Modelleringen av Rb och alfa (se dataanalys) kräver multifrekvensmätningar (MFT). Annars impedansen kan mätas över tid på en celltyp specifik frekvens (SFT), med den fördelen att data kan samlas in med en högre tidsupplösning. Den känsligaste frekvensmätning för en specifik celltyp kan hittas genom frekvensläsningar. Vid plottning impedans respektive motstånd mot frekvensen i ett log-log diagram frekvensen där skillnaden mellan cellfria och cell täckta elektroden är störst är den frekvens där cellerna blockerar than aktuell mest effektivt. I händelse av endotelceller (EC) denna frekvens är vid ca 4 kHz.

Sådd densitet - Som i varje ordinarie cellbaserade experiment seedning densitet är beroende av vetenskapliga problem. Vid studie av vidhäftning och spridning eller barriärbildningen bör endotelcellerna ympas med en hög densitet av 40,000-60,000 celler / cm ² för att garantera en sammanflytande, stabil barriär efter 48 timmar. Om fokuseringen av experimentet är på proliferationen bör endotelcellerna ympas med en låg densitet av ca 2,000-10,000 celler / cm ^2.

Protocol

1. Beredning av mätsystem

1. Prewarm arrayen hållaren i en inkubator till 37 ° C före start av experimentet för att förhindra kondens.
2. Fyll vatten kista i inkubatorn med destillerat vatten för att undvika uttorkning av brunnarna.
3. Utför alla manipulationer på celler och matriser i ett skåp med laminärt flöde under sterila betingelser.

2. Beredning av arrayer och Ympning av celler

OBS: ECIS arrayer måste rengöras och stabiliseras innan ett experiment för att förhindra elektrod drift, för att förbättra väl-till-bra reproducerbarhet och signal-till-brus-förhållande. Därför två alternativ: A) förbehandling av elektroderna med L-cystein och B) stabiliseringsfunktion ECIS.

Alternativ A: L-cystein rekommenderas som den mest konsekventa förbehandling, men kan i vissa särskilda fall samverkar med protein coatings på elektroderna. Volymerna presenteras används för standard 8-brunnars arrayer.

1. Tillsätt 200 | il / brunn 10 mM L-cystein. Cystein rengör och modifierar elektrodytan ger en hög och reproducerbar elektrod kapacitans.
2. Inkubera 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
3. Tvätta två gånger i 500 | il / brunn med ultrarent vatten (typ 1). Använd inte fosfatbuffertar, som kan störa adsorptionen av vissa proteiner. Undvik också seruminnehållande lösningar före beläggning, eftersom guld yta adsorberar de första makromolekyler som väckts i kontakt.
4. Coat med 200 l / brunn varm 1% gelatin.
5. Inkubera 30 minuter vid 37 ° C.
6. Ta bort gelatin, men låt inte ytan torka. Detta kan skada elektroderna.
7. Tvätta en gång med ultrarent vatten (typ 1).
8. Lägg till 400 l / brunn komplett cellkulturmedium (innehållande serum, antibiotika och alla tillväxtfaktorer).
9. Skjut array till array innehavaren end. Se till att uppsättningen är placerad så att de nio guld fyrkantiga kuddar är korrekt kontaktas av de fjäderbelastade Pogo stift och fix justeringsskruven för hand. Var försiktig med transparenta matriser, kan guldskiktet lätt skadas.
10. Öppna mätning programvara och trycker på Setup följt av Check i "Collect Data" för att göra en snabb impedans mätning av varje enskild brunn. De resulterande värdena är baslinjemätningen och kommer automatiskt att lagras i "Kommentarer".
11. Kontrollen väl kommer automatiskt att avgöra vilken typ av ECIS arrayer används. Kontrollera de valda arrayer i avsnittet "Well Configuration".
12. Matrisen Diagrammet lyser grönt för korrekt anslutna brunnar och rött för tomma eller felaktiga anslutna brunnar. Fortfarande, alltid se till att arrayer placerades korrekt i hållaren.
    OBS: Om rengöring och beläggning lyckades de 8W1E ECIS arrayer har acapacitance av ca 5 nF och 8W10E arrayer av 50 nF, vilket resulterar i ett initialt motstånd av ca 2000 och 200 Ω, respektive.
13. Ta bort array från hållaren.
14. Seed celler som en enkelcellsuspension i 400 | il / brunn komplett cellodlingsmediet.

