Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Summary

Questo protocollo commenti elettrico Cell-substrato Impedance Sensing, un metodo per registrare ed analizzare lo spettro di impedenza di cellule aderenti per la quantificazione di adesione cellulare, la proliferazione, motilità, e le risposte cellulari agli stimoli farmacologici e tossici. Rilevamento di permeabilità endoteliale e la valutazione di cellula-cellula e cellula-substrato contatti sono enfatizzati.

Abstract

Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing (ECIS) è un sistema di misura di impedenza in vitro per quantificare il comportamento delle cellule all'interno di strati di cellule aderenti. A tal fine, le cellule sono coltivate in speciali camere di coltura in cima, elettrodi d'oro circolari opposte. Una corrente costante piccola alternata è applicata tra gli elettrodi e il potenziale di tutti viene misurato. Le proprietà isolanti della membrana cellulare creano una resistenza verso il flusso di corrente elettrica che provoca un aumento potenziale elettrico tra gli elettrodi. Misurazione dell'impedenza cellulare in questo modo consente lo studio automatizzata di adesione cellulare, la crescita, la morfologia, la funzione e la motilità. Anche se la misura ECIS in sé è semplice e facile da imparare, la teoria di fondo è complessa e la selezione delle impostazioni giuste e l'analisi e l'interpretazione dei dati corretti non è auto-evidente. Eppure, un protocollo chiaro che descrive i singoli passi dalla sperimentaleprogettazione alla preparazione, realizzazione e analisi dell'esperimento non è disponibile. In questo articolo il principio di misura di base e le possibili applicazioni, considerazioni sperimentali, vantaggi e limiti del sistema ECIS sono discussi. Una guida è disponibile per lo studio di adesione cellulare, diffusione e proliferazione; quantificazione del comportamento delle cellule in uno strato confluente, per quanto riguarda la funzione di barriera, la motilità cellulare, qualità di cellula-cellula e cellula-substrato aderenze e quantificazione di guarigione della ferita e risposte cellulari a stimoli vasoattivi. Risultati rappresentativi sono discussi sulla base microvascolare umano (MVEC) e ombelicale cellule endoteliali della vena umane (HUVEC), ma sono applicabili a tutte le cellule in crescita aderenti.

Introduction

ΩΩΩHere presentiamo elettrico Cell-substrato Impedance Sensing, conosciuto come ECIS, un metodo specifico per misurare e analizzare lo spettro di impedenza di cellule aderenti nella cultura ^1. Lo scopo di questo protocollo è quello di offrire una guida generalmente applicabile per l'uso di questo particolare tipo di impedenza basato analisi cellulari e fornire protocolli per alcune delle funzioni chiave dal numero sempre crescente di applicazioni. La ricerca sarà incentrata sullo studio della proliferazione cellulare, la funzione di barriera, giunzioni cellulari, e la motilità cellulare.

Dal ECIS e il suo modello associato per trasformare i dati di spettroscopia di impedenza nei parametri biologicamente rilevanti è stato introdotto nella sua forma attuale alla comunità scientifica da Giaever e Keese nel 1991 ^2, è stato spesso indicato come un sistema per la misurazione della TEER (trans -epiteliale resistenza elettrica), che non è preciso. Le differenze sembrano marginali in un primo momento, masono importanti per l'interpretazione dei dati. Per le misure classiche Teer, le cellule sono coltivate su filtri permeabili per caratterizzare meccanismi di trasporto paracellulare, che sono dominati da giunzioni strette epiteliali o adherens endoteliali giunzioni ^3. Comunemente, due elettrodi posizionati sopra e sotto il filtro sono utilizzati per applicare una corrente continua (DC) scorrono sopra lo strato di cellule e altri due elettrodi per misurare la conseguente caduta di tensione ^4. La resistenza elettrica è calcolata utilizzando la legge di Ohm, che permette una descrizione numerica della qualità della barriera cella.

ECIS segue questo principio di base e lo estende. Nel sistema ECIS, le cellule sono coltivate su opposte, elettrodi d'oro circolari che sono incorporati nel fondo di speciali piatti di coltura cellulare. Il numero di elettrodi per coltura pozzo è variabile, dipende dall'applicazione e gli elettrodi hanno un diametro standard di 250 micron, in alcuni casi, un controelettrodo grandeè utilizzato per completare il circuito. ECIS utilizza una corrente alternata costante (AC) di 1 μA con una data frequenza invece di una corrente continua. L'impedenza viene calcolato in base alle corrispondenti variazioni di tensione (in mV) tra gli elettrodi. ECIS offre la possibilità di misurare l'impedenza in un intervallo di frequenze di studio di frequenza proprietà cellulari dipendenti, che ha diversi vantaggi rispetto TEER e saranno descritte in dettaglio in questo articolo. In primo luogo, la misura impedenza complessa permette di separare l'impedenza complessiva in resistenza barriera cellulare e la capacità della cella. Inoltre, prendendo dati a frequenze multiple e applicando un modello matematico, si può distinguere tra impedenza giunzionale (tenuta dei contatti cellula-cellula) e impedenza causata da interazioni cellula-substrato (distanza della membrana cellulare basale a matrice sottostante) nonché il contributo della capacità di membrana cellulare. In secondo luogo, la proliferazione cellulare e motilità possono essere valutati, poiché la cellulas sono in diretto contatto con gli elettrodi. Terzo, substrato e gli elettrodi sono sufficientemente sottili per permettere campo chiaro e contrasto di fase.

