तीन आयामी संस्कृति: स्तन कोशिकाओं की घातक परिवर्तन बनाम सामान्य कोष्ठकी संरचना का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण
Summary
एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर स्तन उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी संस्कृति सौम्य स्तन के vivo वास्तुकला पुनरावृत्ति करना, और सौम्य स्तन फेनोटाइप से घातक phenotype अंतर करने के लिए एक उपयोगी तरीका है. महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली के अन्य ऊतकों में आक्रामक कार्सिनोमा अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
इनवेसिव स्तन कार्सिनोमा metastasize करने के लिए आसन्न ऊतकों और प्रवृत्ति के आक्रमण के द्वारा होती घातक उपकला ट्यूमर का एक समूह है. कैंसर की कोशिकाओं और उनके microenvironment के बीच संकेतों के परस्पर क्रिया में स्तन कैंसर के विकास और जैविक व्यवहार 1 पर एक शक्तिशाली प्रभाव डाल रही है. हालांकि, बाह्य मैट्रिक्स से इन संकेतों के सबसे खो रहे हैं या कोशिकाओं एक monolayer के रूप में दो आयामी संस्कृति (2 डी) में बड़े हो रहे हैं जब उनकी प्रासंगिकता understudied है. हाल के वर्षों में, एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर तीन आयामी (3 डी) संस्कृति सौम्य और घातक स्तन कोशिकाओं के ऊतक वास्तुकला पुनरावृत्ति करना पसंद के एक तरीके के रूप में उभरा है. 3 डी में विकसित कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स से महत्वपूर्ण संकेतो को बनाए रखने और एक physiologically प्रासंगिक पूर्व vivo प्रणाली 2,3 प्रदान करते हैं. ध्यान से, 2 डी 4 की तुलना में 3 डी में उगाई जब कोशिकाओं को अलग ढंग से व्यवहार करते हैं, सुझाव है कि वहाँ बढ़ती सबूत है. 3D संस्कृतिप्रभावी ढंग से 3 शामिल सौम्य स्तन फेनोटाइप से घातक phenotype अंतर करने के लिए एक साधन के रूप में और सेलुलर और आणविक संकेत दे underpinning के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सौम्य उपकला कोशिकाओं के विशिष्ठ विशेषताओं में से एक शिखर कोशिका द्रव्य लुमेन की ओर है और बेसल कोशिका द्रव्य तहखाने झिल्ली पर टिकी हुई है, ताकि वे polarized रहे हैं. इस apico बेसल ध्रुवता सेलुलर विप्लव और संयोग से आसपास के स्ट्रोमा पैठ कि नलिकाओं anastomosing और शाखाओं में बंटी के गठन की विशेषता है जो आक्रामक स्तन कार्सिनोमा, में खो जाता है. सौम्य ग्रंथि और आक्रामक कार्सिनोमा के बीच ये histopathological मतभेद 3D 6,7 में reproduced किया जा सकता है. अन्य आणविक और कोशिका जीव विज्ञान तकनीक, 3 डी संस्कृतियों के साथ संयोजन में सेल प्रसार, polarity और apoptosis के लिए मान्य आणविक मार्कर की अभिव्यक्ति अंतर है, एक दौर कोष्ठकी संरचनाओं के quantitation तरह उपयुक्त पढ़ें बहिष्कार या का उपयोगई बेहतर घातक परिवर्तन के दौरान और जिम्मेदार संकेतन delineating के लिए सेलुलर परिवर्तन को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान कर सकते हैं.
Introduction
पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर स्तन उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी संस्कृति (3 डी) जटिल phenotype और सामान्य स्तन और स्तन कैंसर 2,3 के जुड़े संकेतन अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली है. स्तन की कार्यात्मक इकाई acini में जो शाखाओं एक छोटे वाहिनी के होते हैं, जो टर्मिनल वाहिनी lobular इकाई (TDLU) है. acini एक तहखाने झिल्ली 5 से घिरे हैं जो दो सेल परतों, उपकला और myoepithelial कोशिकाओं से बना अत्यधिक संगठित संरचनाओं, कर रहे हैं. सामान्य acini की सबसे ख़ास सुविधाओं सेलुलर ध्रुवीकरण, अंतर्निहित तहखाने झिल्ली को लगाव और विशेष सेल सेल संपर्क कर रहे हैं. इस जटिल संगठन आक्रामक कार्सिनोमा में बाधित है. कोशिकाओं monolayers के रूप में बड़े हो रहे हैं, जहां व्यापक रूप से इस्तेमाल 2D संस्कृतियों, acini के गठन के लिए अनुमति नहीं देते हैं. इस प्रकार, monolayer संस्कृति उपकला कोशिकाओं के बीच जटिल संबंधों पर कब्जा करने के लिए एक प्रणाली प्रदान करने में कमी हैसामान्य स्तन और स्तन कैंसर में उनकी ढील में. स्तन कोशिकाओं के कार्यात्मक monotypic उपकला संस्कृतियों कई प्रयोगशालाओं 2,3 में विकसित किया गया है. 3D संस्कृति Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक solubilized निकालने है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है जो Matrigel, पर स्तन कोशिकाओं के विकास शामिल है. कोलेजन की तरह अन्य 3 डी substrata मैं भी उपयोग किया जाता है. स्तन कोशिकाओं कोशिकाओं Matrigel 2 में एम्बेडेड सुसंस्कृत हैं जहां 3 डी एम्बेडेड परख, 3 डी में संवर्धित किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को भी यह Matrigel की कम मात्रा की आवश्यकता होती है, और चरण विपरीत इमेजिंग द्वारा कॉलोनी गठन के समय चूक निगरानी की सुविधा और सीटू इमेजिंग 2 में लिए आदर्श है के रूप में लागत प्रभावी है जो 3 डी ओवरले परख, कहा जाता है, शीर्ष परख पर 3 डी द्वारा संवर्धित किया जा सकता है -3. शीर्ष परख पर 3 डी कोष्ठकी phenotype और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल 7 के बीच के संबंध को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
3D संस्कृति प्रभावी ढंग से किया जा सकता हैइली आक्रामक कार्सिनोमा से सामान्य और सौम्य कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सामान्य और सौम्य स्तन कोशिकाओं आक्रामक कार्सिनोमा कोशिकाओं लुमेन का कोई समाशोधन साथ prolifically और संयोग से बढ़ने जबकि विकास Matrigel पर केंद्र में एक अच्छी तरह से परिभाषित लुमेन साथ ध्रुवीकृत संरचनाओं गिरफ्तार फार्म. E6/E7 मानव स्तन उपकला कोशिकाओं और fibrocystic परिवर्तन के साथ एक 36 वर्षीय रोगी से अलग एक अनायास अमर सेल लाइन, सफलतापूर्वक 3 डी 3,8 में सौम्य स्तन फेनोटाइप हटा देना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और के रूप में सेवा की है जो MCF10A सेल लाइन, अमर कई अणु 8,9 के oncogenic और ट्यूमर शमन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली. इन कोशिकाओं सौम्य lentivirus / रेट्रोवायरस के लागू होने से ब्याज की जीन (ओं) में हेरफेर करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है. ब्याज की जीन (एस) एक ट्यूमर शमन है तो ब्याज की जीन सौम्य कोशिकाओं में एक ओंकोजीन overexpression है, तो shRNA मध्यस्थता पछाड़ना जबकि एक घातक परिवर्तन को बढ़ावा मिलेगाएक घातक phenotype दिखाना चाहिए. दोनों ही मामलों में 3 डी में गठित कोष्ठकी संरचनाओं घातक परिवर्तन पर कब्जा कर सकते हैं.
3 डी में चढ़ाया सौम्य एकल कक्षों गोलाकार संरचना पैदा करना और गोल बनाने के लिए शुरू करते हैं. दिन 5-8 से कोशिकाओं की इस गोलाकार कुल Matrigel के साथ संपर्क में है कि कोशिकाओं के आसपास ध्रुवीकृत परत, और Matrigel के साथ संपर्क का अभाव है जो कम ध्रुवीकृत कोशिकाओं, के एक भीतरी मास में अलग होगा. अगले 10-15 दिनों में इनर कोशिकाओं apoptosis एक स्पष्ट लुमेन के गठन से मरने के लिए शुरू कर देंगे. घातक कोशिकाओं संयोग से उनके polarity खोने बढ़ेगा. अत्यधिक घातक कोशिकाओं आमतौर पर संरचनाओं शाखाओं में फार्म. Phenotype में इन मतभेदों को समय चूक चरण विपरीत इमेजिंग द्वारा और बगल में प्रासंगिक आणविक मार्कर के साथ immunostaining द्वारा कब्जा किया जा सकता है. सबसे अधिक इस्तेमाल किया मार्करों प्रसार मार्कर phospho-histone 3 और apoptot साथ संयोजन में, अल्फा 6 integrin, एक बेसल ध्रुवता मार्कर हैंआईसी मार्कर कस्पासे -3 cleaved. उत्तरार्द्ध acini के केंद्र, सामान्य और सौम्य स्तन कोशिकाओं की एक विशेषता में लुमेन गठन है कि क्या वहाँ निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. अन्य polarity और सेल सेल संपर्क मार्करों GM130, laminin, एर्म, ई cadherin शामिल हैं. वैकल्पिक रूप से स्तन कैंसर कोशिका लाइनों ब्याज की जीन में हेरफेर करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है. गिरफ्तार एक और अधिक वृद्धि करने के लिए इस मामले प्रत्यावर्तन में सौम्य phenotype के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक कैंसर फेनोटाइप से अलग करने के लिए पढ़ा.
3D संस्कृति भी ध्यान से घातक परिवर्तन 10-11 में शामिल संकेत दे रास्ते को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. का उपयोग करके उपरोक्त पढ़ने के बहिष्कार, औषधीय inhibitors, अवरुद्ध एंटीबॉडी या पुनः संयोजक प्रोटीन उल्लेख घातक परिवर्तन के लिए अग्रणी आणविक संकेतन में तुच्छ किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. विभिन्न प्रयोगशालाओं से निरंतर प्रयासों के साथ यह शाही सेना को अलग और भी immunoblotting और immu के लिए lysates तैयार करने के लिए 3 डी से कोशिकाओं को निकालने के लिए संभव हैnoprecipitation. इन रणनीतियों प्रोटोकॉल में एक stepwise और विस्तृत रूप में वर्णित हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ एक पुनर्गठन तहखाने झिल्ली पर स्तन उपकला कोशिकाओं के तीन आयामी संस्कृति और घातक बनाम सौम्य स्तन phenotype के बीच अंतर करने के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता का वर्णन किया है. इस प्रणाली को भी अन्य ग्रंथिय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच अनुदान R01 CA107469, R01 CA125577, और तटरक्षक Kleer, मिशिगन कैंसर केंद्र सहायता करने के लिए विश्वविद्यालय U01CA154224 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
| Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
| Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
| goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
| 3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
| Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |
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