Cultivo tridimensional de células epiteliales mamarias sobre una membrana basal reconstituida es un método útil para recapitular la arquitectura in vivo de la benigna de la mama, y para diferenciar el fenotipo maligno de la fenotipo benigna de la mama. Es importante destacar que este sistema se puede aplicar para estudiar los carcinomas invasivos en otros tejidos.
Carcinomas de mama invasivo son un grupo de tumores epiteliales malignos caracterizados por la invasión de tejidos adyacentes y la propensión a la metástasis. La interacción de señales entre las células cancerosas y su microentorno ejerce una poderosa influencia sobre el crecimiento del cáncer de mama y el comportamiento biológico 1. Sin embargo, la mayoría de estas señales de la matriz extracelular se pierden o su relevancia está poco estudiada cuando las células se cultivan en dos culturas dimensiones (2D) como una monocapa. En los últimos años, cultivo tridimensional (3D) sobre una membrana basal reconstituida ha surgido como un método de elección para recapitular la arquitectura del tejido de las células mamarias benignas y malignas. Las células cultivadas en 3D conservan las señales importantes de la matriz extracelular y proporcionan un sistema ex vivo 2,3 fisiológicamente relevante. Es de destacar que existe una creciente evidencia que sugiere que las células se comportan de manera diferente cuando se cultiva en 3D en comparación con 2D 4. Cultura 3Dpuede ser utilizado eficazmente como un medio para diferenciar el fenotipo maligno de la fenotipo benigna de la mama y para sustentar la señalización celular y molecular implicado 3. Una de las características distintivas de las células epiteliales benignos es que están polarizados de manera que el citoplasma apical es hacia el lumen y el citoplasma basal descansa sobre la membrana basal. Esta polaridad apico basal se pierde en los carcinomas de mama invasivos, que se caracterizan por la desorganización celular y la formación de anastomosis y ramificación de túbulos que se infiltra al azar el estroma circundante. Estas diferencias histopatológicas entre las glándulas benignas y el carcinoma invasor se pueden reproducir en 3D 6,7. Usando las lecturas de espera apropiadas como la cuantificación de las estructuras acinares individuales redondos, o la expresión diferencial de marcadores moleculares validados para la proliferación celular, la polaridad y la apoptosis en combinación con otras técnicas de biología molecular y celular, cultur 3De puede proporcionar una herramienta importante para entender mejor los cambios celulares durante la transformación maligna y para delinear la señalización responsable.
Cultivo tridimensional (3D) de las células epiteliales de mama en la membrana basal reconstituida es un importante sistema modelo para estudiar el complejo fenotipo y la señalización asociada de mama normal y cáncer de mama 2,3. La unidad funcional de mama es la unidad lobular del conducto terminal (TDLU) que consiste en un pequeño conducto que se ramifica en los acinos. Los acinos son estructuras altamente organizadas, compuestas de dos capas de células, células epiteliales y mioepiteliales, que están rodeados por una membrana basal 5. Las características más distintivas de acinos normales son la polarización celular, unión a la membrana basal subyacente y contactos especializados célula-célula. Esta organización intrincada se interrumpe en los carcinomas invasivos. Las culturas 2D ampliamente utilizados, donde las células se cultivan como monocapas, no permiten la formación de acinos. Por lo tanto, el cultivo en monocapa se carece en proporcionar un sistema para capturar la relación compleja entre las células epitelialesen condiciones normales de mama y su desregulación en el cáncer de mama. Culturas epiteliales monotípicas funcionales de las células del seno se han desarrollado en varios laboratorios 2,3. Cultura 3D implica el crecimiento de células de mama en Matrigel, que es un extracto solubilizado derivado de Engelbreth-Holm-Swarm células de sarcoma de ratón y está disponible comercialmente. Otros sustratos 3D como colágeno I también se utilizan. Las células de la mama pueden ser cultivadas en 3D mediante ensayo incorporado 3D, donde se cultivan las células incrustado en Matrigel 2. Alternativamente, las células pueden ser cultivadas por 3D en ensayo superior, también llamado ensayo de superposición 3D, que es rentable, ya que requiere menor volumen de Matrigel, y facilita el seguimiento de lapso de tiempo de la formación de colonias por imágenes de contraste de fase y es ideal para la proyección de imagen en situ 2 -3. El ensayo de 3D en la parte superior se ha utilizado para definir la correlación entre el fenotipo acinar y perfil de expresión génica 7.
Cultura 3D se puede effectively utiliza para distinguir las células normales y malignas de carcinoma invasor. Las células normales y malignas de mama forman crecimiento arrestado estructuras polarizadas con una luz bien definidos en el centro de Matrigel mientras que las células de carcinoma invasivo crecen prolíficamente y sin orden ni concierto, sin compensación de la luz. E6/E7 inmortalizado células epiteliales mamarias humanas y de la línea de células MCF10A, que es una línea celular inmortalizada espontáneamente aislada de un paciente de 36 años con los cambios fibroquísticos, se han utilizado con éxito para recuperar el fenotipo benigno de mama en 3D 3,8 y han servido como un sistema modelo para estudiar la función de supresor de oncogénica y tumoral de varias moléculas de 8,9. Estas células benignas pueden ser diseñados para manipular gen (s) de interés por la introducción de los lentivirus / retrovirus. Si el gen (s) de interés es un gen supresor tumoral, desmontables shRNA mediada conducirá a una transformación maligna mientras que si el gen de interés es una sobreexpresión de oncogenes en células benignasdebe mostrar un fenotipo maligno. En ambos casos las estructuras acinares formados en 3D pueden capturar la transformación maligna.
Células individuales benignos chapados en 3D comienzan a proliferar y formar ronda estructuras esféricas. Por días 5-8 este agregado esférico de células se diferencien en una capa que rodea polarizada de células que está en contacto con el Matrigel, y una masa interior de células menos polarizadas, que carecen de contacto con el Matrigel. En los próximos 10 a 15 días las células internas empezarán a morir por apoptosis formando un lumen clara. Las células malignas crecen desordenadamente perder su polaridad. Células altamente malignos generalmente se forman estructuras de ramificación. Estas diferencias en el fenotipo puede ser capturado por imágenes de contraste de fase de lapso de tiempo y por in situ inmunotinción con marcadores moleculares relevantes. Los marcadores más comúnmente utilizados son alfa 6 integrina, un marcador de polaridad basales, en combinación con el marcador de proliferación fosfo-histona 3 y el apoptotic marcador escinde la caspasa-3. Esto último es importante para determinar si existe la formación del lumen en el centro de los acinos, una característica de las células normales y benignos de mama. Otros marcadores de polaridad y de contacto célula-célula incluyen GM130, laminina, ERM, E-cadherina. Alternativamente las líneas celulares de cáncer de mama pueden ser diseñados para manipular el gen de interés. En este caso, la reversión a un fenotipo más se detiene el crecimiento benigno se puede utilizar como una lectura de distinguir de la fenotipo del cáncer.
Cultura 3D también puede usarse con cuidado para delinear las vías de señalización implicadas en la transformación maligna 10-11. Usando la anteriormente mencionada-outs leído, inhibidores farmacológicos, anticuerpos de bloqueo o proteínas recombinantes puede ser utilizado ser identificar en la señalización que conducen a la transformación maligna. Con la continuación de los esfuerzos de diversos laboratorios es posible extraer las células de 3D para aislar ARN y también preparar lisados para inmunotransferencia y inmunidadnoprecipitation. Estas estrategias se describen en un paso a paso y de manera detallada en el protocolo.
Hemos descrito aquí el cultivo de tres dimensiones de las células epiteliales de mama sobre una membrana basal reconstituida y la utilidad de este sistema para diferenciar entre vs maligno fenotipo benigna de la mama. Este sistema también puede ser usado para cultivar diferentes tipos de células de otros tejidos glandulares y se ha informado que se han utilizado con éxito para la cultura epitelial de próstata, del epitelio bronquial, y las células epiteliales de tiroides, para nombrar unos pocos 12-14.…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH R01 CA107469, R01 CA125577 y U01CA154224 a CG Kleer, la Universidad del Centro del Cáncer de Apoyo de Michigan.
Growth Factor Reduced matrigel | BD biosciences | 354230 | Avoid repeat freeze thaw |
Lab-Tek glass hamber slides 8-well | Thermo Fisher Scientific | 177402 | Precool on ice |
Lab-Tek glass chamber slides 2- well | Thermo Fisher Scientific | 177380 | Precool on ice |
goat anti mouse F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular probes | Please look at molecular probes website | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Molecular Probes | P36935 | |
3D Culture Cell Harvesting kit | Trevigen | 3448-020-k | |
Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientifics | MAB1378 | 1:00 dilution for IF |
Anti-GM130 | BD Biosciences | 610822 | 1:00 dilution for IF |
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientifics | 16-222 | 1:100 dilution for IF |
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | Cell Signaling | 9661s | 1:50 dilution for IF |
Anti-E-cadherin | BD Biosciences | 610181 | 1:200 dilution for IF |