Base di misure di impedenza: L'impedenza complessa

La base per la misura dell'impedenza elettrica di oggetti biologici (cellule) è la legge di Ohm, un principio elettro-tecnica di base, che descrive la relazione tra la resistenza (R), la corrente (I) e la tensione (U) in un circuito elettrico in un determinato tempo (t).
Applicabile in circuito DC: R (t) = U (t) / I (t)

Quando si lavora nel sistema AC, corrente e tensione differiscono non solo nella loro ampiezza, ma anche nella loro fase (φ). Ora, la resistenza non è più sufficiente per descrivere queste relazioni. Invece, l'impedenza complessa (Z) o nella maggior parte dei casi la grandezza dell'impedenza (| Z |) sono utilizzati, contenente la resistenza ohmica precedentemente descritto più reattanza (X), che risultati di AC fluire attraverso condensatori e induttori di guida lo sfasamento tra tensione e corrente ^5.
Applicabile in corrente alternata: | Z (f) | = √ (R ² + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Per effettuare le misurazioni di impedenza su cellule intatte, dovuti alle caratteristiche della loro membrana, cellule agiscono come un collegamento in parallelo di resistenza e condensatore. Qui, resistenza rappresenta l'opposizione al flusso di corrente, mentre capacità (C) descrive la separazione dei vettori elettrici alla isolante bi-strato di membrana cellulare che provoca la polarizzazione della cella. Quindi X è dominato dalle proprietà capacitive della membrana cellulare.
X (f) ≈ (2 * Pi * f * C _Cell) ^-1

Poiché X è dipendente dalla frequenza, variazione della frequenza di misura permette studio delle diverse proprietà funzionali e strutturali della cellula. Il dispositivo misura ECIS sia R e X, che consente il calcolodi | Z |, C e φ.

Quantificare interi strati di cellule con spettroscopia di impedenza: Il circuito equivalente elettrico.

Come precedentemente spiegato, quando una cella viene portato in un campo elettrico, mostra proprietà di componenti elettronici passivi. Se ora, invece di una singola cella, un intero strato di cellule coltivate sugli elettrodi e integrato con mezzo di coltura cellulare viene indagato, il modello di resistenza e condensatore deve essere estesa a un'intera rete elettrica. In questo cosiddetto circuito equivalente, la resistenza del mezzo di coltura (R _Med) e capacità (C _elettr) e la resistenza (R _elettr) caratterizzare l'interazione elettrodo / elettrolita devono essere considerati ^3,6.

Un semplificata, esempio generale di un tale circuito equivalente di uno strato di cellule aderenti crescita può essere trovato in Figura 1. Il vantaggio di una tale matematicaAPPROCCIO per descrivere un sistema biologico è che questi circuiti possono essere raffinati ad libitum e adeguati alle domande sperimentali specifiche, ad esempio considerando l'impedenza causata da organelli intracellulari o per distinguere influenze di cellula-cellula (R _giunzione) e adesioni cellula-substrato (R _Sub) su ^7,8 impedenza complessiva. Tuttavia l'obiettivo per la modellazione deve sempre essere quello di utilizzare il minor numero di elementi che descrivono tutte le caratteristiche dello spettro di impedenza misurata per consentire correlazioni significative.

Figura 1. Schema del sistema di ECIS e circuito equivalente rappresentante per cellule in crescita aderenti livello. A) Sezione di una cultura ECIS bene. Le cellule crescono sulla cima di rilevamento e controelettrodo eri coperto con terreno di coltura. Gli elettrodi sono collegati ad un amplificatore lock-in e un segnale CA viene applicata attraverso un resistore 1 MW per creare un generatore di corrente costante. Gli stimoli possono essere aggiunti direttamente al mezzo di coltura in qualsiasi punto nel tempo. B) misure ECIS la somma dei singoli contributi alla impedenza. Resistenza del mezzo di coltura (R _Med) così come impedenza provocata dall'interfaccia elettrodo / elettrolita, che è per semplicità presentato come una combinazione in parallelo di un resistore (R _elettr) e un condensatore (C _elettr), e anche le proprietà elettriche della membrana cellulare, descritto da un collegamento in parallelo di resistenza (R _Cell) e capacità (C _Mem), tutti devono essere considerati. R _cellulare è variabile, in quanto dipende dalla permeabilità cellulare verso la corrente. Il circuito equivalente può essere estesa e raffinato ad libitum. Come esempio giunzionale (R _Junc) comecosì come subendoteliale (R _Sub) resistenza sono stati aggiunti al circuito. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Parametri di impedenza e il loro significato biologico

I due parametri più diretti conseguenti a misurazioni di impedenza sono resistenza e la capacità di cellule. Resistenza rappresenta la qualità e la funzione della barriera cellula e quindi prende in considerazione la resistenza verso-para e flusso di corrente trans-cellulare. Capacità fornisce una misura globale della copertura dell'elettrodo. La caratteristica distintiva della ECIS è che con l'aiuto di circuiti equivalenti e modellare tali parametri globali forniscono approfondimenti su molte proprietà più cellulari, tra cui cellula-cellula e cellula-substrato adesioni, che saranno discussi più avanti in questo articolo.

Prima di iniziare: conside Sperimentalerazioni

Impostazione di misura - Il setup è composto da diversi elementi distinti: dispositivo ECIS con elettronica di misurazione; PC per l'acquisizione dati, titolare di array per la 8 - o il sistema a 96 pozzetti, array ECIS e la cultura di cellule di scelta. Il titolare matrice deve essere posto in un incubatore e collegato al dispositivo ECIS all'esterno dell'incubatrice. Il PC deve essere dotato del programma ECIS (1.2.123.0 14 Febbraio 2013) e collegato al dispositivo ECIS.

