Introduction
En este protocolo, se describen los métodos eficaces para inhibir genes en líneas celulares de macrófagos de ratón utilizando siRNAs y controlar los efectos de estos tratamientos en la respuesta inmune innata. Estos procedimientos se realizan en formato de 96 pocillos, lo que permite pantallas de RNAi en la moda de mediano o alto rendimiento.
En respuesta a la infección, los seres humanos montar una respuesta inmune innata inmediata y una respuesta inmune adaptativa más lento pero más específico. Esta rápida respuesta inmune innata implica el reclutamiento y la activación de las células inmunes innatas fagocíticas incluyendo macrófagos 1. Macrófagos activados Clásicamente están implicados en las respuestas inflamatorias agudas y producen proteínas antimicrobianas y compuestos, citocinas y quimiocinas, y presentar antígenos 2,3. Macrófagos alternativamente activados desempeñan un papel en la regulación de la inmunidad, el mantenimiento de la tolerancia, la reparación de tejidos, la curación de heridas y 4-8. Debido a su amplia gama de funciones, Los macrófagos pueden desempeñar un papel en numerosas enfermedades, incluyendo la aterosclerosis, artritis, y cáncer 9. Así, el estudio de los macrófagos ha sido un área clave de la investigación durante algún tiempo en una amplia variedad de campos de la enfermedad.
A pesar de su importancia en la respuesta inmune innata, los macrófagos pueden ser un reto para trabajar con células. En particular, es difícil obtener la transfección eficiente utilizando reactivos de lípidos en los macrófagos sin toxicidad asociada 10,11. Además, incluso cuando siRNA se entrega de manera eficiente a los macrófagos, la robustez del gen inducida por RNAi desmontables a menudo puede ser bastante moderado y puede variar de un gen a gen.
Para superar estos desafíos técnicos, hemos optimizado la transfección y técnicas de derribo 12-16 en dos líneas celulares de macrófagos de ratón, RAW264.7 17 y 18 J774A.1. Este enfoque utiliza el sistema de traslado de 96 pocillos Amaxa Nucleofector para la transfección; este sistemautiliza una combinación de reactivos especializados y electroporación para transfectar células en formato de 96 pocillos 19. Después de la transfección, se describen los métodos para maximizar la recuperación celular y la viabilidad y para maximizar la posterior caída de genes inducida por siRNA. Para ilustrar la utilidad de este enfoque, se describe un protocolo para la entrega siRNA a estas líneas celulares de macrófagos, estimular estas células con lipopolisacárido (LPS), y controlar la respuesta inmune innata en el nivel de producción de varias citocinas pro-inflamatorias. Proporcionamos datos de la muestra en la que se dirigen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR), cuyos miembros detectar LPS y otros patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs), para regular la inmunidad innata.
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Protocol
1. Mantenimiento de líneas celulares de macrófagos
- Crecer RAW264.7 y líneas de células J774A.1 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ºC en presencia de 5% de CO 2. Para ayudar a mantener la esterilidad, añadir 1% de penicilina / estreptomicina (pen / strep) a los medios de comunicación (aunque esto no es estrictamente necesario).
- Paso crítico: Asegúrese de que los macrófagos están creciendo en un estado saludable para la transfección eficiente y inducida por siRNA desmontables de genes. Utilice células entre pasajes 3 y 10 después de la descongelación fresco, ya que estas líneas de macrófagos exhiben la mejor eficiencia de transfección y mantienen robustas de supervivencia después de la transfección en esta etapa; no utilice un número de pases más alto (> 20), como la eficacia de transfección de genes y Derribo tanto disminuyen grandemente.
- Para optimizado transfección siRNA, células de la placa a 20% de confluencia y crecen uno o dos días hasta que las células alcanzan no más de 80% de confluencia. Células Overgrown no transfectar eficiently.
2. Programación del Sistema de traslado de 96 pocillos para la transfección
- Inicie el software de enlace de 96 pozos en el ordenador conectado a la lanzadera. Seleccione el nuevo archivo de parámetros en el menú archivo de la parte superior izquierda.
- Destacar los pozos que se transfectaron en la que se muestra de 96 pocillos esquemática placa. Un cuadro verde indica que los pozos sean seleccionados.