Alternativ B: Den stabilisering funktion ECIS kan användas som alternativ eller i kombination med L-cystein behandling och om problem med elektrodglidning eller stora skillnader i väl-till-bra motstånd och kapacitans uppstår.

1. Utför cystein behandling (tillval) och precoat elektroder med protein (tillval).
2. Addera 200 pl / brunn av fullständigt medium till varje brunn och att placera kedjan i matrisen hållaren.
3. Öppna mätning programvara och trycker på Setup följt av Kontrollera att utröna arrayen är korrekt ansluten och att mäta initial Z, R och C.
4. Stabilisera elektroderna genom att trycka på (ca. 3 mA), hög frekvens (64 kHz) puls för att rengöra elektroderna.
5. Kontrollera elektroderna igen. Kapacitans bör ökas och motståndsvärden bör vara i en jämförbar intervall.
6. Om kapacitans och motstånd värden är fortfarande inte tillfredsställande, upprepa stabilisering.
7. Ta bort array från hållaren och ympa cellerna.

3. Konfigurera Mätning Programvara och Data Acquisition

1. Placera matrisen i matrishållaren som beskrivits tidigare.
2. Öppna mätning programvara och trycker på knappen Inställningar i "Collect Data" för att ansluta ECIS mjukvaran till ECIS instrumentet och kör en annan väl Kontrollera.
3. Kontrollera de valda arrayer i avsnittet "Well Configuration".
4. Välj de brunnar som skall mätas i "Well KONFIGURATjon "avsnittet.
5. Välj mätningsläge från "Samla data" alternativ:
   1. För en tidsserie med en fast frekvens, välj Single Freq. / Tid (SFT) och välj frekvensmätning från rullgardinsmenyn.
   2. För mätning av elektro täckning och modellering av Rb och Alpha, välj Flera Freq. / Tid (MFT). Den ECIS Enheten mäter automatiskt på alla tillgängliga frekvenser.
   3. För mikrorörelser (se dataanalys) väljer Rapid Time Collect (RTC) och justera frekvensmätning och samplingsfrekvens. Här standardtidsupplösning är ett sampel per sekund (1 Hz), men samplingsfrekvensen kan också ökas för att spåra snabba förändringar i impedansen upp till 25 Hz (för Z-Theta). Viktigt: i RTC-läge bara en enda väl mäts.
      OBS: Om mikrorörelser behöver mätas i flera brunnar senare, gå till Hjälp> Visa expert verktygsfält / menyalternativ> Acquire> Multi-Well RTC. Ange Tidsfrist (h) i Samla in data sektionen, den ECIS kommer nu att mäta utvalda brunnar i nummerordning. Efter start av mätningen programmet kommer att be för att ange antalet cykler. Ange värdet för hur ofta mätningen behöver upprepas.
6. För SFT och MFT, välj den tid Intervall (sek) mellan mätningar eller om data måste förvärvas så snabbt som möjligt lämna det här alternativet avmarkerat.
   OBS: För att få uppgifter att ECIS anordningen använder en multiplexer för att byta från en brunn till en annan med ett minimum SFT förvärvstakt på 0,25 sek och 7,5 sek för MFT. Betydelse intervallet är beroende av antal utvalda brunnar och frekvenser. För mätningar på långsamma celler som förökar sig eller en enkel inspelning av motstånd mot tiden, använder intervaller på 600 sek eller mer.
7. Tryck på Start, namnge filen och välja plats för att lagra data.
   OBS: Storlek inte borde vara ett problem, eftersom ECIS data sparas i ett slags oformaterad text som heter *. ABP, som aldrig överstiger flera hundra MB även med alla mätningsfrekvenser och antalet brunnar som valts.
8. Sluta köra genom att trycka på Slutför.

