Summary
Trois culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée est un procédé utile de rappeler l'architecture in vivo du sein bénigne, et pour différencier le phénotype malin du phénotype bénignes du sein. Surtout, ce système peut être appliqué pour étudier les carcinomes invasifs dans d'autres tissus.
Abstract
Les carcinomes du sein invasifs sont un groupe de tumeurs épithéliales malignes caractérisé par l'invasion des tissus adjacents et la propension à former des métastases. L'interaction des signaux entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement exerce une forte influence sur la croissance du cancer du sein et le comportement biologique 1. Cependant, la plupart de ces signaux de la matrice extracellulaire sont perdus ou leur pertinence est sous-lorsque les cellules sont cultivées dans deux cultures dimensions (2D) en monocouche. Au cours des dernières années, en trois dimensions (3D) de la culture sur une membrane basale reconstituée a émergé comme une méthode de choix pour récapituler l'architecture tissulaire de cellules bénignes et malignes du sein. Les cellules cultivées en 3D conservent les signaux importants de la matrice extracellulaire et fournissent un système ex vivo 2,3 physiologiquement pertinent. Fait à noter, il existe des preuves de plus en plus ce qui suggère que les cellules se comportent différemment lorsqu'ils sont cultivés en 3D par rapport à la 2D 4. Culture 3Dpeut être efficacement utilisé comme un moyen pour différencier le phénotype malin du phénotype bénigne du sein et de la signalisation cellulaire qui sous-tend moléculaire impliqué et 3. L'une des caractéristiques distinctives des cellules épithéliales bénignes, c'est qu'ils sont polarisés de telle sorte que le cytoplasme apical est vers le lumen et le cytoplasme basal repose sur la membrane basale. Cette polarité apico-basale est perdue dans les carcinomes du sein invasifs, qui sont caractérisées par une désorganisation cellulaire et la formation de l'anastomose et de ramification tubules qui s'infiltre au hasard le stroma environnant. Ces différences histopathologiques entre glande bénigne et le carcinome invasif peuvent être reproduits en 3D 6,7. Utilisation des lecture-out appropriées comme la quantification de simples structures acineuses rondes, ou l'expression différentielle des marqueurs moléculaires validées pour la prolifération cellulaire, la polarité et l'apoptose en combinaison avec d'autres techniques de biologie moléculaire et cellulaire, cultur 3De peut fournir un outil important pour mieux comprendre les changements cellulaires au cours de la transformation maligne et de la délimitation de la signalisation responsable.
Introduction
Trois culture tridimensionnelle (3D) de cellules épithéliales mammaires sur la membrane basale reconstituée est un important système modèle pour étudier le phénotype et le complexe de signalisation associée sein normal et le cancer du sein 2,3. L'unité fonctionnelle du sein est l'unité lobulaire conduit terminal (TDLU) qui se compose d'un petit conduit qui se ramifie en acini. Les acini sont des structures hautement organisées, composées de deux couches de cellules, les cellules épithéliales et myoépithéliales, qui sont entourés par une membrane basale 5. Les caractéristiques les plus distinctives des acini normaux sont polarisation cellulaire, l'attachement à la membrane basale sous-jacente et les contacts cellule-cellule spécialisés. Cette organisation complexe est perturbé dans les carcinomes invasifs. Les cultures 2D largement utilisés, où les cellules sont cultivées en monocouche, ne permettent pas la formation d'acini. Ainsi, la culture monocouche manque en proposant un système pour capturer la relation complexe entre les cellules épithélialesdans le sein normal et leur dérégulation dans le cancer du sein. Cultures épithéliales monotypique fonctionnelles des cellules mammaires ont été développés dans plusieurs laboratoires 2,3. Culture 3D implique la croissance des cellules mammaires sur Matrigel, qui est un extrait solubilisé dérivé de cellules de sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm et est disponible dans le commerce. D'autres substrats 3D comme le collagène I sont également utilisés. Les cellules du sein peuvent être cultivées en 3D 3D par dosage incorporé, où les cellules sont mises en culture dans du Matrigel embarqué 2. Alternativement, les cellules peuvent être cultivées en 3D sur test, aussi appelé test de superposition 3D, qui est rentable car elle nécessite moins de volume de Matrigel et facilite la surveillance en temps de déchéance de la formation de colonies par imagerie à contraste de phase et est idéal pour l'imagerie in situ 2 -3. Le 3D-dessus essai a été utilisé pour définir la corrélation entre le phénotype et acineuses profil d'expression génique 7.