- Seleccione el programa que corresponde a la línea celular de macrófagos que se utiliza (DS-136 para RAW264.7 o DS-130 para J774A.1) y seleccione Aplicar, situado por debajo de la placa de 96 pocillos diagramada. Tenga en cuenta que después de seleccionar un programa, los pocillos de la placa esquemática serán de color azul oscuro. Círculos vacíos indican pozos que no han sido asignados un programa y no ser sorprendido.
3. Preparación de los reactivos para la transfección
- Preparar la solución Nucleofector ™ trabaja mezclando línea celular SF 96 bien-solución Nucleofector ™con todo el contenido del tubo suplemento cerrado. Dejar que los reactivos mezclados se equilibren a temperatura ambiente antes de su uso. Almacenar el exceso de solución completa Nucleofector ™ a 4 ºC hasta por 3 meses para un uso futuro.
- Pre-caliente la solución salina DMEM, RPMI-1640, 0,25% de tripsina / EDTA, y fosfato tamponada con (PBS) a 37 ºC antes de la preparación de los macrófagos para la transfección.
- Prepare el siRNA para la transfección por descongelar en hielo. Con el fin de minimizar el número de deshielo de congelación del siRNA, congelar en alícuotas nuevas siRNAs la primera vez que se utilizan.
- En los experimentos iniciales, utilice siRNA a una dosis relativamente alta de 2 M (diluido desde 01:10 20 mM acciones). Posteriormente se valora siRNAs que inducen gen robusta desmontables a dosis más bajas, aunque se necesitan dosis más altas típicamente para una eficiente desmontables génica en macrófagos en comparación con otros tipos de células.
NOTA: Los siRNAs están disponibles de muchas fuentes; bastante robusto caída gen se puede obtenerutilizando SmartPools siGenome, que son grupos de cuatro siRNAs dirigidos a cada gen. Como control negativo, utilice cualquiera de varias piscinas no de metas de siRNA o siRNAs. - Para monitorear la eficiencia de transfección, transfectar o bien el plásmido pmaxGFP control (proporcionado en los kits de Amaxa) o siRNAs marcados con fluorescencia en paralelo a los siRNAs experimentales. Esperar 30-50% de la transfección del plásmido GFP (ensayada por microscopía o citometría de flujo el día después de la transfección) y> 99% de la transfección de ARNsi marcado con fluorescencia (ensayada mediante citometría de flujo inmediatamente después de la transfección y recuperación).
4. Preparación de los macrófagos para la transfección
- Separe los macrófagos adherentes de las placas de cultivo de células por tripsinización. Aspirar los medios de comunicación y se lavan las células dos veces con 10 ml de PBS. Después de retirar el PBS, incubar las células con pre-calentado 0,25% de tripsina / EDTA (1 ml / placa de 10 cm) durante 1-2 minutos hasta que las células comienzan a desprenderse. Golpear suavemente la placa y mover el Solución durante la incubación para maximizar la tripsinización.
- Después de la incubación, añadir 9 ml de medio DMEM + FBS, mezclar suavemente hacia arriba y hacia abajo, y recoger las células por pipeteo en un tubo estéril.
- Cuente el número de macrófagos aislados utilizando un hemocitómetro. Esperar aproximadamente 10 millones de macrófagos por placa de 10 cm. Calcular el número total de macrófagos necesarios; cada pocillo en el transbordador de 96 pocillos requiere 200.000 células. Recuerde que debe añadir el valor de las células de algunos pozos adicionales "para permitir que las pérdidas de pipeteo.
- Pipetear el número calculado de las células en un tubo de centrífuga. Centrifugar las células durante 10 min a 150 xg a temperatura ambiente. No centrifugar demasiado rápido ya que esto disminuirá la salud de los macrófagos y la eficacia de transfección.
5. Nucleofection de macrófagos con siRNA
- Usando una placa de 96 pocillos de fondo redondo estéril (que facilita la mezcla y reducir al mínimo la pérdida de reactivo), añadir 2 l de cada siRNA a cada pocillo para ser transfeja.
Nota: Dependiendo del número de siRNAs, esto puede llevarse a cabo durante la etapa de centrifugación de macrófagos. - Aspirar el medio de las células centrifugadas. Resuspender suavemente las células en solución Nucleofector ™ SF (que contiene la solución de suplemento), utilizando 20 l por 200.000 células sedimentadas. Una vez resuspendido, utilizar las células inmediatamente para la transfección óptima.
- Transferencia de células resuspendidas en un canal estéril; utilizando una pipeta multicanal, la transferencia de 20 l de la mezcla de células resuspendido en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene la siRNAs. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo.
- Transferencia de 20 l de la mezcla de células / siRNA en la placa de 96 pocillos Nucleocuvette ™ paso crítico:. A evitar la generación de burbujas durante la etapa de transferencia, ya que esto puede inducir a errores durante Nucleofection.
- Después de colocar todas las muestras experimentales en la placa de la transfección, cubrir la placa de 96 pocillos con la tapa proporcionada y very toque suavemente sobre una superficie dura para eliminar las burbujas de las muestras.
- Coloque la placa de 96 pocillos con tapa en el 96 pocillos de transporte Nucleofector y seleccione "cargar y comenzar 'en la parte inferior derecha de la pantalla del programa. Antes de Nucleofection, siga la línea de programa para guardar los resultados.
Nota: Durante el proceso de Nucleofection, pozos transfectadas con éxito serán representados en el 96 pocillos esquemática en la pantalla por un círculo verde con un signo más. Un círculo rojo con signos menos indica un error, muy probablemente debido a las burbujas o mis-pipeteado el volumen correcto de los reactivos.
6. Recuperación y galjanoplastia de macrófagos
- Inmediatamente después de Nucleofection, usando una pipeta multicanal, añadir 80 l de precalentado (37 ºC) RMP1-1640 medios de comunicación a cada pocillo. Añadir los medios de comunicación a un lado de cada pocillo, permitiendo que los medios se mezclan lentamente con las células transfectadas, que son muy delicada en esta etapa. No agregue los medios de comunicación demasiado rápido, ya que estodisminuir en gran medida la viabilidad.
- Colocar las placas de 96 pocillos con muestras transfectadas y RPMI-1640 en una incubadora a 37 ºC con 5% de CO2 durante 2 min; esto es fundamental para permitir que las células se recuperen antes de la manipulación adicional.
- Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y transferir cuidadosamente la mezcla de cada pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos usando una pipeta multicanal.
- Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de precalentado (37 ºC) medio DMEM + FBS a cada pocillo.
- Incubar la placa de cultivo tisular de 96 pocillos con las muestras en un incubador de 37 ºC con 5% de CO 2 durante 24-36 hr (optimizar el tiempo exacto para siRNAs individuales, aunque este intervalo de tiempo generalmente funciona bien).
7. estimulación de los macrófagos con LPS
- Tras el 24-36 horas después de la Nucleofection incubación, preparar LPS (u otros PAMP) en medio fresco. Preparar suficiente medio fresco para todos los pozos (200 l mEDIA / pocillo de la placa de 96 pocillos, más un poco más por pipeteo). Diluir LPS a una concentración final de 20 ng / ml en DMEM + FBS.
- Medios de comunicación cuidadosamente aspirado de la placa de 96 pocillos y se suman los medios de comunicación fresca que contiene los LPS a las células.
- Monitorear la respuesta a LPS u otros PAMP en diversos momentos después de la estimulación. 6 hr es suficiente para generar una respuesta de citoquinas inflamatoria robusta para citoquinas tales como IL-6 o TNF.
8. Control de la Respuesta Inmune Innata inducida, Gene Derribo y viabilidad en los macrófagos
- Para monitorizar la producción de citoquinas inducida por LPS, una pipeta el sobrenadante de las células en una placa de almacenamiento de 96 pocillos. La producción de citocinas se puede medir por ELISA.
- Una vez que se retira el sobrenadante, controlar la viabilidad celular utilizando diacetato de fluoresceína (cuando se escinde por esterasas celulares en células vivas, este compuesto se convierte en fluorescente). Identificar siRNAs que se dirigen a los genes que controlan la viabilidad celular mediante la tsu enfoque. Nota: el proceso de transfección en sí debe tener poco efecto sobre la viabilidad si se realiza correctamente.
- Añadir diacetato de fluoresceína (5 mg / ml en acetona) a cada pocillo (1: 100 dilución final en PBS).
- Incubar a temperatura ambiente durante uno a cinco minutos y luego controlar la fluorescencia en las células utilizando un lector de placas (460 nm de excitación, 515 nm de emisión).
