Summary
对重组基底膜乳腺上皮细胞的三维培养是扼要重述在体内的体系结构的良性乳房,并从良性乳腺表型分化的恶性表型的有效方法。重要的是,该系统可以应用到研究浸润性癌中的其他组织中。
Abstract
乳腺浸润性癌是一组恶性上皮性肿瘤特征的侵袭邻近组织,并倾向转移的。信号癌细胞和微环境之间的相互作用发挥对乳腺癌的生长和生物学行为1强大的影响力。然而,大多数来自细胞外基质,这些信号的丢失或当细胞生长在二维培养(2D)作为单层的相关性被充分研究。近年来,三维(3D)上的重组基底膜培养已成为首选的方法扼要重述良性和恶性乳腺细胞的组织结构。在三维培养的细胞保留来自细胞外基质的重要线索,并提供一个生理相关的体外系统2,3。值得注意的是,有越来越多的证据表明细胞有不同的行为时,在3D种植相比,2D 4。三维培养可以有效地使用,以从良性乳腺表型分化的恶性表型的装置和用于支撑的细胞和分子信号传导参与3。一种良性上皮细胞的显着特点是它们被极化,使得根尖细胞质是朝向管腔和基底细胞质搁置在基底膜。这apico - 基底极性消失在乳腺浸润性癌,其特点是细胞解体和形成网状和分支小管是随意渗入周围的基质。良性腺体和浸润癌之间的这些病理的差异可以被复制在3D 6,7。使用了适当的读奏像单轮腺泡结构的定量,或差的验证分子标记物的细胞增殖,极性和凋亡与其它分子和细胞生物学技术,三维文化视角组合表达E能提供更好的理解过程中的恶性转化,并划定了负责信号的细胞变化的重要工具。
Introduction
三维上重建基底膜乳腺上皮细胞培养物(三维)是一种重要的模型系统来研究复杂的表型和正常乳腺和乳腺癌2,3的相应的信令。乳房的功能单元是终末导管小叶单元(TDLU),它由一个小导管,其分支成腺泡。腺泡是高度组织的结构中,两个层细胞,上皮细胞和肌上皮细胞,这是由基底膜5包围的组成。正常的腺泡的最显着特征是细胞极化,附着在底层基底膜和专门的细胞与细胞的接触。这个复杂的组织被破坏的浸润性癌。被广泛使用的二维培养,其中细胞生长为单层,不允许腺泡的形成。因此,该单层培养缺乏提供一个系统来捕捉上皮细胞之间的错综复杂的关系在正常乳腺和乳腺癌放松管制。乳腺癌细胞的功能性的单种培养上皮已经开发了几个实验室2,3。三维培养涉及乳腺癌细胞在基质胶,这是从Engelbreth-的Holm-群小鼠肉瘤细胞衍生的溶解提取物,并且是可商购的生长。我也喜欢用其他的胶原基质的3D。乳腺细胞可以通过3D嵌入式测定法,其中细胞培养嵌在基质胶2中培养在三维。此外,细胞可以通过3D顶部化验培养,也被称为3D叠加分析,这是符合成本效益,因为它需要的基质胶量较小,并促进集落形成时间推移监测相衬成像,是理想的原位成像2 -3。在上面试验中的三维已将用于定义腺泡表型和基因表达概况7之间的相关性。
三维培养可effectiv伊利用于从浸润癌区分正常和良性细胞。正常和良性乳腺细胞形成生长停止极化结构,在中心一个明确的管腔上,而基底膜浸润性癌细胞生长力强和随意,没有结算管腔。 E6/E7永生化人乳腺上皮细胞和MCF10A细胞系,这是一个自发永生化细胞系来自一个36岁的患者,纤维囊性变孤立的,已成功地用于夺回乳腺良性表型3D 3,8,并担任一个模型系统来研究几个分子8,9的致癌和抑癌功能。这些良性细胞可以被工程化以引入慢病毒/逆转录病毒操纵感兴趣的基因(次)。如果感兴趣的基因(s)是一种肿瘤抑制基因,shRNA的介导的敲除会导致,而恶性转化,如果感兴趣的基因是良性细胞癌基因的过度表达应该表现出恶性表型。在这两种情况下形成的三维腺泡结构可以捕获恶变。