Culture 3D peut être effectively utilisé pour distinguer les cellules normales et bénignes de cancer invasif. Les cellules normales et bénignes du sein constituent croissance arrêté structures polarisées avec une lumière bien définis dans le centre sur Matrigel tandis que les cellules de carcinome invasif poussent abondamment et au hasard sans compensation de la lumière. E6/E7 immortalisé des cellules épithéliales mammaires humaines et lignée cellulaire MCF10A, qui est une lignée cellulaire immortalisée spontanément isolée d'un patient de 36 ans avec des changements fibrokystique, ont été utilisés avec succès pour retrouver le phénotype bénigne du sein en 3D et 3,8 ont servi un système modèle pour étudier la fonction de suppresseur de tumeur oncogène et de plusieurs molécules 8,9. Ces cellules bénignes peuvent être conçues pour manipuler gène (s) d'intérêt par la mise en place de lentivirus / rétrovirus. Si le gène (s) d'intérêt est un gène suppresseur de tumeur, shRNA knockdown médié va conduire à une transformation maligne alors que si le gène d'intérêt est une surexpression de l'oncogène dans des cellules bénignesdevrait montrer un phénotype malin. Dans les deux cas, les structures acineuses formées en 3D peuvent capturer la transformation maligne.
Cellules individuelles bénignes plaqués en 3D commencent à proliférer et former autour des structures sphériques. 5-8 jours par cet agrégat sphérique de cellules se différencier en une couche entourant polarisée de cellules qui est en contact avec le Matrigel, et une masse interne de cellules polarisées moins, qui manquent de contact avec le Matrigel. Dans les 10-15 prochains jours les cellules internes vont commencer à mourir par apoptose formant une lumière claire. Les cellules malignes se développeront perdre au hasard de leur polarité. Cellules hautement malignes forment habituellement structures de branchement. Ces différences dans le phénotype peuvent être capturés par temps imagerie en contraste de phase de déchéance et in situ par immunomarquage avec des marqueurs moléculaires pertinents. Les marqueurs les plus couramment utilisés sont les alpha 6-intégrine, un marqueur de la polarité de la base, en combinaison avec le marqueur de prolifération phospho-histone 3 et la apoptotmarqueur ic caspase-3. Ce dernier point est important de déterminer si il ya formation lumen dans le centre de la acini, une caractéristique des cellules normales et bénignes du sein. D'autres marqueurs de polarité et de contact cellule-cellule comprennent GM130, la laminine, ERM, la E-cadhérine. Alternativement les lignées cellulaires de cancer du sein peuvent être conçues pour manipuler le gène d'intérêt. Dans ce cas, le retour à un phénotype plus bénin arrêté la croissance peut être utilisé comme une lecture à distinguer du phénotype du cancer.
Culture 3D peut également être utilisée avec précaution pour délimiter les voies de signalisation impliquées dans la transformation maligne de 10 à 11. Utilisation de l'mentionnés ci-dessus se lit en inhibiteurs pharmacologiques, des anticorps bloquants ou des protéines recombinantes peut être utilisé être identifier à la signalisation moléculaire conduisant à la transformation maligne. Avec la poursuite des efforts de différents laboratoires, il est possible d'extraire les cellules de la 3D à isoler l'ARN et également préparer des lysats pour immuno et immuniténoprecipitation. Ces stratégies sont décrites dans un pas à pas et de manière détaillée dans le protocole.
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Protocol
1. Préparation du matériel et de la culture des médias
- Facteur de croissance dégel réduite (GFR) Matrigel à 4 ° CO / N.
- Réchauffez médias complètes pour la lignée cellulaire nécessaire à 37 ° C. MCF10A-ATCC spécifié médias; F-12 du milieu de HME-Ham supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal, 1 ug / ml d'hydrocortisone, 5 ng / ml d'insuline, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique, et la toxine du choléra 100 ng / ml; F-12 les médias SUM 149-Ham additionné de 5% de FBS, 2 pg / ml d'hydrocortisone et 5 ug / ml d'insuline; et MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
- Prérefroidir une chambre diapositive 8 de bien sur la glace.
- Préparer tissu capot et fournitures culture.