4. Medium förändring och Cell Manipulation

1. Tryck på Paus, kommer detta att stoppa datainsamling, men fortsätter att köra den experimentella klockan.
2. Ta arrayen från hållaren och manipulera det i dragskåp bänk (dvs. förändring medium).
3. Placera array tillbaka i hållaren och antingen klicka på Check Connection eller Fortsätt Experiment för att fortsätta datainsamling. Mätningen mjukvaran kommer att placera en tidstecken i datamängden.

5. Akut Stimulering Under Datainsamling

OBS: Ett andra alternativ är att manipulera celler under datainsamling för att följa omedelbara förändringar. Detta är endast möjligt; När prover inte behöver vara steril i det fortsatta förloppet av experimentet.

1. Lägg stimulansen direkt till väl och se till att blanda försiktigt med en 200 jil pipett.
2. Mark tidpunkt manuellt genom att trycka på Markera och lägg till en kommentar.

6. Elektrisk sårbildning

OBS: Att hitta rätt inställningar för den använda celltypen är nyckeln för elektrisk såra. Om såra är för kort kan detta leda till otillräckligt avlägsnande av celler, medan om såra är för lång och / eller grov detta kan skada elektroderna (särskilt på de transparenta arrayer). Därför är flera kort sårskada pulser rekommenderas. För HUVEC kulturer två 10-20 sek lång sårskada pulser på 5 V vid 60 kHz vardera har funnit optimal användning av ECIS 1600R. I allmänhet är det rekommenderat att använda höga frekvenser> 20 kHz för att upprätthålla samma höga fält över cellerna och för att undvika skador på elektroderna.

1. Utför såra DURning ett aktivt ECIS mätning.
2. Aktivera Sår / electroporate Inställningar, klicka Sår och fyll i tid (sek), sår spänning (V för 1600 R) eller ström (iA för Z och Z-Theta) och frekvens (Hz). De visade Standardvärdena är baserade på vilken typ av matris och ECIS enhet.
3. Välj brunnarna att sår i avsnittet "Well Configuration". Endast de markerade borrningar kommer att såras.
4. Aktivera Fördröj till timme och fyll i fördröjningstiden för att aktivera fördröjnings såret funktionen. Denna funktion kan avbrytas när som helst genom att trycka på Stopp eller tillämpa ett sår för hand. Endast en fördröjning kommando kan vara aktiv åt gången.
5. Tryck på Aktivera och klicka på OK i popup-fönstret för att börja såra.
6. Se till att motståndet signalen sjunker till offset impedans efter sårskada, annars upprepa sårande.

7. Dataanalys

Datarepresentation och export.

1. Avsluta mätning eller läsa in data in via Arkiv -> Öppna.
2. Välj brunnar som ska visas från "Well Configuration" fönstret. Gruppera de enskilda brunnarna för att presentera den genomsnittliga.
3. Välj parametern som skall visas från den övre verktygsraden (Z, R eller C).
4. Välj diagramtyp från den övre verktygsfältet (T = tid, F = frekvens, 3D = vattenfall blot).
5. Definiera diagram offset och intervall med reglagen under graffönstret eller fyll i de exakta värdena i angränsande kontrollerna.
6. Välj från de grundläggande "Time-serien Options" i avsnittet "Analysera" för att utföra standardavvikelsen, som kör i genomsnitt eller normalisering av data.
7. Aktivera Expert Toolbar i Hjälp-menyn för mer avancerade operationer som Nyuist tomt och Fourier transformation.
8. Använd "Visningsalternativ" i avsnittet "Analysera" för att definiera range av x-och y-axlarna och export grafen.
9. Exportera valda data till en Excel-fil via Arkiv -> Exportera data -> till Excel (vald) och använda en tredje parts programvara i valet för djupgående analys, statistik och representation vid behov.