Selezione Array - C'è una sempre crescente varietà di matrici ECIS, progettati per applicazioni multiple. Le matrici standard sono 8W1E e gli array 8W10E, che sono composti da 8 pozzetti di coltura (indicato da W) comprendendo 1 o 10 elettrodi di misura (indicati con E), rispettivamente. Un grande controelettrodo completa il circuito, ma la sua impedenza è sostanzialmente trascurabile nella misura reale ^6. Il supporto standard da 8 pozzetti array può ospitare due unrrays, risultando in un numero totale di 16 pozzetti di coltura. Gli elettrodi d'oro sono 50 nm di spessore, delineato con una pellicola isolante e montato su entrambi un substrato di policarbonato Lexan otticamente trasparente o un circuito stampato (PCB). Gli array PCB sono più robusti e convenienti. I vetrini trasparenti consentono di microscopia ottica ed immunofluorescenza. Ciò che deve essere considerato è che la matrice 1E migliora fluttuazioni del segnale resistenza causata da movimenti di cellule ed è necessario per studi cicatrizzazione. Inoltre, singoli elettrodi permettono correlazione dei segnali elettrici e ottici. Negli arrays multipli elettrodi, il segnale viene mediata su più elettrodi, che a causa della zona di misura maggiore include più celle nella misurazione, limita polarizzazione dei dati per inoculazione irregolare e la crescita delle cellule e riduce la sfocatura del segnale dovuta a cellule movimenti. Pertanto, gli arrays multipli elettrodi sono utili per studiare la proliferazione cellulare e la formazione di barriera. Accanto amatrici standard, ci sono matrici speciali per l'applicazione di sollecitazione di taglio ^9, per studiare chemiotassi ^10, la migrazione cellulare e la proliferazione nonché piastre a 96 pozzetti per proiezioni ad alta produttività. Per concludere, l'array da utilizzare dipende fortemente questione scientifica e tipo di cellula e deve essere selezionato e testato accuratamente.

Frequenza di misurazione - La modellazione di Rb e alfa (vedi analisi dei dati) richiede misurazioni Multi Frequency (MFT). Altrimenti impedenza può essere misurata nel tempo in un tipo cellulare frequenza specifica (SFT), con il vantaggio che i dati possono essere raccolti con una risoluzione temporale superiore. La frequenza di misura più sensibile per un tipo cellulare specifico può essere trovato scansioni di frequenza. Quando si stampano impedenza rispettivamente la resistenza in funzione della frequenza in un log-log grafico la frequenza in cui la differenza tra libero-cellula e cellula-elettrodo rivestito è il più grande è la frequenza dove le cellule bloccano tha attualmente più efficace. Nel caso di cellule endoteliali (EC) questa frequenza è di circa 4 kHz.

Densità di semina - Come in ogni normale densità a base di cellule esperimento di semina dipende dal problema scientifico. Quando si studia adesione e diffusione o formazione barriera, cellule endoteliali dovrebbero essere seminate con un'alta densità di 40.000-60.000 cellule / cm ² per garantire un confluente, barriera stabile dopo 48 ore. Se il focus dell'esperimento è sulla proliferazione, cellule endoteliali dovrebbero essere seminate con una bassa densità di circa 2000-10000 cellule / cm ^2.

Protocol

1. Preparazione del Sistema di misurazione

1. Preriscaldare il titolare matrice in un incubatore a 37 ° C prima di iniziare l'esperimento per evitare la condensazione.
2. Riempire cofanetto acqua dell'incubatore con acqua distillata per evitare l'essiccamento dei pozzetti.
3. Eseguire tutte le manipolazioni sulle cellule e array in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.

2. Preparazione di matrici e inoculazione delle cellule

NOTA: Gli array ECIS devono essere puliti e stabilizzata prima un esperimento per prevenire elettrodo deriva, per migliorare la riproducibilità pozzo alla vasca ed un rapporto segnale-rumore. Pertanto, sono disponibili due opzioni: A) pretrattamento degli elettrodi con la L-cisteina e B) la funzione di stabilizzazione della ECIS.

Opzione A: L-cisteina è consigliato come pretrattamento più consistente, ma potrebbe in alcuni casi particolari di interagire con proteine ​​coatings sugli elettrodi. I volumi presentati sono utilizzati per le matrici 8 pozzetti standard.

1. Aggiungere 200 microlitri / pozzetto 10 mM L-cisteina. Cisteina pulisce e modifica la superficie dell'elettrodo fornisce un alto e riproducibile capacità dell'elettrodo.
2. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Lavare due volte 500 microlitri / pozzetto con acqua ultra-pura (tipo 1). Non usare tamponi fosfato, che possono interferire con l'assorbimento di alcune proteine. Anche evitare soluzioni che contiene siero prima del rivestimento, in quanto la superficie dell'oro adsorbire le prime macromolecole portati a contatto.
4. Cappotto con 200 microlitri / pozzetto calda 1% di gelatina.
5. Incubare 30 minuti a 37 ° C.
6. Togliere la gelatina, ma non lasciare superficie asciutta. Ciò può danneggiare gli elettrodi.
7. Lavare una volta con acqua ultra-pura (tipo 1).
8. Aggiungere 400 microlitri / pozzetto mezzo completo di coltura cellulare (contenente siero, antibiotici e tutti i fattori di crescita).
9. Matrice diapositive in matrice titolare di und assicurarsi che la matrice sia posizionato in modo tale che i nove d'oro pastiglie quadrati siano correttamente contattati dai perni pogo molla e vite di regolazione fix mano stretta. Siate cauti con le matrici trasparenti, lo strato d'oro può essere facilmente danneggiata.
10. Aprire il software di misura e premere Setup seguita dalla Arrivo nella sezione "Raccolta dati" per effettuare una misurazione dell'impedenza rapida di ogni singolo bene. I valori risultanti sono la baseline di misurazione e verranno automaticamente memorizzati nei "Commenti".
11. Il controllo e determina automaticamente il tipo di array ECIS utilizzato. Verificare le matrici selezionate nella sezione "Be Configurazione".
12. Il diagramma matrice illumina in verde per i pozzi collegati correttamente e rosso per i pozzi collegati vuoti o errati. Eppure, sempre assicurarsi che le matrici sono stati collocati correttamente nel supporto.
    NOTA: Se la pulizia ed il rivestimento hanno avuto successo gli array 8W1E ECIS hanno acapacitance di circa 5 nF e le matrici 8W10E di 50 nF, che si traduce in una resistenza di base di circa 2.000 e 200 Ω, rispettivamente.
13. Rimuovere matrice da titolare.
14. Cellule Seed come sospensione singola cella in 400 microlitri / pozzetto completo terreno di coltura cellulare.