2. Trois dimensions de la culture en Chambre de 8 puits diaporama
- Manteau de chaque puits de la diapositive 8 puits avec 40 pi de GFR Matrigel. Ajouter le Matrigel dans le centre de la diapositive et s'est ensuite propagée à l'aide d'une pipette P200. Essayez de répartir aussi équitablement que possible, en évitant les bulles et, étalée qui peut conduire àformation de ménisque.
- Incuber les lames à 37 ° C sous 5% de CO 2. Alors que le Matrigel se solidifie, trypsiniser les cellules, recueillir et tourner à 150 xg dans le tissu de la culture centrifugeuse pendant 4 min.
- Compter les cellules et diluer à 12 500 cellules / ml dans du milieu complet de la ligne de cellule respective. Ajouter GFR Matrigel à 2% et ajouter 400 ul à chaque puits d'une lame de chambre de pré-revêtue de Matrigel.
- Incuber les lames dans le CO 2 incubateur. Donner de nouveaux changements de médias complets chaque 4 e jour jusqu'à 15 jours.
- Le traitement avec des inhibiteurs pharmacologiques: Pour les études d'inhibiteur ajouter des inhibiteurs de petites molécules pour le milieu complet au moment de placage suivie par des changements fraîches de médias supplémenté avec les inhibiteurs de tous les trois jours, tandis que la croissance des cellules sur Matrigel GFR.
- Le traitement avec la protéine purifiée:
- Plaquer les cellules suivant les étapes 2.1 à 2.3. Permettre aux cultures de se développer pendant 4 jours, puis par starvati sériquespendant 16 heures.
- Au jour 5, traiter les cellules avec une concentration appropriée de protéine purifiée dans 0,1% de FBS complété médias pour les cellules privées de sérum. Donnez changement de milieu frais avec la protéine purifiée après 2 jours.
- Au jour 10 de remplacer le milieu conditionné avec des milieux complets HME. Permettre aux cultures de croître pendant encore 5 jours.
- Immunofluorescence des structures acineuses cultivées sur Matrigel:
- Préparer 2% de paraformaldehyde, 0,5% de Triton X-100 et de la glycine 100 mM dans 1 x PBS, pH 7,4. Préparer le tampon d'immunofluorescence (IF tampon) qui comprend de 1 x PBS contenant 0,1% d'albumine de sérum bovin, 0,2% de triton X-100, 0,05% de Tween-20.
- Utiliser un embout de pipette P200 pour aspirer soigneusement le milieu conditionné.
- Fixer les structures acineuses avec 2% de paraformaldehyde fraîchement préparé à la température ambiante (RT) pendant 20 min.
- Perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton X-100 pendant 10 min à 4 ° C.
- Laver la cultures trois fois avec 100 mM de glycine, de 10 à 15 min pour chaque lavage.
- Bloquer les cellules avec 10% de sérum de chèvre dans un tampon, appelé bloc primaire, pendant 1 heure à température ambiante.
- Incuber les cultures avec un anti-souris 20 pg / ml de chèvre F (ab ') 2, fragment dans un tampon de bloc primaire pendant 30 min. Cette étape est importante pour bloquer les espèces d'IgG de souris immunoréactives dans le Matrigel.
- Incuber avec l'anticorps primaire dans la seconde solution de blocage (bloc primaire 20 pg / ml d'anticorps de chèvre anti souris F (ab ') 2 fragment) O / N à 4 ° C.
- Laver trois fois avec un tampon IF pour 10-15 min chacun avec doux balancement.
- Incuber avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents dans un tampon pour 45 min.
- Laver pendant 3x pendant 10 min chacun avec un tampon IF avec doux balancement.
- Monter les lames avec le réactif anti-fade contenant DAPI pour visualiser les noyaux.
- Laisser sécher les lames O / N à la température ambiante.
- acquisition de l'image: Acquérir les images confocale au km de la coloniedsection de cellules cultivées sur le dessus de Matrigel. Pour plus d'informations acquérir une série de sections optiques sur toute la longueur de la structure de cellules acineuses par Z empilage.
3. Trois dimensions de la culture dans 2 puits Chambre diapositives pour Immunoblotting
- Prérefroidir une chambre diapositive 2 de bien sur la glace. Suivez les étapes 2.1-2.4 l'extension des réactifs pour la 2-bien diapositive par exemple manteau de chambre avec 160 ul de Matrigel et ajouter 1,6 ml de cellules / Matrigel mélanger dans chaque puits de la lame 2 puits.
