Tredimensionelle kultur af brystepitelceller celler på en rekonstitueret basalmembran er en nyttig metode til at rekapitulere in vivo arkitektur godartet bryst, og for at differentiere den maligne fænotype fra godartede bryst fænotype. Vigtigere er det, kan dette system anvendes til at studere invasive carcinomer i andre væv.
Invasive brystcarcinomer er en gruppe af ondartede epitheltumorer kendetegnet ved invasion af tilstødende væv og tilbøjelighed til at metastaserer. Samspillet af signaler mellem kræftceller og deres mikromiljø udøver en stærk indflydelse på brystkræft vækst og biologisk adfærd 1.. Men de fleste af disse signaler fra den ekstracellulære matrix er tabt eller deres relevans understudied når celler dyrkes i todimensional kultur (2D) som et monolag. I de senere år har tredimensional (3D) kultur på en rekonstitueret basalmembran dukket op som en metode til valg at rekapitulere vævsarkitekturen af godartede og ondartede brystceller. Celler dyrket i 3D bevarer de vigtige signaler fra den ekstracellulære matrix og giver en fysiologisk relevant ex vivo systemet 2,3. Af note, er der voksende beviser for, at cellerne opfører sig anderledes, når de dyrkes i 3D i forhold til 2D 4.. 3D kultureffektivt kan bruges som et middel til at differentiere den maligne fænotype fra godartede bryst fænotype og for at understøtte den cellulære og molekylære signalering involveret 3. Et af de særlige karakteristika af godartede epitelceller er, at de er polariseret, så den apikale cytoplasma mod lumen og den basale cytoplasma hviler på basalmembranen. Denne apico-basal polaritet er tabt i invasive brystcarcinomaer, der er karakteriseret ved cellulær forvaltningsmæssigt og dannelse af anastomoserende og forgrening tubuli, der på bedste beskub infiltrerer omgivende stroma. Kan reproduceres Disse histopatologiske forskelle mellem godartede kirtel og invasiv karcinom i 3D 6,7. Brug passende udlæsning som kvantificering af enkelt runde acinare strukturer eller differential ekspression af validerede molekylære markører for celleproliferation, polaritet og apoptose i kombination med andre molekylær-og cellebiologi teknikker, 3D kultue kan give et vigtigt redskab til bedre at forstå de cellulære forandringer under malign transformation og til afgrænsning af den ansvarlige signalering.
Tredimensionelle kultur (3D) af bryst epitelceller på rekonstitueret basalmembran er en vigtig model til undersøgelse af komplekse fænotype og signalering af normalt bryst og brystkræft 2,3. Den funktionelle enhed af brystkræft er den terminale kanal luftrør enhed (TDLU), der består af en lille kanal, som forgrener sig acini. De acini er meget organiserede strukturer, der består af to cellelag, epitelceller og myoepitelcellerne, som er omgivet af en basalmembran 5. Det mest karakteristiske træk ved normale acini er cellulær polarisering, tilknytning til den underliggende basalmembran og specialiserede celle-celle-kontakter. Denne indviklede organisation er forstyrret i invasive karcinomer. De udbredte 2D kulturer, hvor cellerne dyrkes som monolag, ikke mulighed for dannelse af acini. Således er monolagskultur mangler i at tilvejebringe et system til at fange de indviklede forhold mellem epitelcelleri normal bryst og deres deregulering i brystkræft. Funktionelle monotypic epitelial kulturer af bryst celler er blevet udviklet i flere laboratorier 2,3. 3D kultur involverer væksten af bryst celler på Matrigel, som er en solubiliseret ekstrakt afledt fra Engelbreth-Holm-Swarm muse sarkomceller og er kommercielt tilgængelige. Andre 3D-substrater såsom kollagen I anvendes også. De bryst celler kan dyrkes i 3D af 3D indlejret assay, hvor cellerne dyrkes indlejret i Matrigel 2. Alternativt kan celler dyrkes ved 3D oven assay, også kaldet 3D overlay assay, som er omkostningseffektiv, da det kræver mindre volumen Matrigel og letter tidsforskydningen overvågning af kolonidannelse med fasekontrast billeddannelse og er ideel til in situ billeddannelse 2 -3. 3D oven assay er blevet anvendt til at definere sammenhængen mellem acinar fænotype og genekspressionsprofilen 7.