良性的单细胞接种于3D开始增生并形成圆球形结构。 5-8天的细胞这个球形集合体将分化为细胞的周围偏振层,其与所述基质胶接触,并减少极化的细胞,缺乏与基质胶接触的内质。在接下来的10-15天的内细胞将开始凋亡形成一个清晰的管腔死。恶性肿瘤细胞将增长胡乱失去极性。高度恶性细胞通常形成分支结构。这些差异在表型可以通过时间的推移相衬成像和原位与相关分子标记免疫染色被捕获。最常用的标记是α-6-整,基底极性的标记,与所述增殖标志物磷酸化组蛋白3和apoptot组合IC标记物裂解的caspase-3。后者是重要的,以确定是否有管腔形成在中央的腺泡,正常和良性乳腺细胞的特征。其他极性和细胞间接触标志物包括GM130,层粘连蛋白,企业风险管理,E-cadherin的。交替的乳腺癌细胞系可被工程化来操纵感兴趣的基因。在这种情况下,复归到一个更大的增长被捕良性的表型可以被用作一个读出从癌症的表型区分。
三维培养也可以仔细用来划定参与恶性转化10-11的信号通路。使用上面提到的读数,药理抑制剂,阻断性抗体或重组蛋白可用于在分子信号传导,导致恶变被精确定位。与来自不同实验室的不断努力,可以从三维提取细胞,提取RNA,并制备裂解物用于免疫印迹和免疫noprecipitation。这些策略在协议中,并逐步详细地描述。
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Protocol
材料1。制备及文化传媒
- 解冻生长因子降低(GFR)的基底膜,在4°CO / N。
- 热身完整的媒体所需的细胞系在37°C。 MCF10A-ATCC指定的介质; HME-Ham氏F-12培养基补充有5%胎牛血清,1微克/毫升氢化可的松,5微克/毫升的胰岛素,10毫微克/毫升的表皮生长因子,和100纳克/毫升的霍乱毒素; SUM149-Ham氏F-12介质补充有5%FBS,2微克/毫升氢化可的松和5微克/毫升胰岛素;和MDA-MB-231-10%FBS-DMEM中
- 预冷冰上的8孔腔滑。
- 准备组织培养罩和用品。
2,三以及8商会幻灯片立体养殖
- 外套各孔在8孔滑动用40微升的GFR基质胶的。添加基质胶中的幻灯片的中心,然后用P200移液管尖端传播。尽量分散尽可能均匀,避免气泡和过扩展可导致半月板形成。
- 孵育的幻灯片,在37℃5%CO 2条件下。而基质胶的固化,胰蛋白酶消化细胞,收集并在组织培养中的离心旋转,在150×g离心4分钟。
- 计数细胞并稀释至12,500个细胞/ ml在相应细胞系的完整的媒体。加GFR的Matrigel至2%,并添加400微升到基质胶预涂腔滑动的各孔中。
- 孵化中的CO 2培养箱的幻灯片。给新鲜完整的媒体的变化,每4 个天,直到15天。
- 治疗药物抑制剂:对于抑制剂的研究添加小分子抑制剂的完整的媒体在电镀后辅以抑制剂新鲜媒体的变化的时候,每三天,而生长在基质胶的GFR的细胞。
- 治疗用纯化的蛋白:
- 板上的细胞以下步骤2.1-2.3。让文化来生长4天,随后血清starvati上16小时。
- 在第5天,治疗的细胞与纯化的蛋白质的适当的浓度在0.1%FBS补充培养基中的血清饥饿的细胞。术后第2天给予新鲜的媒体变化与纯化蛋白质。
- 在10日与完整的HME介质更换条件培养基。让文化成长为另外5天。
- 生长在基质胶腺泡结构的免疫荧光染色:
