Abstract
Vi beskriver en nyligen utvecklad metod för att mäta mekaniska egenskaper hos ytorna av växtvävnader med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM) mikro / nanointryckningar, för en JPK AFM. Närmare bestämt i detta protokoll mäter vi den skenbara elasticitetsmodulen av cellväggarna på subcellulära upplösningar i olika regioner på upp till 100 ^ m x 100 | im i floral meristem, hypokotyler och rötter. Detta kräver noggranna förberedelser av provet, rätt val av mikro indentorer och indrag djup. Att redogöra för cellväggs egenskaper endast är mätningar som utförs i starkt koncentrerade lösningar av mannitol för att plasmolyze cellerna och på så sätt ta bort bidraget av cellsaftspänningen.
I motsats till andra ännu existerande tekniker, genom att använda olika indentorer och indrag djup medger denna metod samtidig multiskalmätningar, Men flera begränsningar kvarstår: den metoden kan bara användas på relativt små prov (cirka 100 nm i diameter) och endast på externa vävnader; metoden är känslig för vävnads topografi; den mäter endast vissa aspekter av vävnad komplexa mekaniska egenskaper. Tekniken utvecklas snabbt och det är troligt att de flesta av dessa begränsningar kommer att lösas inom en snar framtid.
Introduction
Tillväxt i växter uppnås genom den samordnade expansion av de styva cellväggar som omger varje cell av organismen. Ackumulerande bevis tyder på att det är genom ändring av cellväggen kemi som växter styr expansionen lokalt. Utbyggnaden är tänkt att drivas främst av belastning på cellväggarna, som orsakas av cellens höga saftspänningen; denna stam svar på saftspänningen styrs av de mekaniska egenskaperna hos cellväggarna 1. Lite är känt om dessa mekaniska egenskaper och hur de förändras under utveckling. Dessutom lite är känt om hur dessa mekaniska egenskaper styrs och om återkopplingar bidrar till att förändra cellväggen kemi på ett sätt som uppenbarligen samordnas över en vävnad. Om vi ska förstå sambandet mellan kemiska och mekaniska förändringar i växtcellväggar under utveckling, och i slutändan hur dessa mikroskopiska interaktioner styr en anläggningKrävs makroskopisk tillväxt är en metod som kan övervaka mekaniska egenskaper hos cellväggarna i utvecklings organ vid cell-eller vävnadsskala.
Den atomkraftsmikroskopi (AFM) metod som beskrivs här, vilket är baserat på mikrometer eller nanometervävnadskompressioner eller fördjupningar, har utvecklats just för att mäta de mekaniska egenskaperna hos cellväggarna i utvecklingsorganen samtidigt vid subcellulära upplösningar och över hela regioner i vävnad. Andra metoder har antingen en upplösning som är för låg eller för hög: extenso endast kan mäta de genomsnittliga mekaniska egenskaperna hos en hel vävnad vid millimeterskala 2-4, en skala som är till exempel för stora för att mäta tidiga händelser i organogenesen; den microindenter kan göra mätningar på subcellulär upplösning på nanometerskala, men den är begränsad till att mäta isolerade celler och inte grupper av celler eller organ 5-7. Med AFM, den kräverd vävnad, cellulär och subcellulära resolutioner kan uppnås 8-10. Nyligen flera protokoll har utvecklats specifikt för att mäta mekanik växter vävnad som också skulle kunna användas 11, 12.
Vi kommer att presentera här hur man utvärderar elasticiteten hos vävnaden genom mätning av den skenbara elasticitetsmodulen 13.
The Young modul används ofta för att beskriva styvheten hos ett material. Under liten deformation den kraft som krävs för att deformera ett material är proportionell mot arean av indrag. The Young modul är denna koefficient. I fallet med ett kontinuerligt homogent material samma koefficient kommer att mätas oavsett typen fördjupning (storlek och form), men kommer att förändras med hastigheten på mätningen. I fallet med den komplexa strukturen av växter vävnad, har vi observerat så långt att den kraft som är proportionell mot den deformation som gör det möjligt att fastställaen koefficient på proportionalitet som vi namn "skenbar elasticitet". Till skillnad från kontinuerliga medier i växterna, är det uppenbart elasticitet känslig för storleken på indraget. Det motsvarar inte den unga moduler av en ren cellvägg. Den beskriver bäst elasticiteten i byggnadsställningar för cellväggen av vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered glas för Monterings Sample
- Förbered imbedding agaros medel: 0,7% lågsmältande agaros i 10% mannitol (i vatten).
- Med hjälp av en stark metallinstrument (t.ex. borrspets, lime), etsa ut en 0,5 x 0,5 cm stort område i centrum av en mikroskopglas. Eller i stället, limma en liten bit av glas lamell (ca 20 x 200 | im) till objektglaset med hjälp av Araldite lim. OBS: Detta luckrar ytan för att underlätta vidhäftningen av agaros för att säkerställa att agarosen medie pinnar eller korrigeringar till objektglaset. Denna bild kan återanvändas.
- Placera en droppe av ca 20 l av imbedding agaros media på det etsade regionen av glasskiva. Detta ger ett tunt skikt av agaros.
- Förvara glasskiva i en fuktig låda och vänta på agaros media stelna.
2. Analysera och Montage meristem Prov
- Microdissect meristem för konfokal fantasing: ta bort blomknoppar en efter en från stammen genom att dra ner dem med ultrafina pincett. Det är viktigt att ta bort alla blomknoppar till knopparna som inte uppvisar foderblad (dvs. P1 primordia 14).
- Med hjälp av ett rakblad eller spetsen på pincetten, skär meristem bort från stammen. Snittet bör vara parallell med den region av meristem yta som skall mätas med AFM. Den erhållna toppen skall vara mellan 300 | im och 600 | im hög för att passa under AFM spets.
- Skjut spetsen in i filmen av agaros media framställts i steg 1.1.4. Välj en position på objektglas / agaros och tryck försiktigt så att meristem är både i direkt kontakt med glasskivan och skjuter ut från agaros. Det är viktigt att positionera meristem i agarosen inom de få sekunder som följer dess snitt från stammen. OBS: Detta är för att förhindra att den meristem från att torka. I detta skede kommer meristem stå i en crack eftersom agarosen bröt vid tillämpningen av trycket.
- Förbered flera meristems detta sätt för batch bildbehandling, förutsatt att de är av samma höjd och är placerade mindre än 500 nm från varandra på bilden. Håll beredda meristem i fuktiga rutan medan dissekera ytterligare prover.
OBS: Det begränsar variationen kommer från kalibreringen. Helst 2 prover av varje tillstånd kan förberedas och mätas slumpvis. Än så länge finns det ingen observerad effekt av batch bildbehandling på mätningen (stress svar). Detta kan vara tack vare den utspädning av stresssignaleringsmolekyler i agar och / eller monteringslösning. Alternativt stressvaret är densamma oavsett den mängd prov som beretts. - Innan vi går vidare till nästa steg, se till att gränsen mellan meristem och blomsterlökar är torr. Om inte, ta försiktigt bort överflödigt vatten med hjälp av filterpapper. Detta bör förhindra att i nästa steg som det smältaagaros översvämningar provet på grund av kapillärkraften krafter.
- Med en 20 l pipett, tillsätt tillräckligt smält montering agaros för att fylla i sprickan som skapats i steg 1.2.3. och att omge varje meristem. Agarosen ska nå den nivå av ärret för det borttagna blomknopp (primordium). För att uppnå detta kan det vara nödvändigt att lägga till agaros vid vardera änden av sprickan.
- När agarosen läggs, kommer det snabbt strömma in i sprickan; med användning av pipetten, suga bort en del av den smälta monterings agaros för att säkerställa att meristem är den högsta punkten på bilden. Detta fixar meristem så att den inte kan röra sig under avbildning.
3. Monterings Root eller hypokotyl Prov
- För rötter och hypokotyler behövs ingen dissektion. I den tunna filmen av agaros på den förberedda glasskiva, göra ett spår direkt ovanför en etch i glaset eller längs en glaslamellen. Placera rot eller hypokotyl i detta spår att säkerställa att den är i kontakt med denglas utefter hela sin längd.
- Innan vi går vidare till nästa steg, se till att provet är torrt på dess yta. Om inte, försiktigt bort överskott av vatten med hjälp av filterpapper.
- Lägg smält montering agaros runt provet som i steg 1.2.6.
4. AFM Förberedelser och känslighet kalibrering (för en JPK Nano AFM)
- Montera en fribärande på AFM. Den fribärande bör monteras med rund indenter. Radien kommer att bestämma x, y, z-upplösning och inbuktningen djup där noggrann mätning kan arkiveras.