Modellering av Rb och Alpha.
OBS: För modellering rekommenderas att använda ett cellfritt, medium fylldes väl som referens.

1. Slutför MFT mätning eller last MFT datamängd.
2. Om en cell fritt referens väl är tillgängligt trycker du på antingen Sök för att automatiskt välja referensvärdet eller Set för att markera cellen fritid punkt manuellt från "Freq. Scan Modeling" i avsnittet "Analysera".
3. Om det inte finns någon cellfri referens, importera ett referensvärde från en annan uppsättning data. Öppna referensdatauppsättningen (se till att samma utbud och medel användes) och använda Sök eller Ställ in för att välja referensvärdet.Navigera sedan till de uppmätta data och tryck på Hämta.
4. Om det inte finns några cellfria referensdata som finns tillgänglig om användning av fabriksinställningarna.
5. Tryck Modell för att starta beräkningarna. Modellering kan ta flera minuter beroende på storleken på datamängden.

Beräkning av mikrorörelser.
OBS: Denna beräkning är inte en del av den mätning programvara, men kan utföras med någon programvara för signalbehandling.

1. Avsluta RTC mätning eller ladda RTC datamängd.
2. Normalisera data som fastställts av den medelvärdesmotståndet hos hela perioden.
3. Bryt datamängd i segment med en längd av 256-datapunkter och rengör varje segment av ett Hanning-fönster.
4. Kör ett 256-punkts Fourier-transformation och genomsnitt resulterande frekvensspektra till en enkelsidig 129-punkts effektspektrumet för att minimera slumpartat brus och förbättrad biologisk signal.
5. Plot frekvens mot amplituden i ett log-log diagram och tillämpaminsta kvadrat linjär anpassning.
6. Lutningen på den linjära passform är ett mått på den totala bruset i signalen och därigenom mikrorörelse hos cellerna.

Representative Results

Att sätta upp ett experiment är ganska enkel och själva mätningen är helt automatisk, men som så ofta är fallet, korrekt analys och tolkning av data är avgörande. I den representativa uppgifter sektionen en guide tillhandahålls för tolkningen av de viktigaste parametrar som impedans spektroskopi med ECIS. Detta kommer att vara till hjälp för att bestämma vilken typ av vetenskapliga problem en ECIS mätning kan vara användbara och vilka parametrar som ska registreras.

En typisk experimentell avläsning kan generellt delas i ett tillväxtfasen efter cellympning och en platå-fas när cellerna når sammanflytning. Var och en av dessa faser ger information om olika cellulära egenskaper. En representativ mätning visas i fig. 2 och delas in i fyra underfaser för att analysera A) cellvidhäftning, spridning och proliferation, B) bildande av en mognads EG barriären; C) cell migration efter alstringen av en elektriskal lindas, och d) det cellulära svar på stimulering med det vasoaktiva medlet trombin. Fas-kontrast och immunfluorescensbilder förvärvades direkt av den mätning elektroden under de olika underfaser för att illustrera sambandet mellan elektrod täckning, cellstatus, och inspelad impedanssignal.