- 制备2%多聚甲醛,0.5%的Triton X-100和100mM甘氨酸中的1×PBS,pH为7.4。制备免疫缓冲液(IF缓冲液),其包含的1×PBS中含有0.1%牛血清白蛋白,0.2%的Triton X-100,0.05%Tween-20的。
- 使用P200的枪头小心吸的条件培养基。
- 修复腺泡结构,用2%在室温(RT)新鲜制备的多聚甲醛固定20分钟。
- 透化的细胞用0.5%Triton X-100的10分钟,在4℃下
- 洗净文化三大次100mM甘氨酸,10〜15分钟,每次洗涤。
- 在中频缓冲器10%山羊血清,称为主块,1小时,在室温下阻断细胞。
- 孵育用20微克/毫升的山羊抗小鼠的F(ab')2片段在30分钟主块缓冲器中的培养物。这个步骤是重要的,以阻止免疫小鼠IgG种类在基质胶。
- 与一抗孵育第二封闭液(小学块20μg/ ml的羊抗鼠的F(ab')2片段)O / N在4°C。
- 与中频缓冲器为每一个温和的摇摆10-15分钟,洗三次。
- 孵育45分钟,在中频缓冲器荧光标记的二抗。
- 洗3次,每次10 min与中频缓冲器与温和的摇摆。
- 安装滑轨含DAPI以可视化的核防褪色剂。
- 让片干燥O / N在室温。
- 图像采集:采集共聚焦图像的殖民地英里dsection生长在基质胶的顶部细胞。欲了解更多信息,取得了一系列的光学部分整个被Z堆叠腺泡结构的整个长度。
3,三维立体培养中2井室幻灯片的免疫印迹
- 预冷冰2井室幻灯片。按照步骤2.1-2.4扩大试剂为2孔腔滑如大衣,160微升基底膜,并添加1.6毫升细胞/基质胶混合到2孔滑动的每一个孔。
- 收获的基质胶使用市售的三维培养细胞收集试剂盒,按照制造商的说明腺泡结构。
- 稀释细胞清洗和细胞收集缓冲区为1x和预冷至4℃。洗涤基质胶和撞出应进行冰上。
- 洗腺泡结构3X使用的细胞洗涤缓冲液。
- 用细胞收集BU收集腺泡到15ml离心管中FFER随后孵育30分钟上的摇杆在4℃下混合悬浮液以及用1毫升移液管。这将破坏基质胶中的小块,并释放大部分细胞在细胞收获缓冲液中。
- 颗粒细胞在200 XG在文化离心机。从沉淀的细胞用P200移液管尖取出水凝胶的漂浮层。
- 重悬随试剂盒提供在SDS样品缓冲液中裂解。的RIPA裂解缓冲液中也可使用。
恶性与良性乳腺表现型4。定量
- 以下步骤2.1-2.4生长的细胞以一式三份对各治疗组。
- 采取腺泡结构的相位对比图像从每个孔在5X或使用连接到滑动移位器和一个计算机相衬显微镜10X分辨率。从一帧幻灯片移动到另一个,从而覆盖腔滑动的整个井所拍摄的图像。
- 计数腺泡结构的总数,单轮平腺泡和multiacinar结构或缺乏组织胡乱成长结构的数量以及与分支过程从它发出的数量。
- 计算单轮平腺泡结构与恶性结构的比例和情节的柱状图。通过学生t-检验计算显着性。
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Representative Results
三维培养物可被有效地用于区分人类乳腺上皮细胞的恶性表型的良性乳腺。镀在基质胶单良性细胞成长为有组织的球形结构采用X射线相衬成像,可以很容易地成像为单轮平腺泡在一个平面上。镀在基质胶的单一的恶性细胞生长随意,显示出非常高的折射率,而且难以像在一个平面上。 如图1,良性HME和MCF10A细胞形成球形寻找腺泡而高转移性乳腺癌细胞系SUM149和MDA-MB-231成长为分支的管状结构与流程从他们身上发出的。从良性表型这样的偏差可以被用作一个读出确认的恶性转化,并且可以被用来定义一个分子的功能作为一种肿瘤抑制基因,或作为一种肿瘤促进剂。 如图2,抑癌基因CCN6吨击倒(KD)装配工恶性转化。 HME细胞工程已经下降了慢病毒介导的转染调控CCN6水平从很早就失去了他们的组织。在第5天的良性控制细胞成长为完美的球形结构,而CCN6 KD细胞表现出混乱的表型。通过15天的良性对照细胞成为增长逮捕,并显示周围一个明确的中央管腔细胞的极化层,而KD细胞生长力强,以形成持续,如果允许的( 图2)生长杂乱无章大型管状结构。