- Récolter les structures acineuses du Matrigel en utilisant le kit de récolte des cellules de culture 3D disponibles dans le commerce en suivant les instructions du fabricant.
- Diluer le lavage de la cellule et de récolte de cellules tampons à 1x et prérefroidir à 4 ° C. Le lavage et le délogement de Matrigel doivent être effectuées sur de la glace.
- Laver les structures acineuses 3x à l'aide du tampon de lavage des cellules.
- Recueillir les acini en tubes de 15 ml à centrifuger en utilisant bu de récolte de cellulesffer suivie d'une incubation de 30 min sur un agitateur à 4 ° C. Mélangez bien avec une suspension pipette de 1 ml. Cela va rompre le Matrigel en petits morceaux et libérer la plupart des cellules dans le tampon de la récolte des cellules.
- Sédimenter les cellules à 200 xg dans une centrifugeuse de culture. Retirer la couche flottante d'hydrogel de le culot cellulaire avec une pointe de pipette P200.
- Remettre en suspension les lysats dans un tampon d'échantillon SDS fournies avec le kit. Tampon de lyse RIPA peut également être utilisé.
4. Quantification de vs malin phénotype du sein bénigne
- Cultiver les cellules en triple pour chaque ensemble de traitement suivant les étapes 2.1 à 2.4.
- Prendre des images de contraste de phase des structures acineuses de chaque puits à 5X ou 10X résolution en utilisant un microscope à contraste de phase fixée à un levier de vitesses de glissement et un ordinateur. Prendre les images en déplaçant le coulisseau d'une trame à l'autre et couvrant la totalité du puits de la lame ainsi chambré.
- Compter le nombre total de structures acineuses,le nombre de simple acini plat rond et le nombre de structures multiacinar ou des structures de plus en plus au hasard manquent d'organisation et de processus de branchement qui en découlent.
- Calculer le pourcentage de simples structures acineuses plat rond vs structures malignes et l'intrigue que le graphique de la colonne. Calculer la signification par le test t de Student.
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Representative Results
Culture 3D peut être efficacement utilisé pour différencier le phénotype malin des cellules épithéliales mammaires humaines du sein bénigne. Cellules bénignes simples plaqués sur Matrigel poussent comme des structures sphériques organisés qui peuvent facilement être imagés comme unique acini plat rond dans un plan en utilisant l'imagerie de contraste de phase. Les cellules malignes simples plaqués sur Matrigel poussent au hasard, montrent très haut indice de réfraction et sont difficiles à l'image dans un plan. Comme le montre la figure 1, le HME bénignes et les cellules forment des acini MCF10A regardant sphériques tandis que les lignées cellulaires hautement métastatiques du sein SUM 149 et MDA-MB-231 se développent en tant que ramification structures tubulaires avec des procédés qui en émanent. Un tel écart par rapport au phénotype bénin peut être utilisé comme une lecture pour confirmer la transformation maligne et peut être utilisé pour définir la fonction d'une molécule comme un suppresseur de tumeur ou en tant que promoteur de tumeur. Comme le montre la figure 2, l'effet de choc (KD) de gène suppresseur de tumeur CCN6 tgréeurs une transformation maligne. HME cellules conçues pour avoir une régulation négative des niveaux de CCN6 par lentivirus transfection médiée perdent leur organisation très tôt. Au jour 5, les cellules témoins bénins ont été de plus en plus des structures sphériques en parfait alors que les cellules CCN6 KD montrent un phénotype désorganisée. Le jour 15, les cellules de contrôle bénignes deviennent croissance arrêté et montrent une couche polarisée des cellules entourant une lumière centrale bien définies alors que les cellules se développent abondamment KD pour former de grandes structures tubulaires désorganisés qui continuent de croître si on les laisse (Figure 2).
Plusieurs marqueurs moléculaires peuvent être utilisés avantageusement à la différence entre le phénotype malin vs bénigne du sein. Le sein bénigne montre une croissance différenciée phénotype arrêté par jour 15 en culture en 3D. Les acini présentent un dépôt de la membrane basale qui peut être visualisée par coloration immunologique avec la laminine V comme cela est clairement montré dans les cellules de contrôle dans la Figure 3 (figure 3).