3D kultur kan virkningsfuldely bruges til at skelne normale og godartede celler fra invasive karcinom. Normal og godartede bryst celler danner vækst anholdt polariserede strukturer med en veldefineret lumen i centrum på Matrigel hvorimod invasive karcinom celler vokser frodigt og på bedste beskub med nogen rydning af lumen. E6/E7 udødeliggjort menneskelige brystkirtler epitelceller og MCF10A cellelinie, hvilket er et spontant udødeliggjort cellelinie isoleret fra en 36 år gammel patient med fibrocystisk ændringer, med succes er blevet brugt til at generobre godartet bryst fænotype i 3D 3,8 og har tjent som et modelsystem til at studere det onkogene og tumor suppressor funktion af flere molekyler 8,9. Disse godartede celler kan manipuleret til at manipulere genet (r) af interesse ved indførelsen af lentivirus / retrovirus. Hvis genet (r) af interesse er en tumor suppressor vil shRNA medieret knockdown føre til en malign transformation hvorimod hvis genet af interesse er et onkogen overekspression i godartede cellerskal vise en malign fænotype. I begge tilfælde acinar strukturer dannet i 3D kan fange den maligne transformation.
Godartede enkelte celler udpladet i 3D begynder at formere sig og danne runde sfæriske strukturer. Ved dag 5-8 denne sfærisk aggregat af celler vil differentiere til en omkreds polariseret lag af celler, der er i kontakt med Matrigel, og en indre masse på mindre polariserede celler, som mangler kontakt med Matrigel. I de næste 10-15 dage de indre celler begynder at dø ved apoptose danner en klar lumen. De maligne celler vil vokse på bedste beskub at miste deres polaritet. Stærkt maligne celler sædvanligvis forgrening strukturer. Disse forskelle i fænotype kan opfanges af tidsforskydningen fasekontrast billeddannelse og ved in situ immunfarvning med relevante molekylære markører. De mest almindeligt anvendte markører er alfa 6-integrinet basal polaritet markering, i kombination med spredning markør phospho-histon 3 og apoptotic markør spaltet caspase-3. Sidstnævnte er vigtigt at afgøre, om der er lumen dannelse i midten af acini, en funktion af normale og godartede bryst celler. Andre polaritet og celle-celle kontakt markører omfatter GM130, laminin, ERM, E-cadherin. Alternativt brystkræft cellelinier kan manipuleres til at manipulere genet af interesse. I dette tilfælde tilbagevenden til en mere vækst standset godartet fænotype kan anvendes som en udlæsning at skelne fra kræft fænotype.
3D kultur kan også omhyggeligt bruges til at afgrænse de signalveje, der er involveret i malign transformation 10-11. Ved hjælp af ovennævnte udlæsninger, farmakologiske hæmmere, blokerende antistoffer eller rekombinante proteiner kan bruges kan lokalisere på det molekylære signalering fører til malign transformation. Med fortsatte bestræbelser fra forskellige laboratorier, er det muligt at udvinde cellerne fra 3D til at isolere RNA og også forberede lysates for immunoblotting og immunologiskenoprecipitation. Disse strategier er beskrevet i en trinvis og detaljeret måde i protokollen.
Vi har beskrevet her den tredimensionelle kultur bryst epitelceller på en rekonstitueret basalmembran og nytten af dette system til at skelne mellem ondartet vs godartet bryst fænotype. Dette system kan også anvendes til dyrkning af forskellige celletyper fra andre glandulær væv og er blevet rapporteret at være blevet anvendt med succes til kultur prostata epitel, bronkial epitel, og thyroide epitelceller, for at nævne et par 12-14. Betydningen af 3D kultur ligger i det faktum, at det er en…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH R01 CA107469, R01 CA125577 og U01CA154224 til CG Kleer, University of Michigan Cancer Center Support.
Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |