Abstract
우리는 JPK AFM 위해, 원자 힘 현미경 (AFM)의 마이크로 / 나노 만입를 사용 식물 조직의 표면의 기계적 성질을 측정하기 위해 최근 개발 된 방법을 서술. 특히,이 프로토콜에서 우리는 꽃 분열 조직, 배축, 뿌리의 × 100 μm의 최대 100 μM의 지역에 걸쳐 세포 내 해상도에서 세포벽의 겉보기 탄성 계수를 측정한다. 이 샘플의주의 준비, 마이크로 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 단, 측정 셀 plasmolyze 따라서 세포 팽압의 기여를 제거하기 위해 만니톨의 고농도 용액으로 수행되어 세포벽 특성을 고려하여.
다른 현존하는 기술과 대조적으로, 다른 덴터 및 압입 깊이를 사용함으로써,이 방법은, 동시 다중 스케일의 측정을 허용 그러나, 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다 방법은 (직경 100 μm의 정도) 만 외부 조직에 매우 작은 샘플을 사용할 수 있습니다; 이 방법은 조직의 지형에 민감하다; 그것은 조직의 복잡한 기계적 특성의 특정 측면을 측정합니다. 기술이 급속도로 개발되고 있으며 이러한 제한의 가장 가까운 미래에 해결 될 가능성이있다.
Introduction
식물의 성장은 유기체의 각각의 셀을 둘러싸 강성 세포벽 코디 팽창에 의해 달성된다. 증거를 축적하는 것은 식물이 로컬이 확장을 제어하는 세포 벽 화학의 변경을 나타냅니다. 팽창은 셀의 높은 팽압 기인 셀벽에 변형에 의해 주로 구동되는 것으로 생각된다; 팽압이 변형 응답은 셀 벽 (1)의 기계적 특성에 의해 지배된다. 약간은 이러한 기계적 특성으로 알려져 있으며, 그들이 개발하는 동안 변경하는 방법. 더욱이 작은 이러한 기계적 특성은 피드백 명백하게 조직에 걸쳐 조정되는 방식으로 셀 벽 화학을 변경할지 여부를 올릴 제어되는 방법으로 알려져있다. 우리는 화학 및 기계적 개발 중에 식물 세포벽의 변화, 그리고 궁극적으로 이러한 방법에 미세한 상호 작용을 제어하는 발전소 사이의 연결을 이해하는 경우에의 거시적 성장, 세포 또는 조직 규모로 장기를 개발하는 셀 벽의 기계적 특성을 모니터링 할 방법이 요구된다.
원자 힘 현미경 (AFM) 방법은 마이크로 미터 또는 나노 미터 티슈 압박 또는 만입 부에 기초하는, 기재, 세포 이하의 해상도에서 동시에 장기를 개발하고 조직의 전 영역에 걸쳐 세포 벽의 기계적 성질을 측정하기 위해 정밀하게 개발되었다. 다른 방법이 하나 너무 낮거나 너무 높은 해상도 : 신율은 밀리미터 규모 2-4, 초기 이벤트를 측정하기에 너무 큰 예를 들어 인 규모로 전체 조직의 평균 기계적 특성을 측정하기 만 할 수있다 기관 형성; microindenter는 나노 미터 스케일에서 세포 이하의 해상도로 측정 할 수 있지만, 고립 된 세포가 아닌 세포 또는 장기 5-7의 그룹을 측정으로 제한됩니다. AFM으로는 필요D 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도는 8 ~ 10을 달성 할 수있다. 최근 여러 프로토콜도 11, 12을 사용할 수 식물 조직의 역학을 측정하기 위해 특별히 개발되었다.
우리는 명백 영률 (13)의 측정을 통해 조직의 탄성을 평가하는 방법을 여기에 제시한다.
영 모듈러스는 일반적으로 재료의 강성을 설명하는 데 사용된다. 작은 변형 중에 재료를 변형 시키는데 필요한 힘은 압입의 면적에 비례한다. 젊은 계수이 계수이다. 연속 균질 재료의 경우에는 동일 계수에 관계없이 압입 타입 (크기 및 형상)의 측정되지만 둘레의 속도로 변화 할 것이다. 식물 조직의 복잡한 구조의 경우에, 우리는 지금까지 힘이 판단을 허용하는 변형에 비례한다는 관찰우리가 "명백한 젊은 계수"의 이름을 비례 계수. 식물의 연속 MEDIAS에서 대조적으로,이 명백한 젊은 계수는 들여 쓰기의 크기에 민감합니다. 그것은 순수 세포벽의 젊은 계수에 대응하지 않는다. 그것은 최고의 조직의 세포 벽의 발판의 신축성을 설명합니다.
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Protocol
1. 샘플 장착 용 유리 슬라이드를 준비합니다
- 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA 준비 : 10 % 만니톨 (물)의 0.7 % 저 융점 아가.
- 강한 금속기구 (예를 들면 드릴 팁, 라임)을 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 중심에 0.5 × 0.5 cm의 영역을 에칭. 또는 그 대신, 아랄 다이 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 유리 라멜라 (약 20 × 200 ㎛)의 작은 조각을 접착제. NOTE :이되도록하여 아가로의 부착을 용이하게하기 위해 표면을 거칠게하는 슬라이드 아가 미디어 스틱 또는 수정. 이 슬라이드는 재사용 할 수 있습니다.
- 유리 슬라이드의 에칭 지역에 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA의 약 20 μL의 방울을 배치합니다. 따라서, 아가 로스의 박막을 준다.
- 습기가 상자에 유리 슬라이드를 저장하고 아가 로스 미디어가 응고 될 때까지 기다립니다.
2. 분열 조직 샘플을 해부 및 설치
- 공 초점 이마 기위한 Microdissect 분열 조직NG : 초 미세 핀셋을 아래로 당겨서 줄기에서 꽃 봉오리 하나 하나를 제거합니다. 그것은 (P1 원기 14 즉) 꽃받침 잎을 나타내지 않는 꽃 봉오리에 모든 꽃 봉오리를 제거하는 것이 중요합니다.
- 면도날이나 핀셋의 끝 부분을 사용하여, 멀리 줄기에서 분열 조직을 잘라. 컷은 AFM으로 측정한다 분열 조직 표면의 영역에 평행해야한다. 얻어진 정점은 300 μm의 AFM 팁 아래에 맞게 높은 600 μm의 사이에 있어야한다.
- 단계 1.1.4에서 준비 아가로 오스 미디어의 영화로 정점을 밀어 넣습니다. 유리 슬라이드 / 아가로 오스의 위치를 선택하고 분열 조직은 유리 슬라이드에 접촉 직접적이며, 아가로 오스에서 밖으로 돌출 부드럽게 등을 밀어 넣습니다. 그것은 줄기에서의 컷을 따라 몇 초 내에 아가로 오스의 분열 조직의 위치를 매우 중요합니다. NOTE :이 건조로부터 분열을 방지하기 위해서이다. 이 단계에서, 분열 조직은 CRAC 서한다아가로 오스는 압력의인가시 골절 때문에 K.
- 그들은 같은 높이의이고 하나의 슬라이드에 서로 미만 500 μm의 위치하도록 제공하고, 여러 분열 조직에게 일괄 이미징이 방법을 준비합니다. 추가 샘플을 해부하는 동안 습기 상자에 준비 분열 조직을 유지.
참고 : 교정에서 오는 변화를 제한합니다. 각 조건의 적 2 샘플을 준비하고 무작위로 측정 할 수있다. 지금까지 측정 (스트레스 유발 응답)에 배치 영상의 더 관찰 된 효과가 없습니다. 이 한천 및 / 또는 설치 솔루션 스트레스 신호 전달 분자의 희석에 대한 감사가 될 수 있습니다. 대안 적 스트레스 반응에 관계없이 제조 된 샘플의 양과 동일하다. - 다음 단계로 이동하기 전에 분열과 꽃 봉오리의 경계가 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과잉의 물을 제거한다. 이것은 녹은 다음 단계에 방지해야아가로 인해 모세관 힘에 샘플을 홍수.
- 20 μL 피펫으로 충분히 추가 단계 1.2.3에서 생성 된 균열을 채우기 위해 아가로 오스 장착 녹아있다. 각 분열 조직을 둘러싸. 아가로 오스가 제거 된 꽃 봉오리 (primordium)의 흉터의 수준에 도달해야한다. 이것을 달성하기 위해서는, 균열의 각 단부에 아가 로스를 첨가 할 필요가있을 수도있다.
- 아가 로스를 첨가되면 신속 균열로 범람 할 것이다; 피펫을 사용하여, 분열 조직 슬라이드의 가장 높은 지점에 있는지 확인하는 아가로 오스 장착 용융의 일부를 빨아. 이 영상 중에 이동할 수 있도록이 분열을 해결합니다.
3. 설치 루트 또는 배축 샘플
- 뿌리와 배축의 경우, 절개가 필요하지 않습니다. 제조 된 유리 슬라이드에 아가로 오스의 박막에서 직접 유리에 에칭 위 또는 유리의 얇은 판을 따라 하나 홈을합니다. 그것과 접촉하는 것을 보장이 홈에 루트 또는 배축을 놓고그것의 전체 길이를 따라 유리.
- 다음 단계로 이동하기 전에 샘플 표면에 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과량의 물을 제거한다.
- 추가 단계 1.2.6에서와 같이 시료의 주위에 아가로 오스 장착 녹아있다.
4. AFM 준비 및 감도 교정 (JPK Nanowizard AFM 용)
- AFM의 캔틸레버를 탑재합니다. 캔틸레버는 둥근 모양 인 덴터에 장착해야합니다. 반경은 X, Y, Z의 해상도와 정확한 측정이 보관 될 수있는에 압입 깊이를 결정합니다.
- 표피의 표면에서 메조 나노 측정을 수행하려면, 50 nm의 반경 라운드 압자를 사용; , 중규모 측정을 0.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용하는; (2 ~ 3 세포를 통해) 마이크로 측정을 위해, 2.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용합니다.
- 캔틸레버의 끝에서 레이저의 위치. 중간에 레이저를 맞 춥니 다미러를 사용한 포획의.
- AFM에서 깨끗한 유리를 배치합니다.
NOTE : 다음은 캔틸레버의 변형에 AFM 수용체에 레이저의 위치 신호를 변환하도록 설정하고, 강제로 번역하기 위해, 캔틸레버의 스프링 정수를 평가하는 것이다. - 1 V.의 목표 힘 "세트 포인트"로 접근
- "힘 분광"를 선택합니다. 2 V에 최대 "상대 세트 포인트"를 설정하여 들여 쓰기를 수행, 40 μm의 / 초에 "속도를 확장", 5 μm의 "Z 길이".
- "교정 관리"메뉴에서 "적합 범위를 선택"버튼을 사용하여 감도에 맞게 앞으로 곡선의 선형 부분을 선택합니다. "상대 세트 포인트"는 "m"에 "볼트"에서 변형되어야한다.
- "교정 관리"메뉴에서 엘에게 평가하는 "스프링 상수"를 선택열적 변동을 이용하여 캔틸레버의 asticity. 캔틸레버의 스펙트럼 밀도 플롯을 얻기를 눌러 "실행". 가장 낮은 주파수와 공진 피크를 찾을 수 있습니다. "맞는 범위를 선택"버튼을 사용하여 장착합니다.
주 1 :. 열 변동 조정에 대한 자세한 내용은 쿡 등 15 읽기
NOTE 2 : 이것은 (알려진 또는 강성 소재) 참조 캔틸레버를 이용하여 캔틸레버의 탄성을 평가하는 직접적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에 사용 된 하나 친절하게 테프 Asnacios (16)에 의해 기증되었다. - 캔틸레버 끝에서 10 % 만니톨 용액 200 μl를 추가합니다. 미러를 사용한 포획의 중앙에 레이저를 재조정.
- 감도를 재 보정 : "교정 관리"메뉴에서, "알 수없는"버튼을 클릭; 반복 2.5을 통해 2.3 단계를 반복합니다.
. 5 데이터 수집 : 명백한 영률지도 제작
. 6 데이터 분석 : 명백한 영의 계수 계산
- 데이터 분석 소프트웨어로 데이터 파일을 연다.
- 단일 맵의 모든 곡선에 같은 분석을 적용하는 "일괄 처리"를 선택합니다.
- 그래서 압입 깊이를 추출하는 "캔틸레버의 휨의 높이를 수정"을 선택합니다.
- 힘이 들여 쓰기의 영역에 비례 가정합니다 "탄성 계수 맞는 기능"을 선택합니다. 들여 쓰기 형태가 포물선이라고 가정 할 포물선하기 위해 "팁 모양"을 설정합니다.
- 팁의 반경을 나타냅니다.
- 는 "확장"곡선보다 지형에 덜 민감하기 때문에 우선적으로 분석을위한 "후퇴"커브를 선택합니다. 프로브의 중요한 고집이 동안이 경우, "후퇴"고집에 민감하다 "확장"곡선을 사용합니다.
- 세트0.5 포아송 비. 눌러에서 분석하고 결과를 저장합니다.
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Representative Results
그림 1에서 우리는 꽃 분열 조직의 전형적인 젊은 계수 맵 (그림 1A 및 1B), 젊은이와 노인 배축 (그림 1C-F), 및 루트 분열 조직 (그림 1G 및 1H)를 제시. 모든 실험에서 압자는 반구형이지만, 다른 공간 해상도를 달성 할 수 있도록 그 반경이 다른 1C 및 1D는 메조 나노 압입 (50 nm의 깊이)과 메조 나노 인 덴터 (50 nm의 반경)에 대한 전형적인 결과를 보여준다.; . cartographs이 배축 표피 세포의 표면 세포 벽에있는 마이크로 이질성을 공개 1A, 1E, 그리고 1G 피규어 꽃 분열 조직, 배축 및 루트 중규모 톱니 (500 nm의 깊이)와 중규모 압자 (500 nm의 반경)에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다; 압자 반경이 메소 압입 평가하는 칸막이 벽의 직경을 초과하기 때문에을주지배사 세포벽의 '명백한'젊은 계수는 (Peaucelle 등. 9,17 및 자세한 내용은 브레이브 룩 등. 10 참조). 마지막으로, 그림 1B는 중규모 톱니 (500 nm의 깊이)와 마이크로 압자 (2.5 μm의 반경)에 대한 cartograph을 보여줍니다; 흥미롭게도,이 해상도의 영상은 9 눈에 띄는 성장을 앞에 기관 개시시 조직 연화을 공개했다.
현재 하이라이트 식물 기관을 개발하여, 물성을 측정 AFM을 사용할 때 일반적으로 발생하는 네 기술적 인 어려움에 부분적 해결책을 제안한다. 첫째, 샘플이 잘못 아가로 오스에 박혀 될 수있다 : 아가로 오스로 덮여 영역이 제대로 (그림 1E 화살표의 가장자리를 참조)을 측정 할 수 없습니다. 이 문제를 해결하려면 단계 1.2.6을 반복하려고합니다. 둘째, 잘못 유리 슬라이드에 고정되는 샘플은 실험하는 동안 이동할 수있다; 다음 탈선 줄무늬는 이미지에 표시 ...에 기인하는왼쪽과 오른쪽 전진 스캔 (그림 1 층) 사이에 역 상관합니다. 이 문제를 해결하려면, 샘플 준비를 반복주의 깊게보십시오. 셋째, 시료의 높이의 Z 범위는 특정 임계 값 미만이어야합니다. 이 수직 Z 방향 시료의 평균 높이에 대한 제한은 없지만, Z 방향 (최고 및 최저 지점 간의 거리)의 높이 범위 미만 15 μM이어야하며, 그렇지 않으면 스캔이 중단 될 것이다 (참조 그림 1B, 설정) AFM의 nanowizard에 있습니다. 스캔하는 동안, AFM 자동 시료의 높이와 일치하도록 캔틸레버의 높이를 조정하지만, 단일 스캔으로 캔틸레버의 높이가 15 μM에 따라 다를 수 있기 때문이다. 이 문제를 해결하려면, 그림 1E-G에서와 같이, 100 μm의 Z-범위를 증가 JPK의 cellHesion 모듈을 사용합니다. 넷째,이 방법은 표면 지형에 민감한 : 시료 표면 더 오리 엔테입니다들여 쓰기의 방향에 D 평행 측정 덜 믿을 수있는. 도 1G-H로 표시 루트 샘플에서 세포벽이 뿌리의 장축에 평행 한 스캔의 상하 가장자리에서 보이지 않는다 : 여기서 루트면은 작게 압입에 직교되는 것이다. 분열 조직에서 유사하게, 꽃 봉오리 가장자리의 세포 벽이 제대로 (그림 1A)를 측정되지 않았다. 메조 나노 압입 (그림 1C)의 경우, 다시 지형 효과는 관찰 : 세포의 가장자리를 잘못 소프트 정확하게 것으로 측정되는 곳에 떨어져 캔틸레버의 평면에서 세포 곡선. 이러한 지형 효과를 설명 할 수있는 데이터 분석 도구는 앞으로이 이슈를 해결할 수 있지만, 이러한 도구는 아직 사용할 수 없습니다.
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Discussion
식물에서, 기계적 특성 변화는 성장 및 형태 형성을 연출에서 중요한 역할을한다. 현재까지이 식물 성장을 제어하는 유전 및 화학 네트워크를 이루는에 큰 진전되고 있지만, 이러한 네트워크에 기여하고 기계적 특성의 변화에 의해 영향을받는 방법에 대한 우리의 지식은 초보했다. 이 방법은이 공백을 채울 할 수있게해야하고, 그래서 식물의 성장이나 형태 형성의 모든 측면을 연구 과학자에 강한 관심을 끌 수있을 것입니다. 우리는 지금 문제 및 제한 방법, 그리고 미래의 전망을 요약합니다.