Les voies de signalisation impliquées dans la transformation maligne peuvent être délimitées à l'aide d'une combinaison d'inhibiteurs pharmacologiques et les protéines humaines recombinantes purifiées (rh). Comme le montre la figure 4, le Malingant phénotype des cellules CCN6 KD HME peuvent être reversées aux simples structures acineuses rondes par traitement exogène avec la protéine rhCCN6. Imagerie confocale à la mi-section des structures acineuses DAPI colorées montrent clairement acini polarisée avec lumière centrale dans les cellules CCN6 KD traités avec rhCCN6. De même, le SUM 149 invasive et MDA-MB-231 traitées avec l'inhibiteur de MAP-kinase P38 montre la réduction du phénotype malin (Figure 5A). Le retour à un phénotype bénin comme peut être quantifiée par le calcul du pourcentage de simples structures acineuses rondes par rapport aux structures malignes. La spécificité des inhibiteurs peut être appréciée par le fait que les inhibiteurs AKT ne montrent pas d'effet sur les cellules CCN6 KD tandis que le traitement avec le PD98059 d'inhibiteur de MAP-kinase présente une réversion remarquable de structures acineuses rondes individuelles (Figure 5B).
Figure 1. Des images à contraste de phase de cellules bénignes vs malignes du sein cultivées sur Matrigel pendant 10 jours. Les cellules immortalisées bénignes épithéliales mammaires humaines (HME) et les cellules immortalisées spontanément MCF10A grandir en tant que seul tour acini plat dépourvu de toute saillie. Considérant que les lignées de cellules mammaires humaines malignes SUM 149 et MDA-MB-231 poussent comme des structures très désorganisés. La barre d'échelle représente 100 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. D'imagerie confocale de HME-contrôle et les cellules CCN6 KD cultivées sur Matrigel
Figure 3. Imagerie confocale montre l'expression différentielle des marqueurs moléculaires dans benign contre les cellules malignes du sein. cellules CCN6 KD HME montrent une perte de la laminine V, soit la rupture de la membrane basale, la perte de base marqueur de polarité alpha-6-intégrine, indiquant une perte de polarité et la perte de cellule-cellule marqueur de contact E-cadhérine . Cependant, les cellules de contrôle montrent le dépôt de la membrane basale (une couche de laminine intacte autour de la acini), l'expression basale de l'intégrine alpha 6, expression apicale de GM130 et la présence de E-cadhérine à la jonction cellule-cellule. La barre d'échelle représente 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 4. Reprise du phénotype malin des cellules CCN6 KD HME par traitement exogène avec CCN6 humain recombinant purifié protein. cellules de KD de CCN6 poussent comme aléatoires, structures acineuses envahissantes dans la culture 3D. Cependant, les cellules CCN6 KD traités avec 500 ng / ml de rhCCN6 spectacle retour à acinaire unique phénotype ronde avec compensation de lumière, ce qui indique une plus bénignes comme phénotype. Noir barre d'échelle représente 100 um et barre d'échelle jaune représente 50 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 5. Traitement par inhibiteurs de petites molécules revenir le phénotype malin à moins maligne ou bénigne comme phénotype. A. Le traitement des deux hautement métastatiques lignées de cellules du sein SUM 149 et MDA-MB-231 avec des inhibiteurs de MAP-kinase P38 SB203850 (5 uM) et SB202190 (10 uM) réduit leurcomportement malin comme se reflète dans le seul acinaire phénotype ronde sur 3D. Cellules B. CCN6 KD HME traités avec des inhibiteurs de AKT LY294002 (7,5 uM), Wortamannin (2 nM) ne montre aucun effet, mais le traitement avec inhibiteur de MAP kinase PD98059 (10 M) retourne le phénotype à tour unique organisée structures acineuses. Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Nous avons décrit ici la culture tridimensionnelle de cellules épithéliales mammaires sur une membrane basale reconstituée, et l'utilité de ce système par rapport à la différence entre le phénotype malin bénigne du sein. Ce système peut également être utilisé pour la culture de différents types à partir d'autres tissus glandulaires cellulaires et a été rapporté comme ayant été utilisé avec succès pour la culture épithéliale prostatique, l'épithélium bronchique, et les cellules épithéliales de la thyroïde, pour n'en nommer que quelques-uns 12-14. L'importance de la culture 3D réside dans le fait qu'il s'agit d'un modèle physiologiquement pertinent. Culture 3D fournit un moyen pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui mènent à la perturbation de l'architecture glandulaire au cours de la transformation maligne. Elle fournit également un système modèle de travail qui peut être utile dans le criblage de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des cancers. Nombreux médicaments qui sont trouvés pour être efficace dans la culture 2D ont souvent peu d'effet dans applictai expérimentales et cliniquesons 15. En tant que telle culture 3D peut fournir un outil préclinique importante pour prédire l'effet des composés in vivo.
Culture 3D est une technique difficile et doit être effectuée avec soin. GFR Matrigel est le substrat le plus couramment utilisé pour la culture de cellules en 3D. Il peut être décongelé à 4 ° CO / N, aliquote et congelé à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Décongélation répétés de congélation doit être évitée. GFR Matrigel liquide à 4 ° C mais se solidifie à 37 ° C et peut être extrêmement difficile à gérer lors de la modification des milieux conditionnés par des milieux frais ou lors du traitement des cellules pour immunocytochimie. S'il vous plaît ne pas utiliser un aspirateur à vide pour éliminer le milieu conditionné car elle conduit invariablement à la perte de cultures acineuses entier avec le Matrigel. On observe que dans le cas de certaines lignées de cellules agressives telles que le cancer des cellules MDA-MB-231 cellules qui forment le réseau comme des structures très ramification du Matrigel peut se détacher de la surface et est souvent fois flottants. Il faut veiller à sucer médias sur ces cultures sinon ils seront perdus tout en enlevant les médias.
Tout aussi important est la prise en charge et le passage de la croissance de cellules comme des cultures en monocouche en particulier pour les cellules bénignes comme HME et MCF10A. Plus de confluence ou de déviance dans les médias prescrite peut affecter la formation acinaire en 3D.
Il est possible d'isoler des cellules à partir de cultures 3D pour le traitement de l'ARN ou de la protéine isolée en utilisant le kit disponible dans le commerce de la récolte de cellules de culture en 3D. Alternativement cultures tridimensionnelles peuvent être directement lysées en utilisant un tampon-de lyse à base de détergent tel que le tampon RIPA (1% de Nonidet P-40, 0,2% de SDS, du désoxycholate de sodium à 0,5%, chlorure de sodium 150 mM, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM de fluorure de sodium, orthovanadate de sodium à 1 mM, 10 mM b-glycérophosphate, 5 pg / ml apoprotinin, 5 pg / ml de leupeptine, et 100 uM de fluorure de phénylméthylsulfonyle). Cependant protéine quantificationcation n'est pas possible dans ce cas en raison de l'abondance de la protéine dans le Matrigel. Ainsi, les lysats de protéines doivent être normalisées avec les tests colorimétriques utilisés pour mesurer l'activité des enzymes cytosoliques stables, tels que le lactose déshydrogénase (LDH) et les transferts doivent être resondés pour un gène de ménage comme l'actine ou la tubuline ou GAPDH 3.
Toutefois, la récolte des cellules du processus Matrigel nécessite une longue incubation de durée à 4 ° C. Ceci peut affecter le profil d'expression des protéines de la surface cellulaire et en tant que tel immunocoloration in situ est une méthode plus appropriée pour analyser l'expression des protéines de la surface cellulaire. Pour immunomarquage anticorps incubation sur une bascule doux est utile pour la coloration uniforme acini mais la vitesse optimale et le type de bascule est essentielle car elle peut aussi conduire à la déloger de la Matrigel. La concentration d'anticorps peut avoir besoin de l'optimisation, mais la plupart des anticorps ont été trouvés pour être efficace à une concentration de 1:100. Un more liste spécifique des anticorps est fourni dans le tableau. Une liste détaillée des anticorps avec leurs spécifications peuvent être trouvées dans Debnath et al. 2 incubation simultanée de plus d'un anticorps primaire obtenue à partir de différents animaux comme le rat, le lapin et la souris peut être effectuée, mais doit être optimisée d'abord à écarter toute réactivité croisée .
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Disclosures
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions du NIH R01 CA107469, CA125577 R01, et U01CA154224 CG Kleer, l'Université du Centre de soutien de cancer du Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2-well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| Goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
References
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