- För att ta meso-nanoskala mätningar vid ytan epidermis s, använd en 50 nm radie runt indenter; att ta mesoskaliga mätningar, använd en 0,5 ìm radie runt indenter; att ta mikroskala mätningar (över 2-3 celler), använd en 2,5 ìm radie runt indenter.
- Placera lasern vid spetsen av fribärande. Rikta lasern mot mittenav captor använder spegeln.
- Placera en ren glas under AFM.
OBS: Följande är inställd på att omvandla signalen från laser position på AFM-receptorn i en deformering av fribärande och, genom att utvärdera fjäderkonstanten av fribärande, att översätta det till en kraft. - Metoden med ett mål kraft "börvärde" av 1 V.
- Välj "kraft spektroskopi". Gör en fördjupning genom att ställa in den maximala "relativ börvärde" till 2 V, den "utsträcka hastighet" till 40 ^ m / sek, och "z längd" till 5 um.
- Från menyn "kalibrering manager", markerar den linjära delen av terminskurvan för att passa känsligheten med "välj fit intervall"-knappen. Den "relativa börvärde" bör omvandlas från "volt" till "meter".
- Från menyn "kalibrering manager", välj "fjäderkonstant" för att utvärdera elasticity av fribärande med användning av termiska fluktuationer. Tryck på "run" för att få den spektraltäthet tomt på fribärande. Hitta resonanstoppen med den lägsta frekvensen. Montera den med hjälp av "välja lämplig intervall"-knappen.
OBS 1: För mer information om den termiska fluktuationer tuning, läste Cook et al 15.
NOT 2: Det är att föredra att använda en direkt metod för att utvärdera elasticitet av fribärande med användning av en referens fribärande (eller ett material med känd styvhet). Den som används här var vänligt donerad av Atef Asnacios 16. - Lägg till 200 l av 10% mannitollösning under konsolspetsen. Rikta lasern till mitten av captor använder spegeln.
- Kalibrera känsligheten: från menyn "kalibrering manager", klicka på "okänd"-knappen; Upprepa steg 2.3 till 2.5.
. 5 Datainsamling: Skenbar Youngs modul Kartografi
. 6 Dataanalys: Skenbar Youngs modul Beräkningar
- Öppna datafilen i dataanalys programvara.
- Välj "satsvis bearbetning" för att tillämpa samma analys för alla kurvor på en enda karta.
- Välj "rätta höjden för böjningen av cantilever" så att extrahera inbuktningen djup.
- Välj "Youngs modul fit funktion" som kommer att ta kraften är proportionell mot arean av indrag. Ställ in "spetsform" att parabolisk att anta att indraget formen är en parabolisk.
- Indikera radien hos spetsen.
- Välj företrädesvis den "indragning" kurvan för analysen, eftersom den är mindre känslig för topografi än kurvan "förlänga". Men om det finns en betydande fastklibbning av sonden under "indragning", använder "utsträcka" kurvan, som är okänslig för att fastna.
- SetPoisson-kvoten till 0,5. Tryck på analysera och spara resultatet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 presenterar vi typiska Unga modul kartor över blomster meristems (figur 1a och 1b), unga och gamla hypokotyler (figur 1C-F), och rot meristem (figur 1G och 1H). I alla experiment indenter är halvsfärisk, men dess radie skiljer sig så som kan uppnås olika rumsliga upplösningar Figurer 1C och 1D visar typiska resultat för meso-nano indentorer (50 nm radie) med meso-nanoskala fördjupningar (50 nm djup). . de cartographs avslöjar mikroskala heterogeniteter i ytan cellväggar hypokotyl epidermalceller Figurerna 1A, 1E, och 1G visar typiska resultat för mesoskaliga indentorer (500 nm radie) med mesoskaliga fördjupningar (500 nm djup) för blommig meristem, hypokotyl och rot; Observera att eftersom indenter radie överstiger diametern hos cellväggen denna meso-indrag utvärderar"uppenbara" Unga moduler av anticlinal cellväggar (se Peaucelle et al. 9,17 och Braybrook et al. 10 för detaljer). Slutligen visar figur 1B en cartograph för mikroskala indentorer (2,5 ìm radie) med mesoskaliga fördjupningar (500 nm djup); intressant, bildhantering på denna resolution avslöjade vävnads uppmjukning under organ initiering som föregick synliga 9 tillväxt.