Vidhäftning, spridning och spridning

Varje celltyp har sin karakteristiska vidhäftning och tillväxtkurvan som kan manipuleras genom att variera såddtäthet, beläggning med extracellulära matrisproteiner eller andra stimuli. En av de stora svårigheterna att studera dessa processer är att skilja mellan vidhäftning, spridning och proliferation. Wegener m.fl. ^11. Gav en detaljerad beskrivning för att använda en kombination av motstånd och kapacitans för att skilja mellan dessa parametrar och i figur 3 blir det uppenbart hur motstånd och kapacitans kan komplettera varandra. Det är viktigt förstudiet av adhesion och spridning att förstå inverkan av mätfrekvensen, för här det elektriska fältet orsakar en polarisering av cellmembranet hos cellerna i suspension ^8, vilket tvingar strömmen att flyta endast runt cellerna. När cellerna fästa de börjar att begränsa strömflödet genom spridning över elektrod och kapacitans minskar på ett linjärt sätt med den procentuella andelen öppen area på elektroden (delyta). Därför kan vidhäftning, spridning och proliferation kvantifieras bäst, vid inspelning av kapacitansen vid en frekvens högre än 40 kHz (figur 3B), där minskningen i kapacitans är direkt proportionell mot elektrodtäckning. Alternativt motstånd som mest känsliga frekvensmätning är ett direkt mått på differentiering och mognad av celler i ett sammanflytande barriär (Figur 3A). Förutom den delyta, Wegener et al. Introducerade två andraparametrar för att kvantifiera vidhäftning och elektrodtäckning: t _1/2 (halv maximal kapacitans), vilket är den tid till dess 50% av elektroden är täckt med celler (figur 3B, infogning) och lutningen hos den kapacitans-kurvan (s, inte visas) i takt med cellspridning och spridning.

Motstånd som ett mått på barriärkvalitet

Resistens är den del av impedansen som beskriver barriär kvalitet och funktion bäst, eftersom den försummar kapacitiva komponenterna från membranet, elektrod och medium. Här begreppet barriär kvalitet och inte permeabilitet används, eftersom permeabilitet är per definition endast beroende av cell-cellkontakter. Resistens emellertid bestämmes genom förmågan hos celler och deras cell-cell-och cell-matrix-interaktioner för att blockera strömflödet. Således olika celltyper (kloner och passager) har sina specifika resistansvärden (Figur 4A). Även om motståndet ger en betydligt Clearer uppfattning om cellbarriären bör impedanssignalen alltid tas i beaktande.

Modellering av Rb och Alpha

Den ECIS programvara hyser en viss funktion, förmåga att modellera två parametrar, som skiljer mellan cell-cell och cell-matrix sammanväxningar (figur 4B och 4 C). Rb (i cm ² x ohm), är resistiviteten för cell-cell-kontakter i strömflöde och därmed ett omvänt mått på klassisk permeabilitet. Hög Rb innebär låg permeabilitet mot strömflödet. Alpha (i cm x ohm ^0.5), är ett mått för impedans bidrag som följer av cell-elektrod korsningar. Modellen att kvantifiera cell-cell och cell-matrix kontakter infördes 1991 av Giaever och Keese och bygger på antagandet att cellerna är runda, skivformade objekt som har en isolerande membran, sväva över elektroden och är fyllda med ledande elektrolyt ² . Denisolerande egenskapen hos cellmembranet lämnar endast tre banor för ström: a) mellan den ventrala ytan av cellerna och elektrod, b) mellan de cell-cell-kontakter och c) genom cellerna (sannolikt endast när en hög mätfrekvens används ). En mer detaljerad härledning och förklaring finns i tidningarna av Lo et al ^3,12.

Micromotion

Det har visat sig att små fluktuationer i motståndet signalen (Figur 4A) är på grund av subtila, slumpmässiga cellrörelser i konfluenta cellskikten liksom även celler som rör sig till och från elektroden i glesa kulturer ^2. Denna aspekt av ECIS tid-kursdata som beskrivs av Lo och Opp et al. ^13,14 är ofta förbisedd och ses bäst vid mätning med 1E matriser och på den känsligaste frekvens att redovisa para-och subcellulära strömvägar. Beräkningen av denna cell orsakade buller (mikrorörelse) är inte en del av the standard mätning programvara, men i den senaste versionen Fast Fourier Transformation (FFT) är integrerat. Inspelning RTC-data med en samplingsfrekvens på 1 Hz under 1 h vid 4 kHz ger tillräcklig upplösning för beräkning av EG mikrorörelse. Denna beräkning ger ett enda värde och kan direkt användas för statistisk analys. En utökad diskussion om användning av frekvensanalys för mikrorörelser kan hittas någon annanstans ^15. Alternativt till FFT andra strategier för analys kan användas, i likhet med variansen för inkrement. Varians är mer känsliga mot små förändringar i mikrorörelser, men på grund av denna känslighet jämförelse av enskilda experiment blir svårt. Sluttningarna av effektspektrum är ett mer robust mått på mikrorörelser (Figur 4D). Här arean under kurvan kan ses som mängden mikrorörelser eller buller cellerna skapar. Hence, desto brantare lutningen på effektspektrumet ju mindre arean under kurvanoch ju mindre mikrorörelse.