프로토콜에서 가장 어려운 단계는 샘플 준비입니다. 이 샘플은 단단히 아가로 오스와 유리 슬라이드에 고정해야하지만,이 아가 로스를 측정 할 수있는 샘플의 모든 영역을 커버하지 않아야합니다. 미묘 건조를 방지하기 위하여 조직의 손상을 방지하기 위해 한층 제제 (분 이내) 충분히 빠르게 완료 할 수있다 : 부상차 가뭄은 셀 벽 (18)의 기계적 특성에 돌이킬 수없는 변화로 이어질 것으로 예상된다. 또 다른 도전 단계는 올바른 AFM 마이크로 들여 쓰기 설정을 선택하는 것입니다 : 과학적 질문에 따라, 조직, 세포, 또는 세포 내 해상도가 다른 압자와 압입 깊이를 달성 할 수있다. 자세한 내용은 9, 10을 참조하십시오.
이 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째,이 방법은 장기의 표면에 기계적 성질을 측정 제한된다; 절제된 장기의 내부 영역을 측정하기위한 프로토콜을 개발하려는 시도가 우리 실험실에서 진행되고있다. 둘째, 높은 변수 지형 차별화 된 조직은 측정하기가 매우 어렵습니다; 예를 들어, 상체 (trichome)는 잎의 표피에 AFM 팁의 액세스를 차단하고 줄기와 유사하게, 루트 머리카락 뿌리 표피에 AFM 팁의 액세스를 차단합니다. 셋째, 방법이 가장 좋은 길이 100 μm의 르의 샘플에 적용된다SS; 그것은 최대 1mm까지 큰 샘플들에 사용될 수 있지만, (도 1D 및 1E에 도시 된 바와 같이)이 시간 소모적 순차 제작법 측정을 필요로한다. 마지막으로, AFM 측정 세포벽의 기계적 복잡성의 일부만 : 셀 벽이 변형의 유형 (압축 VS 예 장력)에 따라 서로 다른 기계적 특성을 보여줄 수 복잡한 겔이다하면서, 압축 압입 실험에 한한다. 처음에는 압축에 제한이 방법은 프로세스를 스트레칭 turgor 유래 세포 벽, 이는 성장에 알리기 위해 비 또는 원격으로 할 수있는 것 같다. 그러나 분열 9, 19 또는 배축 (게시되지 않은 데이터)에 대한 우리 자신의 초대형 측정에 명백한 젊은 계수 및 성장을 통해 측정 된 탄성 사이의 놀라운 상관 관계를 나타냅니다. 우리는 미래에이 기술의 개발이 수수께끼를 이해하는 데 도움이되기를 바랍니다.
방법은 위에서 설명한대로 만, 식물 조직의 탄성 기계적 특성의 특정 측면을 측정 여기에 제시된. 그러나 조직 생활도 viscously 행동과 결합 된 점성과 탄성 거동은 성장과 발전 16,20 중요 할 것으로 예상된다. 지금까지 언급되지 않은, 우리는 시간에 따라 수십 초 이상했다 마이크로 들여 쓰기 AFM하는 세포 벽의 반응을 관찰 -이 응답은 점탄성 특징으로했다. 우리의 이전 연구에서 우리는이 점탄성 응답 9를 평가하는 하나의 AFM 방법을 제시했다. 조직의 또 다른 중요한 성장 매개 시설은 세포의 지방 팽압입니다. 팽압을 측정하기 위해, 우리는 유사한 도전에 직면 : 조직에서 중규모 해상도로 측정하는 기술은 아직 존재하지 않습니다. 식물에 사용되는 압력 microprobes은 분열 세포의 사이즈 (5 μM) (12), (21) 인 유리 팁 반경에 의해 한정되는, 최근까지,되었습니다. 다른연구의 매우 유망한 수단이 아닌 plasmolyzed 조직에서 사용하기 위해이 AFM 방법을 개발하는 것입니다; 우리는 단일 세포 팽압 및 조직의 성장 사이의 관계를 나타 내기 위해, 이러한 방식으로, 희망한다. (24) -이 방법은 기본적으로 다른 장치를 사용하여 개별 셀 (22)에 사용되는 들여 쓰기를 통해 이미 개발 AFM의 turgor 측정에 적용됩니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 많은 도움이 토론 이브 Couder에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 캔틸레버와 토론의 교정을 위해 테프 Asnacios 감사합니다. 우리는 비판적 읽기 리사 윌리스, 엘리엇 Meyerowitz, 올리버 Hamant 감사합니다. 이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0062/2005-C에 의해 부분적으로 투자되었습니다; 직원은 국립 드 라 공들인는 '' '' Growpec, ''과 '' Mechastem를 투영합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
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