- Opcional: Para asegurarse de que la fluorescencia en los pozos es uniforme, lisan las células usando tampones tales como RIPA; esto proporciona una señal fluorescente uniforme en el pozo, como algunos lectores de placas están configuradas para supervisar sólo una pequeña porción del pozo; si las células no se siembran de manera uniforme, el diacetato de fluoresceína podría dar una lectura incorrecta.
- Como una alternativa a la vigilancia de la viabilidad celular, monitorear génica inducida siRNA-desmontables por qPCR usando ARN derivado de las células adherentes.
- Después se retira el sobrenadante de las células (paso 8.1 anterior), add tampón RLT (que se utiliza para la lisis y la preservación de RNA) directamente a las células adherentes para lisar ellos.
- Aislar ARN utilizando un kit de preparación de ARN, como el mini-kit RNeasy, y el uso de qPCR con cebadores específicos de genes para controlar gen relativa desmontables para controlar el tratamiento de siRNA. Utilice cebadores a Βactin o GAPDH para la normalización.
- Como otra alternativa para controlar otros aspectos de la respuesta inmune innata, supervisar la capacidad fagocítica de los macrófagos mediante la adición de FITC-etiquetados E. partículas coli directamente sobre las células adherentes utilizando un kit. Siguiendo el protocolo del fabricante, que tiene sólo unas pocas horas, controlar la absorción de fagocitosis utilizando un lector de placas o microscopía.
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Representative Results
Para demostrar la eficacia de la transfección usando este enfoque, que supervisó la captación de ARNsi marcado con FITC utilizando un citómetro de flujo (Figura 1).
Para ilustrar la utilidad de nuestro enfoque para el seguimiento de la respuesta inmune innata, transfectadas siRNAs dirigidos a genes reguladores inmunes innatas conocidas en la línea celular de macrófagos RAW264.7, estimulamos las células con LPS, y luego supervisó la producción de las citoquinas pro-inflamatorias IL- 6 y TNF. Diferentes TLRs reconocen diferentes PAMP, con LPS de bacterias Gram negativas reconocidos por TLR4 20, lipopéptidos, tales como PAM3CSK4 reconocidos por TLR2 21, y dsRNA de virus tales como el poli sinóptico (I: C) reconocido por TLR3 22,23. Como se muestra en la Figura 2, la inhibición de TLR4 (pero no otros TLRs utilizando siRNA) disminuye fuertemente la producción de LPS inducido por IL-6 y TNF. Por otra parte, la inhibición de IL-6 con siRNA también disminuye IL-6 la producción mientras que no afecta la producción de TNFa (comparar el panel A a B en la Figura 2).
Figura 1: marcado con FITC siRNA se transfecta de manera eficiente en el macrófago de ratón línea celular J774A.1 utilizando los métodos descritos Inmediatamente después de la transfección, las células se lavaron varias veces, se fijaron en paraformaldehído, y se monitorizó la fluorescencia por citometría de flujo.. La figura compara células incubadas en presencia de FITC-siRNA que fueron transfectadas ya sea (curva azul) o no (curva roja).
Figura 2: La eficacia y la especificidad de siRNA en el macrófago de ratónlínea celular RAW264.7. RAW264.7 células fueron transfectadas con siRNAs las indicadas (ya sea controlar no dirigidos piscinas siRNA # 1 o 2 o siRNAs que se dirigen a TLR4, TLR3, TLR2, o IL-6 como se indica). 24 horas más tarde, las células fueron estimuladas con 20 ng / ml de LPS durante 6 h y la producción de citoquinas (IL-6 en el panel A o TNF en el panel B se monitorizó posteriormente por ELISA. Los asteriscos indican valor significativamente diferente del tratamiento de control (p <0,05 , t-test).