Vi lyfter nu och föreslå dellösningar till fyra tekniska svårigheter som ofta uppstår vid användning av AFM för att mäta egenskaperna för att utveckla växtorgan. Först får Prover vara felaktigt inbäddad i agaros: regioner som är täckta med agaros kan inte mätas korrekt (se kanterna på figur 1E pil). För att lösa detta, prova att upprepa steg 1.2.6. För det andra, kan prov som felaktigt är fasta till glasskiva flytta under experimentet; då avvikande ränder visas på bilderna SOM SKALL BETALASatt Decorrelation mellan vänster och höger framåt skanningar (Figur 1F). För att lösa detta, prova försiktigt upprepa Provberedning. För det tredje måste Z-sortiment av provets höjd vara under en viss nivå. Det finns ingen begränsning på provet genomsnittliga höjd i vertikal z-riktningen, men det varierar i höjd i z-riktningen (avståndet mellan den högsta och lägsta poäng) måste vara mindre än 15 um, annars skanningen avbryts (se Figur 1B, inställningarna är i AFM Nano). Detta beror på att, under avsökningen, justerar AFM automatiskt cantilever höjd för att matcha höjden av provet, men i en enda skanning fribärande längd kan variera med endast 15 | im. För att lösa detta med hjälp av JPK cellHesion modulen, vilket ökar z-intervallet till 100 nm, vilket visas i figur 1E-G. För det fjärde, är metoden känslig för yt topografier: ju mer provytan är oriented parallell med riktningen av indrag, den mindre tillförlitlig mätningarna. I det prov som rot presenteras i Figur 1G-H, cellväggarna är parallella med den långa axeln av roten är inte synliga på de övre och undre kanterna på skanningen: här rotytan är långt från att vara vinkelrät mot inbuktning. I meristem likaså cellväggar vid kanterna av blommande knoppar var inte korrekt uppmätt (Figur 1A). För meso-nanoskala inbuktningar (Figur 1C), återigen denna topografiska effekt observeras: cellernas kanter är felaktig mätt som att vara mjukt just där celler kurva bort från planet av fribärande. En dataanalys verktyg som kan redogöra för dessa topografiska effekter skulle kunna lösa detta artefakt i framtiden, men ett sådant verktyg är inte tillgängliga ännu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I växter, förändrade mekaniska egenskaper spelar en stor roll i att styra tillväxt och morfogenes. Hittills har det skett stora framsteg i att riva upp de genetiska och kemiska nätverk som styr växternas tillväxt, men kunskapen om hur dessa nätverk bidrar till och påverkas av förändringar i de mekaniska egenskaperna är rudimentär. Denna metod bör göra det möjligt för oss att fylla denna lucka, och så det borde vara av stort intresse för forskare som studerar alla aspekter av växters tillväxt eller morfogenes. Vi sammanfattar nu de utmaningar och metodens begränsningar och framtidsutsikter.
Det mest utmanande steg i protokollet är provberedning. Provet skall vara stadigt fastsatt på glasskiva med agaros men detta agaros får inte täcka alla områden av provet som skall mätas. Dessutom har beredningen slutföras tillräckligt snabbt (inom minuter) för att förhindra uttorkning och noga för att förhindra vävnadsskada: såra ennd torka förutspås leda till irreversibla förändringar i de mekaniska egenskaperna hos cellväggen 18. Ett annat utmanande steg är att välja rätt AFM mikro-indrag inställningar: Beroende på den vetenskapliga frågan, kan vävnad, cellulär eller subcellulär upplösning uppnås med olika indentorer och indrag djup. För ytterligare information se 9,10.