Elektrisk sårläknings analys

För att studera migration av celler, vanligen mekaniska sår appliceras genom att skrapa celler från odlingsplattan med pipettspetsar, cellskrapor eller särskilda stämplar och följa deras återflyttning mikroskopiskt ^16. Denna metod har den uppenbara nackdelen att storleken på den skrap varierar och är vanligen för stora för att försumma inverkan av cellproliferation på sårläkningsprocessen. Den skadade funktion ECIS använder en hög spänning, hög frekvens puls för att få en cell gratis elektrod och därefter följer återflyttning av angränsande celler för att ersätta dödscellerna (Figur 5A). En fördel med denna automatiserade metod jämfört med vanliga, arbetsintensiva scratch-analyser är att ECIS producerar en mycket reproducerbar sår med en exakt diameter på 250 um, som stängs inom ett par timmar, för att studera ren migration. Vidare är den elektriska pulsen göraes inte bort proteinbeläggning och utsöndras extracellulärt matrix. Under antagandet att cellerna remigrate på elektroden från alla sidor, kan vandringshastigheten enkelt beräknas genom att dividera lindad radie av tid som krävs för sårtillslutning ^17. Som ett alternativ till elektrisk sårskada, nyligen den så kallade elstängsel metoden introducerades (ej visad). Här höga strömpulser förhindra kvarstad och migration av celler på elektroderna efter ympning. Cellerna kommer att växa runt mätningselektrod och börja migrera inåt så snart som de elektriska pulserna är släckta. Fördelen med elstängsel över den elektriska sårskada är att elektrodytan inte har förändrats av celltillväxt eller cell avlägsnande, vilket är viktigt för att mäta inverkan av olika beläggningar på cellmigration.

Cell stimulering

Förutom studien av cellmigration är impedansspektroskopi perfekt lämpade förmäta effekterna av droger och gifter om celler. Figur 5B visar en klassisk stimulering / hämning experiment, där trombin användes för att inducera hyper permeabilitet i sammanflytande EG barriären genom kontraktion och gap bildandet av celler, som yttrar sig som en övergående nedgång i motstånd . Genom förinkubering med Rho kinas-hämmare Y-27632 mesta av trombin svaret minskas genom att sänka basalcellsspänning ¹⁸ och blockera spänningsfiberbildningen ^19. Då Rho kinas blockerare har använts vid olika tidpunkter efter trombin dessutom leder till en omedelbar och total återhämtning av EG-barriären. Här fördelen av en kontinuerlig mätning, impedans för att studera akuta cellulära svar blir uppenbart. I vanliga slutpunktsanalyser (t ex immunfluorescensfärgning eller makromolekyl passage), skulle detta akuta svar på den används blockeraren vara mycket svårt om inte omöjligt att detektera och kvantifiera. Viktigt att notera är att med Impedance mätningar permeabilitet mot joner beskrivs och inte mot makromolekyler. Se Aman et al. ^20, där en utmärkt jämförelse mellan ECIS mätningar och makromolekyl passage experiments tillhandahålls.