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Discussion
Numerosos estudios han sido publicados en los que los genes individuales han sido blanco de siRNA en macrófagos murinos. Mientras que la transfección mediada por lípidos ha sido utilizado para entregar siRNA a las líneas celulares de macrófagos sobre una base individual, estos métodos sufren de los efectos potenciales sobre la viabilidad, la caída limitada de genes, y la variabilidad del gen a gen. Para desarrollar ensayos más robustos que podrían ser utilizados para apuntar a genes de la moda de mediano o de alto rendimiento, hemos optimizado las técnicas que utilizan el sistema de transporte de 96 pocillos Amaxa nucleofector, que exhibe una mayor coherencia en caída gen y los efectos limitados sobre la viabilidad (esto más robusta sistema es más costoso que los enfoques mediadas por lípidos). Muchas variables se ensayaron con el fin de optimizar estos procedimientos. Hemos sido capaces de utilizar este sistema para entregar de manera eficiente siRNA para muchos diferentes macrófagos primarios e inmortalizado líneas celulares de macrófagos (en algunos casos esto necesitaba usar el kit de optimización Amaxa línea celular de 96 pocillos). Yon pruebas preliminares con estas diferentes líneas de macrófagos de ratón (células RAW264.7, J774A.1, y MH-S) y células primarias (tioglicolato-suscitó y la médula ósea derivada de macrófagos), encontramos que las células RAW264.7 y J774A.1 exhibió el más robusto caída génica inducida siRNA-(seguido por células primarias MH-S y, respectivamente, datos no mostrados). Como estas dos líneas celulares de macrófagos inmortalizadas se utilizan comúnmente para el estudio, hemos optimizado nuestros procedimientos de RNAi adicionalmente utilizando estas líneas.
Para monitorizar la eficacia de transfección, que o bien usamos el plásmido GFP de control en los kits Nucleofector o marcado con FITC siRNA. El plásmido GFP muestra una fuerte fluorescencia el día después de la transfección, con la eficiencia de transfección del 30-50% como se ensayó microscópicamente o por citometría de flujo (datos no mostrados). Con marcado con FITC siRNA, observamos> 99% de eficiencia de transfección como se ensayó por citometría de flujo (dsRNA transfecta mejor que ADN de plásmido). Si bien es importante que esperar a que la fluorescencia dedesarrollar cuando se utiliza el plásmido GFP, el siRNA fluorescente debe controlarse relativamente pronto después de la transfección debido a que la señal fluorescente se debilita con el tiempo.
La transfección en las condiciones descritas no tiene un impacto significativo sobre la viabilidad celular. Por lo general monitoreamos la viabilidad celular después de nuestros tratamientos de siRNA utilizando diacetato de fluoresceína. Este compuesto no es fluorescente; sin embargo, cuando se escinde por esterasas celulares en células vivas, se hace fluorescente. Además, la forma fluorescente se mantiene entonces en las células con una membrana plasmática intacta 24. Este ensayo basado en la fluorescencia es un ensayo relativamente sencillo, rápido y barato para monitorizar la viabilidad celular, aunque hay otros ensayos más sofisticados que, por ejemplo monitorean los niveles celulares de ATP.
Normalmente ensayamos nuestras células para la función inmune innata 24-36 h después de la transfección, que está en el lado temprano para RNAi en comparación con otras líneas celulares. While uno tiene que esperar a proteínas endógenas a entregar a facilitar la caída gen, uno debe equilibrar esta pérdida de siRNA con la potencia, y nos encontramos caída más robusto en estas líneas de macrófagos, a veces un poco temprano que el típico 48-72 hr que se utiliza en otra tipos de células. Aunque es preferible para monitorear los niveles de proteína por Western blot, por lo general controlar los niveles de ARNm mediante qPCR, con el objetivo de estudiar múltiples genes a la vez, para los que múltiples anticuerpos y transferencias de Western pueden no ser prácticos. Nosotros usamos LPS a la mínima dosis que maximiza la producción de citoquinas inflamatorias.
Cuando la orientación de nuevos genes con siRNA, comenzamos con la dosis relativamente alta siRNA se describe en el Protocolo y luego titule abajo siRNAs que inducen un fenotipo. Controles posteriores diseñados para evitar efectos fuera de objetivo incluyen el uso de múltiples dúplex siRNA para determinar si más de un siRNA puede inducir el mismo fenotipo, verificando gen desmontables por qPCR o Western blot, y el uso de geestudios de sobreexpresión ne para complementar el enfoque RNAi. Estos enfoques deberían permitir una rápida identificación de los genes que regulan la inmunidad innata en los macrófagos de ratón.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este artículo fue patrocinado por Lonza, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electroporation | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96-well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96-well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFα Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
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