几种分子标志物可被有利地使用的良性与恶性乳腺表型之间进行区分。良性乳腺显示了差异化的增长在三维培养被捕表型由15天。腺泡有基底膜沉积,可以通过与层粘连蛋白V的免疫染色显现为清楚地示出在控制单元在图3中图3)。
参与恶性转化的信号通路可以使用药理学抑制剂和纯化的重组人(rh的)蛋白质的组合来界定。 如图4中的malignanCCN6 KD HME细胞的T型可以通过rhCCN6蛋白的外源性治疗被还原为单轮腺泡结构。共焦成像的DAPI染色的腺泡结构的中间部分清楚地表明偏振腺泡用与rhCCN6处理CCN6 KD细胞中心腔。类似地侵入SUM149与P38 MAP激酶抑制剂处理的MDA-MB-231细胞显示了恶性表型( 图5A)的减少。回归到一个良性样表型可以通过计算单轮腺泡结构的比例相比,恶性结构进行量化。该抑制剂的特异性可以通过该AKT抑制剂不能显示上CCN6 KD细胞的任何效果,而与MAP激酶抑制剂PD98059治疗显示出显着的返原单轮腺泡结构( 图5B)的事实来理解。
良性与生长在基质胶10天的恶性乳腺细胞图1。相位对比图像。良性永生化人乳腺上皮细胞(HME)和自发永生MCF10A细胞生长为单轮平腺泡缺乏任何突出物。而恶性乳腺癌细胞系SUM149和MDA-MB-231成长为高度杂乱无章的结构。比例尺为100μm。 点击这里查看大图。
图2。HME控制和生长在基质胶CCN6 KD细胞共聚焦成像 点击这里查看大图。
图3。共聚焦成像技术显示在贝尼分子标记差异表达GN与恶性乳腺细胞。CCN6 KD HME单元显示了层粘连蛋白的V损失,相当于基底膜,损失基底极性标记物的α-6-整联的中断,表示极性和细胞-细胞接触的标记物E-钙粘蛋白损失的损失。然而,控制单元显示基底膜沉积(围绕腺泡一个完整的层粘连蛋白层),α-6整联的基础表达,GM130根尖表达和E-钙粘着蛋白在细胞 - 细胞连接的存在。标尺为50微米。 点击这里查看大图。
图4。拨CCN6 KD HME细胞通过用纯化的重组人CCN6 PROT外源治疗恶性表型的EIN。CCN6 KD细胞成长为杂乱无章,侵入腺泡结构的三维培养。然而,CCN6 KD细胞治疗与500纳克的rhCCN6回归秀/ ml的单轮腺泡表型腔内的结算,表明一个更良性的样表型。黑色比例尺为100μm和黄色标尺为50微米。 点击这里查看大图。
图5。治疗小分子抑制剂恢复的恶性表型,以更少的恶性或良性样表型。A。 2高转移性乳腺癌细胞系SUM149和MDA-MB-231与P38 MAP激酶抑制剂SB203850(5微米)和SB202190(10μM)处理降低了他们的恶性行为,体现在3D上的单轮腺泡表型。与AKT抑制剂LY294002(7.5微米)处理B. CCN6 KD HME细胞,Wortamannin(2 nm)的显示没有影响,但与MAP激酶抑制剂PD98059(10μM)处理恢复的表型,以单轮组织腺泡结构。 点击这里查看大图像。
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Discussion