Figur 2. Representant mätning. MVEC odlades på en gelatinbelagd 8W1E celler med en låg såddtäthet av 5.000 celler / cm ² och MFT inspelning utfördes under 10 dagar. Mätningen visar de olika avläsningar av en ECIS experiment: A) adhesion, spridning och spridning, B) bildning och mognad av en sammanflytande cellbarriär, C) sårläkning efter applicering av en elektrisk sår, D) stimulering med vasoaktiva agent trombin. De två pilarna visar medel förfriskningar, som utfördes i intervaller om 4 dagar och ger en uppfattning om hur känsliga mätningarna mot mekaniska stimuli och förändringar i temperatur och pH. Bilderna i den övre panelen motsvara mätning och förvärvades direkt från mätningselektrod. Den fas-kontrast bilden till vänster visar endotelcellerna 24 timmar efter ympning, börjar täcka elektroden. De immunfluorescensbilder i mitten och till höger föreliggande F-aktin-färgning av konfluenta endotelskiktet före och efter stimulering med trombin (1 U / ml). Trombin orsakar sammandragning av endotelceller genom bildning av så kallade spännings fibrer och övergående öppning av inter-endothelial mellanrum (pilar och bild skär), igenkännbara i ECIS signalen med en nedgång i motstånd mot baslinjen. Här känsligheten av mätningen blir uppenbar och hur förändringar i cellskiktet korrelerar med impedanssignalen.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Cellvidhäftning och tillväxt. MVEC från samma donator såddes med tre olika densiteter på gelatinbelagda 8W10E arrayer och celltillväxt noterades på flera frekvenser för 60 timmar. A) Motståndsvärdena för de tre betingelser vid deras optimala frekvens på 4 kHz för att mäta barriärbildning. Alla tre seeding tätheter etablerat en sammanflytande barriär av ca. 1,200 Ω vid slutet av mätningen,. Spridningen kurserna dock (kurvornas lutning) skiljer sig markant B) Mätning av kapacitans vid 64 kHz ger insikter om vidhäftning och spridning. Vidhäftning är den iitial platåfasen av kapacitansen kurvan (mellan 2-8 h). Spridning, som är i linjärt förhållande till elektroden täckning, representeras av kurvans lutning och är fullständig efter 10 till 30 h beroende på såddtäthet. Den tidpunkt t _1/2 (halv maximal täckning) kan användas för statistisk analys. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Karakterisering av den sammanflytande barriär. Två MVEC donatorer med olika passagenummer (passage 3 och 6) såddes på gelatinbelagda 8W1E arrayer och ett MFT-mätning utfördes under 30 h för att karakterisera EG-barriären. A) Motstånd mätningar visar att den yngre donator 1 har en högre resistans på ca. 11.000 Ω i jämförelse med ca. 7,500 Ω av den äldre donator 2. F.Kr.) De modellerings kapacitet ECIS har använts för att finna orsaken till den lägre motstånd. Modellering visade en jämförbar interaktion cell-cell Rb och indikerade en försvagad cell-matrix interaktioner Alpha som en möjlig orsak. D) RTC utfördes för att kvantifiera mikrorörelse inom sammanhängande cellager av Fourier transformation, då arean under kurvan är proportionell mot mikrorörelser . Analyser av spektra visar mindre mikrorörelse av den äldre givare 2 och på så sätt stödja det som redan kan antas från motståndssignalen (mindre varians). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5 "fo: innehåll-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
Figur 5. Cellmigration efter elektrisk sårskada och effekterna av trombin stimulering. Impedans inspelningar genomfördes vid 4 kHz med maximal tidsupplösning. A) MVEC donator 1 användes i passagen 3 och givare 2 i kanalen 6 på gelatinbelagda 8W1E arrayer och odlades till konfluens. Då en elektrisk sår skapades genom tillämpning av två 5 V pulser vid 60 kHz med en löptid på 20 sekunder vardera. Den yngre donator 1 visade bättre sårläkningsförmåga baseras på en snabbare sårtillslutning (migration, kurvornas lutning) och en högre beständighet efter sårskada jämfört med den äldre donator 2. B) HUVEC odlades på gelatinbelagda 8W10E arrayer. Upon confluence cellerna har serum svältes under 1,5 timmar genom att ersätta det fullständiga odlingsmediet med basalmedium plus 1% humant serumalbumin (HSA). Usålder av slätt medium med HSA är ett kritiskt steg, eftersom serumkomponenter blockera trombin svar. Så snart ett stabilt motstånd platå detekterades var trombin sattes direkt till brunnarna och blandades försiktigt med en 200 jil pipett. Den maximala trombin effekten syns efter 30 min, som kännetecknas av en övergående nedgång i motstånd till baslinjen och en ca. 30-50% lägre motstånd efter återhämtning. Cellerna antingen förinkuberades med Rho kinas blockerare Y-27.632 i 30 min eller blockerare sattes 20, 30, eller 40 min efter trombin dessutom som minskat trombin i kraft omedelbart. Klicka här för att se en större version av denna siffra .

Discussion

ECIS är ett utmärkt verktyg för screening av cellegenskaper och beteende samt för kvantifiering av effekterna av kända och okända ämnen. Därigenom cellerna hålls under standardodlingsbetingelser kan impedans kontinuerligt övervakas med en hög tidsupplösning och korreleras till optiska signaler. På så sätt den optimala tidpunkten för cell manipulationer kan väljas på basis av den morfologiska och funktionella cellstatus. Tyvärr kommer denna hög mätupplösning med priset att små förändringar i temperatur, pH eller mekanisk stimulering av celler (mediumbyte) kommer att påverka impedanssignalen omedelbart.

Tillämpningen av den lilla mätningsström till cellerna gör att ECIS mätning icke-invasiv, icke-förstörande, och etikett-fri, men som ett resultat endast passiva bioelektriska egenskaper kan mätas (inga aktionspotentialer). En viktig egenskap är att ett antal parametrar kan vara der ived från en enda mätning, som kombinerar information från flera klassiska analyser, såsom permeabilitet eller sårläkningsanalyser. Här den särskilda intressant aspekt är att matematiskt modellerade data kan användas för att undersöka förändringar i motstånd och kapacitans och hänvisa dem till olika cellstrukturer (t.ex. cell-kontakter eller cellmembran). Viktigt att notera är att impedansspektroskopi ger alltid ett genomsnitt signal från alla celler på avkännande elektroden, som inte tillåter för studier av enskilda celler och även den matematiska modellen är endast giltig i sammanflytande cellager. Därför endotelceller bör hållas i sammanflytande tillstånd under minst en dag innan används för modellering för att se till mogna cell sammanväxningar och vilande celler. Likaså bör elektriska sår endast tillämpas på sammanflytande cellskikt med användning av multipla korta sårskada pulser med höga frekvenser, för att uppnå optimal sårskada effektivitet och förhindra skada på elektroderna.

jove_content "> För att få maximal mängd information från ett ECIS mätning, som i varje analys, flera parametrar såsom kombinationen av array substrat, beläggning och seedning densitet för den enskilde celltyp måste testas och optimeras innan ett experiment.

En viktig begränsning av ECIS är att mätningen inte ger direkt information om den molekylära nivån. Således ECIS mätningar är oftast mest informativa i början av en experimentell serie för att associera ett vetenskapligt problem med cellulära strukturer eller egenskaper och ger betydande bidrag till skapandet av en testbar hypotes. Därför den modulära designen av ECIS erbjuder ett brett spektrum av applikationer med möjlighet för skräddarsydda arrayer. De senaste array utveckling tyder på en framtida satsning på hög genomströmning impedans filmvisningar för celltillväxt och elektrisk såra och förskottet för speciella flödes matriser för simulering av in vivo

Ytterligare litteratur
Se även webbsidan för Applied biofysik (www.biophysics.com) för ansökan anteckningar, webbseminarier och en detaljerad lista över publikationer som täcker hela ECIS spektrumet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Bovine Thrombin	Merck Millipore	604980
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Pen/Strep	Lonza	17-602E