Opzione B: La funzione di stabilizzazione delle ECIS può essere utilizzato in alternativa o in combinazione con il trattamento con L-cisteina e se si verificano problemi con elettrodo drift o grandi differenze di resistenza e capacità benestante bene.

1. Eseguire un trattamento di cisteina (opzionale) ed elettrodi prestrato con proteine ​​(opzionale).
2. Aggiungere 200 pl / pozzetto di mezzo completo in ciascun pozzetto e posizionare la matrice nel supporto matrice.
3. Software di misura Apri e premere Setup seguita da partner di accertare la matrice è collegata correttamente e misurare Z iniziale, R e C.
4. Stabilizzare gli elettrodi premendo (ca. 3 mA), ad alta frequenza (64 kHz) impulso per pulire gli elettrodi.
5. Controllare nuovamente elettrodi. Capacità devono essere aumentati e valori di resistenza dovrebbe essere in una gamma paragonabile.
6. Se i valori di capacità e resistenza non sono ancora soddisfacenti, ripetere la stabilizzazione.
7. Rimuovere matrice dal supporto e inoculare le cellule.

3. Impostazione Software Measurement and Data Acquisition

1. Posizionare la matrice nel supporto matrice come descritto in precedenza.
2. Software di misura Apri e premere il pulsante Setup nella sezione "Raccolta dati" per collegare il software ECIS allo strumento ECIS ed eseguire un altro ben Arrivo.
3. Verificare le matrici selezionate nella sezione "Be Configurazione".
4. Selezionare i pozzetti devono essere misurate in "Well CONFIGURAZIONESezione ion ".
5. Selezionare la modalità di misura dal "raccogliere i dati" opzioni:
   1. Per una serie temporale ad una frequenza fissa, selezionare Freq single. / Time (SFT) e scegliere la frequenza di misurazione dal menu a discesa.
   2. Per la misura della copertura degli elettrodi e modellazione di Rb e Alpha, selezionare Multipli Freq. / Time (MFT). Il dispositivo ECIS misurerà automaticamente a tutte le frequenze disponibili.
   3. Per i micromovimenti (vedi analisi dei dati) selezionare Rapid Tempo Collect (RTC) e regolare la frequenza di misurazione e frequenza di campionamento. Qui la risoluzione temporale standard è un campione al secondo (1 Hz), ma la frequenza di campionamento può essere aumentato anche per monitorare i cambiamenti rapidi di impedenza fino a 25 Hz (per la Z-Theta). Nota importante: in modalità RTC viene misurata solo un singolo pozzo.
      NOTA: Se il bisogno micromovimenti essere misurata in diversi pozzi, successivamente, andare a Aiuto> Articoli Mostra barra degli strumenti esperto di menu /> Acquire> Multi-Well RTC. Specificare il limite di tempo (ore) nella sezione Dati Collect, la ECIS ora misurare i pozzetti selezionati in ordine numerico. Dopo aver avviato la misurazione il software chiederà di specificare il numero di cicli. Inserire il valore per la frequenza con la misura deve essere ripetuta.
6. Per SFT e MFT, selezionare l'intervallo di tempo (sec) tra le misure o se hanno bisogno di dati da acquisire più velocemente possibile lasciare questa opzione deselezionata.
   NOTA: Per acquisire i dati del dispositivo ECIS utilizza un multiplexer di passare da un bene ad un altro con un tasso di acquisizione SFT minimo di 0,25 sec e 7,5 sec per MFT. Cioè l'intervallo dipende dal numero di pozzi e frequenze selezionate. Per misure su cellule proliferanti lente o un semplice registrazione di resistenza in funzione del tempo, utilizzare intervalli di 600 sec.
7. Premere Start, assegnare un nome al file e selezionare la posizione per memorizzare i dati.
   NOTA: Il formato del file non deve essere un problem, poiché i dati ECIS vengono salvati in una sorta di formato di testo normale chiamata *. ABP, che non supera mai diverse centinaia di MB, anche con tutte le frequenze di misura ed il numero di pozzetti selezionati.
8. Smettere di correre premendo il tasto Finish.

4. Cambia medio e manipolazione cellulare

1. Press Pause, questo si fermerà l'acquisizione dei dati, ma continua a funzionare l'orologio sperimentale.
2. Rimuovere la matrice dal supporto e manipolare sotto un banco a flusso laminare (cioè il cambiamento medio).
3. Mettere matrice nel supporto e fare clic Controllare la connessione o Riprendi Esperimento di continuare l'acquisizione dei dati. Il software di misura sarà posto un segno volta nel set di dati.

5. La stimolazione acuta durante Acquisizione Dati

NOTA: Una seconda opzione è quella di manipolare le cellule durante l'acquisizione dei dati per seguire cambiamenti immediati. Questo è possibile solo; Quando campioni non deve essere sterile nell'ulteriore corso dell'esperimento.

1. Aggiungere lo stimolo direttamente al bene e fare in modo di mescolare attento con un microlitri pipetta 200.
2. Punto Mark ora manualmente premendo Marco e aggiungere un commento.

6. Offensiva elettrica

NOTA: Trovare le impostazioni corrette per il tipo di cellulare utilizzato è fondamentale per ferimento elettrica. Se ferendo è troppo breve, questo può comportare la rimozione insufficiente di cellule, mentre se ferimento è troppo lungo e / o di massima questo può danneggiare gli elettrodi (in particolare sulle matrici trasparenti). Pertanto, si raccomanda diversi impulsi di breve ferimento. Per le colture HUVEC due 10-20 sec lungo ferimento impulsi di 5 V a 60 kHz ciascuno sono stati trovati ottimale utilizzando la ECIS 1600R. In generale, si raccomanda di utilizzare alte frequenze> 20 kHz a mantenere alti campi uniformi attraverso le cellule e per evitare danni agli elettrodi.

1. Eseguire ferendo durzione una misurazione ECIS attiva.
2. Abilita Wound / Setup elettroporazione, quindi fare clic su Ferita e compilare il tempo (sec), la tensione della ferita (V per 1.600 R) o in corrente (μA per Z e Z-Theta) e frequenza (Hz). I valori predefiniti visualizzati sono basati sul tipo di matrice e il dispositivo ECIS.
3. Selezionare i pozzetti per ferire nella sezione "Be Configurazione". Verranno feriti i pozzi controllati.
4. Ritardo Abilita Fino Hour e compilare il tempo di ritardo per attivare la funzione di ritardo ferita. Questa funzione può essere interrotta in qualsiasi momento premendo Stop o applicare manualmente una ferita. Un solo comando di ritardo può essere attivo alla volta.
5. Premere Attiva e clicca su OK nella finestra pop-up per avviare ferire.
6. Assicurarsi che il segnale di resistenza scende al di impedenza compensazione dopo il ferimento, altrimenti ripetere il ferimento.

7. Analisi dei dati

Rappresentazione dei dati e l'esportazione.

1. Misurazione Fine o caricare dati impostata tramite File -> Apri.
2. Selezionare i pozzetti da visualizzare dalla finestra "Bene Configuration". Individuali Group pozzi per presentare alla media.
3. Parametro da visualizzare nella barra degli strumenti superiore (Z, R o C) ha scelto.
4. Selezionare il tipo di grafico dalla barra degli strumenti superiore (T = tempo, F = frequenza, 3D = Cascata macchia).
5. Definire compensare grafico e gamma con i cursori sotto la finestra del grafico o riempire i valori esatti nei controlli adiacenti.
6. Scegli tra le "Opzioni Time-Series" di base nella sezione "Analizza" per eseguire la deviazione standard, in esecuzione media o normalizzazione dei dati.
7. Attiva Expert Toolbar nel menu Aiuto per le operazioni più avanzate come Nyuist trama e trasformazione di Fourier.
8. Utilizzare "Opzioni di visualizzazione" nella sezione "Analizza" per definire raESN di y assi x-e ed esportazione grafico.
9. Esporta i dati selezionati in un file Excel tramite File -> Esporta dati -> To Excel (selezionato) e utilizzare un software di terze parti di scelta per approfondimenti, le statistiche e la rappresentanza, se necessario.

Modellazione di Rb e Alpha.
NOTA: Per la modellazione si consiglia di utilizzare un cell-free, mezzo pieno e come riferimento.

1. Misurazione Fine MFT o il carico set di dati MFT.
2. Se un riferimento ben cell-free è disponibile, premere sia Trova per selezionare automaticamente il valore di riferimento o Imposta per selezionare il punto di tempo libero delle cellule manualmente da "Freq. Modellazione Scan" nella sezione "Analisi".
3. Se non vi è alcun riferimento privo di cellule, importare un valore di riferimento da un altro set di dati. Aprire il set di dati di riferimento (assicurarsi che è stato usato lo stesso array e medie) e utilizzare la funzione Trova o Imposta per selezionare il valore di riferimento.Quindi passare ai dati misurati e premere il tasto Get.
4. Se non ci sono cell-free di dati di riferimento fissati uso disponibile l'impostazione di fabbrica.
5. Premere Model per avviare i calcoli. Modellazione può richiedere alcuni minuti dipendenti dalla dimensione del set di dati.

Calcolo dei micromovimenti.
NOTA: Questo calcolo non è parte del software di misura, ma può essere eseguita con qualsiasi software di elaborazione del segnale.

1. Termina misurazione RTC o caricare set di dati RTC.
2. Normalizzare dati impostati dalla resistenza media di tutto il periodo.
3. Rompere set di dati in segmenti con una lunghezza di 256 punti di dati e pulire ogni segmento da una finestra Hanning.
4. Eseguire una trasformazione di Fourier a 256 punti e la media risultante spettri di frequenza ad uno spettro di potenza single-sided 129-punto per minimizzare il rumore casuale e potenziato il segnale biologico.
5. Frequenza complotto contro di ampiezza in un grafico log-log e applicarealmeno in forma lineare quadrato.
6. La pendenza della regressione lineare è una misura del rumore complessivo nel segnale e quindi micromovimenti delle cellule.

Representative Results

Impostazione di un esperimento è abbastanza semplice e la misura stessa è completamente automatico, ma, come spesso accade, l'analisi e l'interpretazione dei dati corretti sono cruciali. Nella sezione dati rappresentante una guida è previsto per l'interpretazione dei parametri più importanti forniti mediante spettroscopia di impedenza con ECIS. Questo sarà utile per decidere per quale tipo di problema scientifico una misura ECIS può essere utile e quali parametri devono essere registrati.

Un tipico sperimentale read-out può essere generalmente divisa in crescita fase dopo l'inoculazione cellulare e un plateau fase quando le cellule raggiungono confluenza. Ciascuna di queste fasi cede informazioni sulle diverse proprietà cellulari. Una misurazione rappresentativo è mostrato in Figura 2 e diviso in quattro sottofasi di analizzare A) adesione cellulare, diffusione e proliferazione; B) formazione di una barriera maturazione CE; C) la migrazione delle cellule dopo la generazione di un elettricoAl ferita e D), la risposta cellulare alla stimolazione con trombina agente vasoattivo. Immagini a contrasto di fase e di immunofluorescenza sono stati acquisiti direttamente dall'elettrodo di misura durante le diverse sottofasi per illustrare il collegamento tra la copertura elettrodo, lo stato della cella, e impedenza segnale registrato.

Adesione, la diffusione e la proliferazione

Ogni tipo di cellula ha la sua curva caratteristica di adesione e la crescita che può essere manipolata variando densità di semina, rivestimento con proteine ​​della matrice extracellulare o altri stimoli. Una delle maggiori difficoltà per studiare tali processi è quello di distinguere tra adesione, diffusione e proliferazione. Wegener et al ^11. Ha dato una descrizione dettagliata per l'utilizzo di una combinazione di resistenza e capacità di distinguere tra questi parametri e nella figura 3 appare evidente come resistenza e capacità possono completarsi a vicenda. E 'importante perlo studio di adesione e diffusione di comprendere l'influenza la frequenza di misurazione, perché qui il campo elettrico provoca una polarizzazione della membrana cellulare delle cellule in sospensione ^8, che forza il passaggio della corrente esclusivamente intorno alle cellule. Quando le cellule si attaccano cominciano a limitare il flusso di corrente attraverso la diffusione negli elettrodi e capacità diminuisce in modo lineare con la percentuale di area aperta sull'elettrodo (area frazionaria). Quindi, l'adesione, la diffusione e la proliferazione possono essere quantificati meglio, quando si registra capacità ad una frequenza superiore a 40 kHz (Figura 3B), dove la diminuzione di capacità è proporzionale alla copertura dell'elettrodo. In alternativa resistenza alla frequenza di misurazione più sensibile è una misura diretta per la differenziazione e la maturazione delle cellule in una barriera confluenti (Figura 3A). Oltre alla zona frazionaria, Wegener et al. Illustra due diversiparametri per quantificare l'adesione e la copertura elettrodo: t _1/2 (capacitanza metà del massimo), che è il tempo fino al 50% dell'elettrodo è ricoperta da cellule (Figura 3B, inserzione), e la pendenza della curva di capacità (s, non mostrato) come il tasso di diffusione e proliferazione cellulare.

Resistenza come misura della qualità barriera

La resistenza è la parte di impedenza che descrive qualità e la funzione barriera migliore, perché trascura componenti capacitivi dalla membrana, elettrodo e medie. Qui viene usato il termine qualità barriera e non permeabilità, poiché permeabilità è per definizione dipende solo contatti cellula-cellula. Resistenza tuttavia è determinata dalla capacità delle cellule e le loro interazioni cellula-cellula e cellula-matrice di bloccare il flusso di corrente. Di conseguenza diversi tipi di cellule (cloni e passaggi) hanno i loro valori di resistenza specifici (Figura 4A). Sebbene resistenza consente un più Clearer idea sulla barriera cella, il segnale impedenza deve essere preso in considerazione.

Modellazione di Rb e Alpha

Il software ECIS nutre una particolare funzione, la possibilità di modellare due parametri, che distinguono tra cellula-cellula e cellula-matrice aderenze (figure 4B e 4 C). Rb (in cm x ² ohm), è la resistività dei contatti cellula-cellula al flusso di corrente e quindi una misura inversa della permeabilità classica. Alta Rb implica bassa permeabilità verso il flusso di corrente. Alpha (in cm x ^0,5 ohm), è una misura per i contributi impedenza derivanti dalle giunzioni cellula-elettrodo. Il modello per quantificare cellula-cellula e cellula-matrice contatti è stato introdotto 1991 da Giaever e Keese e si basa sul presupposto che le cellule sono circolari, oggetti discoidali che hanno una membrana isolante, Passa sopra l'elettrodo e sono pieni di condurre elettrolita ² . IlIl potere isolante della membrana cellulare lascia solo tre vie per la corrente: a) tra la superficie ventrale delle cellule e elettrodo, b) tra i contatti cellula-cellula e c) attraverso le cellule (probabile solo quando viene utilizzato un elevata frequenza di misura ). Una derivazione più dettagliate e spiegazioni possono essere trovati nelle carte di Lo et al ^3,12.

Micromotion

E 'stato dimostrato che piccole fluttuazioni nel segnale resistenza (Figura 4A) sono causa di sottili movimenti delle cellule casuali, in strati di cellule confluenti così come le cellule si spostano e disattivare l'elettrodo in culture sparse ^2. Questo aspetto della ECIS dati in tempo portate descritte da Lo e Opp et al. ^13,14 è spesso sottovalutato e vede meglio quando si misura con i 1E matrici e alla frequenza più sensibile per spiegare attuali percorsi subcellulare-para e. Il calcolo di questa cella causato rumore (micromovimenti) non è parte del secoloe software di misura standard, anche se nella nuova versione è integrata Fast Fourier Transformation (FFT). Registrazione dati RTC con una frequenza di campionamento di 1 Hz per 1 ora a 4 kHz fornisce una risoluzione sufficiente per il calcolo di micromovimenti CE. Questo calcolo fornisce un singolo valore e può essere utilizzato direttamente per l'analisi statistica. Una discussione estesa sull'uso di analisi in frequenza per micromovimenti può essere trovato altrove ^15. In alternativa a FFT altre strategie di analisi possono essere utilizzati, come varianza degli incrementi. La varianza è più sensibile a piccole variazioni di micromovimenti, ma a causa di questa sensibilità del confronto dei singoli esperimenti diventa difficile. Le piste dello spettro di potenza sono una misura più robusta di micromovimenti (Figura 4D). Qui l'area sotto la curva può essere visto come la quantità di micromovimenti o rumore cellule creano. Quindi, maggiore è la pendenza dello spettro di potenza minore è l'area sotto la curvae minore è la micromovimenti.