在这里,我们已经描述了乳腺上皮细胞对重组基底膜的三维立体培养和本系统恶性与良性乳腺表现型来区分的用处。此系统还可以用于从其他腺体组织培养不同类型的细胞和已报道已被成功地用于培养的前列腺上皮细胞,支气管上皮细胞和甲状腺上皮细胞,仅举几例12-14。三维培养的重要性在于,它是生理学相关的模型。三维培养提供了深入了解,导致腺体结构破坏的恶性转化过程中的分子机制的一种手段。它也提供了一个工作模型系统,它可以是有用的在筛选用于治疗癌症的新的治疗目标。 许多药物而被发现是有效的在2D培养往往在实验和临床applictai影响不大组件15。作为这样的三维培养可提供重要的临床前工具来预测体内的化合物的效果。
3D文化是一个具有挑战性的技术,应仔细进行。 GFR基质胶是最常用的基质为在三维培养细胞。它可以在4℃的CO / N被解冻,等分并冷冻在-20℃以备将来使用。应避免反复冻融。 GFR基质胶是液体在4℃下固化,但在37℃,并且可以是非常困难的改变的条件培养基时,用新鲜培养基或在处理的细胞为免疫细胞化学处理。请不要使用真空吸引器来移除条件培养基,因为它必然导致整个腺泡文化的损失随着基质胶。它是观察到的情况下一样的MDA-MB-231细胞形成非常分支网络的一些积极的癌症细胞系中的类似结构的基底膜可以从外加分离面对并往往倍浮动。应小心吸出媒体这些文化,否则他们同时去除媒体都将丢失。
同样重要的是细胞成长为单层培养特别是对于良性细胞像HME和MCF10A的关怀和通道。超过合流或越轨行为从规定的媒体可能会影响腺泡形成3D。
它可以从三维培养物分离出的细胞进行处理,使用市售的三维培养细胞收集试剂盒的RNA或蛋白质的隔离。交替三维培养物可使用洗涤剂基-裂解缓冲液如RIPA缓冲液中直接溶解(1%诺乃洗涤剂P-40,0.2%SDS,0.5%脱氧胆酸钠,150mM氯化钠,50mM的Tris-盐酸,pH为7.4,的10mM氟化钠,1mM的原钒酸钠,10mM的β-甘油磷酸盐,5微克/毫升apoprotinin,5微克/毫升亮肽素,和100μM苯甲基磺酰氟)。但是蛋白质quantifi阳离子是由于蛋白质丰度在基质胶不可能在这种情况下。因此,蛋白裂解物应被归一化以用于测量稳定胞质酶,如乳糖脱氢酶(LDH)和印迹的活性的比色测 定法,应再次探测对于管家基因像肌动蛋白或微管蛋白或GAPDH的3。
然而从基质胶过程的细胞收集需要长时间温育在4℃下这可能会影响蛋白质在细胞表面的表达谱,因此在原位免疫染色是一个比较合适的方法来分析细胞表面蛋白的表达。对于免疫染色抗体孵育在温和摇动是有帮助的均匀染色的腺泡但最佳速度和摇杆种类是至关重要的,因为它也可以导致基质胶的脱离。抗体浓度可能需要优化,但大多数的抗体被认为是有效的以1:100的浓度。一个铁道部在表中提供的抗体电子商务具体名单。抗体及其规格的详细列表可以在Debnath说发现等。2同时孵化与从不同的动物,如大鼠,兔和小鼠获得一个以上的主要抗体可以进行,但应先优化,以排除任何交叉反应。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R01 CA107469,R01 CA125577和U01CA154224到CG Kleer的,密西根大学的癌症中心支持大学的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
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