Metoden har flera begränsningar. För det första är metoden begränsad till mätning av mekaniska egenskaper hos ytorna av organ; ett försök att utveckla ett protokoll för att mäta inre regionerna av resekterade organ pågår i vårt laboratorium. För det andra, differentierade vävnader med en mycket varierande topografi är mycket svåra att mäta; exempelvis trichomes blockera AFM spets tillgång till epidermis hos blad och stjälkar och på liknande sätt, rothår blockera AFM spets åtkomst till root epidermis. För det tredje, är den metod som bäst tillämpas på prov med längden 100 nm eller less; den kan användas på större prover upp till 1 mm, men detta kräver tidskrävande sekventiella kartografiska mätningar (som visas i figur 1D och 1E). Slutligen AFM åtgärder endast en del av den mekaniska komplexiteten i cellväggen: det är begränsat till tryck indrag experiment, medan cellväggarna är komplexa geler som kan visa olika mekaniska egenskaper beroende på den typ av deformation (t.ex. spänning vs komprimering). Först denna metod begränsad till kompression verkar vara icke-eller fjärrstyrt med förmåga att informera om tillväxt, vilket är ett turgor härledd cellväggsträckningsprocessen. Men till vår egen supersize mätningen i meristem 9, 19 eller på hypokotyl (opublicerade data) indikerar en fantastisk korrelation mellan elasticitet mäts genom den sken elasticitet och tillväxt. Vi hoppas att det i framtiden kommer utvecklingen av denna teknik bidra till att förstå denna gåta.
Denmetod som presenteras här bara mätte vissa aspekter av de elastiska mekaniska egenskaper hos växter vävnader, som förklarats ovan. Men levande vävnader beter sig också visköst, och den kombinerade visko-och elastiskt beteende förväntas vara viktiga för tillväxt och utveckling 16,20. Hittills onämnda, observerade vi svaren från cellväggar att AFM mikro fördjupningar som var tidsberoende under tiotals sekunder - detta svar karakteriserades som viskoelastiska. I vårt tidigare arbete presenterade vi en AFM metod för att utvärdera denna viskoelastiska svar 9. En annan viktig tillväxt-medla egenskap hos en vävnad är den lokala saftspänningen av celler. För mätning saftspänningen, vi står inför liknande utmaningar: en teknik som mäter på mesoskaliga upplösning över vävnader ännu inte existerar. Tryckmikropelare som används i anläggningar var, fram till nyligen, begränsas av glasspetsradie, vilket är storleken på meristematic celler (5 nm) 12, 21. En annanmycket lovande med forskningen är att utveckla denna AFM metod för användning på icke-plasmolyzed vävnad; Vi hoppas på detta sätt, för att avslöja relationen mellan enskild cell saftspänningen och vävnadstillväxt. Denna metod kommer i princip gälla för den redan utvecklade AFM turgor mätning genom indrag med hjälp av andra enheter och användas på enskilda celler 22 - 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi ger särskilt tack till Yves Couder för många hjälp diskussioner. Vi tackar Atef Asnacios för kalibrering av utliggare och diskussion. Vi tackar Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, och Oliver Hamant för kritisk läsning. Detta arbete har finansierats delvis av Human Frontier Science Program bidrag RGP0062/2005-C; Agence Nationale de la Recherche projekt'' Growpec,'' och'' Mechastem''.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM | JPK | NanoWizard | All the 3-generation are able to do the work with the same preferment. |
| AFM stage | JPK | CellHesion | Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning). |
| AFM optics | JPK | Top View Optics | Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope. |
| Stereo microscope | Leica | M125 | Any type of stereo microscope could do. |
| 150 nm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | R150-NCL-10 | To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use. |
| 1 µm mounted cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | SD-Sphere-NCH-S-10 | To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis. |
| Tipless cantilever | Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland | TL-NCH-20 | To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever. |
| 5 µm silicon microspheres | Corpuscular | C-SIO-5 | |
| Araldite | Bartik S.A. 77170 Coubet, France | Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever. | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410 | BP160-100 | 34-45 °C gelation temperature |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA | M4125-500G | |
| 2 Stainless Steel No. 5 Tweezers | Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland | 951199 |
References
- Cosgrove, D. J. Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls. Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).
- Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin. Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).
- Durachko, D. anielM., C, D. J. Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin. J. Vis. Exp.. , 25 (2009).
- Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants. Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).
- Parre, E., Geitmann, A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense. Planta. 220, 582-592 (2005).
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental biology. 334, 437-446 (2009).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).
- Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth. Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).
- Agudelo, C. G., et al. TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).
- Miedes, E., et al. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls. Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).
- Byrne, M. E., et al. Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis. Nature. 408, 967-971 (2000).
- Cook, S. M., et al. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).
- Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. Creep function of a single living cell. Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).
- Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited. Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).
- Mittler, R., et al. ROS signaling: the new wave. Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. PLoS. 8, e57813 (2013).
- Asnacios, A., Hamant, O. The mechanics behind cell polarity. Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).
- Meister, A., et al. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond. Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).
- Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells. Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).
- Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth. PloS one. 6, e18549 (2011).
- Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling. The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).