Elettrico test guarigione delle ferite

Per studiare la migrazione delle cellule, le ferite di solito meccaniche sono applicati da graffi cellule dalla piastra di coltura con punte per pipette, raschietti cellulari o francobolli specifici e seguire la loro remigration microscopicamente ^16. Questo metodo ha lo svantaggio evidente che le dimensioni del graffio varia e di solito è troppo grande per trascurare l'influenza della proliferazione cellulare sul processo di guarigione delle ferite. La funzione ferendo della ECIS utilizza una tensione elevata, impulso ad alta frequenza per ottenere un elettrodo acellulare e successivamente segue remigration di cellule vicine per sostituire le cellule morte (Figura 5A). Un vantaggio di questo metodo automatizzato su standard di manodopera saggi scratch è che la ECIS produce una ferita altamente riproducibile con un preciso diametro di 250 micron, che chiude in poche ore, per studiare la migrazione puro. Inoltre, l'impulso elettrico does Non rimuovere il rivestimento proteico e matrice extracellulare secreta. Partendo dal presupposto che le cellule remigrate sull'elettrodo da tutti i lati, il tasso di migrazione può essere facilmente calcolato dividendo raggio avvolto da tempo necessario per la chiusura della ferita ^17. In alternativa al ferimento elettrico, recentemente è stato introdotto il cosiddetto metodo recinto elettrico (non mostrato). Qui elevati impulsi di corrente prevenire la fissazione e la migrazione delle cellule sugli elettrodi dopo l'inoculazione. Le cellule cresceranno intorno all'elettrodo di misura e avviare la migrazione verso l'interno appena gli impulsi elettrici sono spenti. Il vantaggio della recinzione elettrica sopra il ferimento elettrica è che la superficie dell'elettrodo non è stato alterato dalla crescita cellulare o la rimozione delle cellule, che è importante misurare influenze di diversi rivestimenti su migrazione cellulare.

Stimolazione cellulare

Oltre allo studio della migrazione cellulare, spettroscopia di impedenza è perfettamente adatto permisurare gli effetti dei farmaci e tossine sulle cellule. Figura 5B presenta un esperimento di stimolazione / inibizione classica, in cui la trombina è stato usato per indurre iper-permeabilità nel confluente barriera CE per contrazione e gap formazione di cellule, che si manifesta come una riduzione transitoria della resistenza . Dalla preincubazione con l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 più della risposta trombina viene ridotto mediante abbassamento della tensione basocellulare ¹⁸ e bloccando formazione di fibre di stress ^19. Poi la chinasi Rho bloccante è stato usato a tempi diversi dopo aggiunta di trombina, che porta ad un recupero immediato e totale della barriera CE. Qui il vantaggio di un sistema di misurazione continua dell'impedenza per studiare le risposte cellulari acute diventa evidente. In saggi endpoint regolari (ad esempio colorazione immunofluorescenza o passaggio macromolecola), questa risposta acuta allo bloccante utilizzato sarebbe molto difficile se non impossibile da rilevare e quantificare. Importante da notare è che con imisurazioni mpedance la permeabilità verso ioni è descritto e non verso macromolecole. Si prega di fare riferimento al Aman et al. ^20, dove è previsto un ottimo confronto tra le misure ECIS e gli esperimenti di passaggio macromolecola.

Figura 2. Misurazione rappresentativa. MVEC sono state coltivate su una gelatina rivestite array 8W1E a bassa densità di semina di 5.000 cellule / cm ² e la registrazione MFT è stata effettuata più di 10 giorni. La misurazione illustra le diverse letture dei un esperimento ECIS: A) adesione, diffusione e proliferazione; B) formazione e la maturazione di una barriera cellula confluente; C) guarigione della ferita dopo l'applicazione di una ferita elettrica; D) la stimolazione con il vasoattivo trombina agente. Le due frecce indicano medio rinfresco, che sono stati eseguiti in intervalli di 4 giorni e danno un'idea della sensibilità delle misurazioni verso stimoli meccanici e variazioni di temperatura e di pH. Le immagini nel pannello superiore corrispondono alla misurazione e sono stati acquisiti direttamente dall'elettrodo di misura. L'immagine a contrasto di fase a sinistra mostra le cellule endoteliali 24 ore dopo l'inoculo, iniziando a coprire l'elettrodo. Le immagini di immunofluorescenza del centro e sulla destra attuale colorazione F-actina dello strato endoteliale confluenti prima e dopo stimolazione con trombina (1 U / ml). Trombina causa contrazione di cellule endoteliali mediante formazione di stress fibers cosiddetti e l'apertura transitoria di lacune inter-endoteliali (frecce ed inserti di immagine), riconoscibili nel segnale ECIS da una caduta di resistenza al basale. Qui la sensibilità della misura diventa evidente e come cambiamenti nel livello di cella correlata al segnale di impedenza.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Attaccamento cellulare e la crescita. MVEC dallo stesso donatore sono stati seminati con tre diverse densità sulla gelatina rivestita array 8W10E e crescita cellulare è stata registrata a frequenze multiple per 60 hr. A) I valori di resistenza per le tre condizioni al loro frequenza ottimale di 4 kHz per misurare formazione di barriera. Tutte e tre le densità di semina stabilito una barriera confluente di ca. 1.200 Ω al termine della misura,. Tassi di proliferazione comunque (pendenze delle curve) si differenziano nettamente B) Misura di capacità a 64 kHz fornisce approfondimenti sulla adesione e la diffusione. L'adesione è l'initial fase di plateau nella curva di capacità (tra 2-8 ore). Diffusione, che è in relazione lineare alla copertura dell'elettrodo, è rappresentato dalla pendenza della curva e si completa dopo 10-30 ore a seconda della densità di semina. Il tempo punto t _1/2 (copertura metà massima) può essere utilizzato per l'analisi statistica. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Caratterizzazione della barriera confluente. Due donatori MVEC con diversi numeri di passaggio (passaggio 3 e 6) sono state seminate su gelatina rivestita array 8W1E e una misurazione MFT è stata eseguita per 30 h per caratterizzare la barriera CE. A) Resistenza misurazioni rivelano che il donatore più giovane 1 ha una resistenza maggiore di ca. 11.000 Ω rispetto al ca. 7.500 Ω del donatore più anziano 2. AC) Le funzionalità di modellazione della ECIS sono stati utilizzati per individuare la causa del minore resistenza. Modeling rivelato un comparabile interazioni cellula-cellula e Rb indicata una interazione cellula-matrice indebolito Alpha come possibile causa. D) RTC è stata eseguita per quantificare micromovimenti all'interno dello strato di cellule confluenti da trasformazione di Fourier, in cui l'area sotto la curva è proporzionale micromovimenti . Le analisi degli spettri mostra meno micromovimenti del donatore più anziano 2 e, quindi, sostenere quello che può già essere assunto dal segnale di resistenza (meno varianza). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. La migrazione cellulare dopo ferimento elettrica e gli effetti della stimolazione trombina. Registrazioni impedenza sono stati eseguiti a 4 kHz con una risoluzione temporale massima. A) MVEC donatore 1 è stato utilizzato nel passaggio 3 e donatore 2 in passaggio 6 su gelatina rivestita array 8W1E e cresciuto a confluenza. Poi una ferita elettrica è stata creata mediante l'applicazione di due impulsi 5 V a 60 kHz con una durata di 20 secondi ciascuno. Il donatore più giovane 1 ha mostrato una migliore capacità di guarigione della ferita in base a una più rapida chiusura della ferita (migrazione, pendenze delle curve) e una maggiore resistenza dopo ferendo rispetto al donatore di età superiore 2. B) HUVEC sono state fatte crescere su gelatina rivestita array 8W10E. Su confluenza le cellule sono state affamate di siero per 1,5 hr sostituendo il terreno di coltura completo di mezzo di base più 1% di albumina sierica umana (HSA). Noietà media pianura con HSA è una fase critica, poiché i componenti del siero bloccano la risposta trombina. Non appena un plateau resistenza stabile è stato rilevato, la trombina è stata aggiunta direttamente ad ogni pozzetto e miscelato accuratamente con una pipetta 200 microlitri. L'effetto massimo trombina è visibile dopo 30 min, caratterizzata da una riduzione transitoria della resistenza al basale e un ca. Inferiori del 30-50% di resistenza dopo il recupero. Le cellule sono state pre-incubate sia con il Rho chinasi bloccante Y-27632 per 30 minuti o il blocco sono stati aggiunti 20, 30, o 40 minuti dopo trombina, inoltre, che diminuisce l'effetto della trombina immediatamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .

Discussion

ECIS è un ottimo strumento per lo screening di proprietà e il comportamento delle cellule, nonché per la quantificazione degli effetti di sostanze note e sconosciute. In tal modo le cellule sono tenuti in condizioni di coltura standard, impedenza può essere continuamente monitorato con un'alta risoluzione temporale e correlata a segnali ottici. In questo modo il punto di tempo ottimale per manipolazioni cellulari può essere scelto sulla base dello stato di cella morfologica e funzionale. Purtroppo, questo ad alta risoluzione misura viene fornito con il prezzo che piccole variazioni di temperatura, pH o la stimolazione meccanica delle cellule (medium cambia) influenzeranno il segnale di impedenza immediatamente.

L'applicazione della piccola corrente di misura per le cellule rende la misura ECIS non invasiva, non distruttiva, e senza etichetta, ma come risultato solo le proprietà bioelettriche passiva può essere misurata (nessun potenziale d'azione). Una caratteristica fondamentale è che un certo numero di parametri può essere der ived da una singola misura, combinando le informazioni provenienti da diversi saggi classici, come la permeabilità o saggi di guarigione della ferita. Qui il particolare aspetto interessante è che i dati matematicamente modellati possono essere usati per esplorare variazioni di resistenza e capacità e indirizzarli a strutture cellulari distinti (ad esempio cellule-contatti o membrana cellulare). È importante rilevare che la spettroscopia di impedenza fornisce sempre un segnale mediato da tutte le celle sul elettrodo di rilevamento, che non consente per studi su singole cellule e anche il modello matematico è valido solo in strati di cellule confluenti. Pertanto cellule endoteliali devono essere tenute in stato confluente per almeno un giorno prima utilizzata per la modellazione di garantire maturi cell-adesioni e cellule quiescenti. Allo stesso modo, le ferite elettrici devono essere applicati solo a confluenti strati di cellule con impulsi multipli ferimento brevi con alte frequenze, per ottenere la massima efficienza ferite e prevenire i danni degli elettrodi.

jove_content "> Per ottenere la massima quantità di informazioni da una misurazione ECIS, come in ogni saggio, diversi parametri quali la combinazione di substrato matrice, rivestimento e densità di semina per il tipo singola cella devono essere testati e ottimizzati prima un esperimento.

Una limitazione importante di ECIS è che la misura non fornisce informazioni dirette a livello molecolare. Così misurazioni ICE sono generalmente più informativo all'inizio di una serie sperimentale per aiutare associare un problema scientifico con strutture o proprietà cellulari e fornire dati importanti per la generazione di una ipotesi testabile. Pertanto, il design modulare di ECIS offre una vasta gamma di applicazioni, con la possibilità per il su misura array. Gli sviluppi più recenti di matrice indicano un futuro focus su proiezioni impedenza ad alto rendimento per la proliferazione cellulare e il ferimento elettrica e l'avanzata di array di flusso speciali per la simulazione in vivo

Ulteriore letteratura
Si prega di fare riferimento anche alla pagina web di Biofisica Applicata (www.biophysics.com) per le note applicative, webinar e un elenco dettagliato delle pubblicazioni che coprono l'intero spettro ECIS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Bovine Thrombin	Merck Millipore	604980
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Pen/Strep	Lonza	17-602E