Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51322
Automatic Translation
1, 2
1Molecular Pharmacology and Pathology Program, Department of Pathology & Bosch Institute, University of Sydney, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Biomedical Sciences, Monash University

Summary

Аскорбат играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только вышли на свет в последние годы. Здесь мы опишем средне-пропускную способность, конкретное и недорогой микропланшетного анализ для определения как внутри-и внеклеточной аскорбиновой кислоты в клеточной культуре.

Abstract

Витамин С (аскорбиновая кислота) играет многочисленные важные роли в клеточном метаболизме, многие из которых только приходят на свет в последние годы. Например, в головном мозге, аскорбиновая кислота действует в нейропротективного и нейромодуляторного образом, что включает в себя аскорбат велосипеде между нейронами и вицинальных астроцитов - отношения, которые, как представляется, решающее значение для мозга аскорбат гомеостаза. Кроме того, новые данные наводит на мысль, что аскорбиновая кислота имеет значительно расширенную роль в регуляции клеточного и системного метаболизма железа, чем в классическом признается. Растущее признание интегральной роли аскорбиновой кислоты в нормальной и разрегулированной клеточном и организменном физиологии требует ряд средне-пропускной и высокочувствительных аналитических методов, которые могут быть выполнены без необходимости сильно дорогой специального оборудования. Здесь мы предлагаем четкие инструкции для средней пропускной, конкретные и относительно недорогой микропланшетного анализ для определения бой внутри-и внеклеточной аскорбиновая кислота в клеточной культуре.

Introduction

Открытие химической природы аскорбиновой кислоты (витамин С), и его идентификации в качестве долгожданного "антицинготными фактора», Альберт Сент-Дьерди и другие в статьях, опубликованных с 1928 по 1934 1 были знаковые события в истории биохимии. В самом деле, эти открытия способствовали Сент-Дьерди присуждением Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1937 году. Постоянно расширяющийся набор ролей для аскорбиновой кислоты в животных и физиологии растений, а также на здоровье человека, по-прежнему являются субъекты активная научная Расследование и споры.

L-аскорбат является обильное физиологический восстановитель и кофактор фермента в системах млекопитающих, и вносит свой ​​вклад в многочисленных хорошо определенных ферментативных реакций с участием коллагена гидроксилирование, карнитин и норадреналина биосинтез, метаболизм и тирозина пептидного гормона, амидирование 2. Интересно, монтаж evideNCE предполагает, что аскорбат играет важную роль в стимулировании других железа зависит от диоксигеназ, такие как пролил и аспарагинила гидроксилазы, вовлеченных в гидроксилирование и ориентации из гипоксии-индуцируемых факторов (ОПО) 1α 2α и 3. В недавнем докладе о том, что аскорбиновая кислота играет важную роль в Т-клеточной созревания до влияние хроматина деметилирования через его деятельности в стимулировании ядерных гидроксилаз, Jumonji C (JmjC) белки домена; последний из которых, кажется, требуют аскорбат для полноценной деятельности 4. Действительно, стимуляция таких ферментов по аскорбат-видимому, происходит такой же механизм для стимуляции аскорбата из HIF и коллагеновых гидроксилазы. Среди других классических эффектов, аскорбат вносит значительный вклад в клеточной антиоксидантной качестве водорастворимого цепи разорвать акцептора радикалов 5 и утилизации плазматической мембраны α-токоферол (витамин Е) через снижению α-tocopheroxyl радикал 6, шHICH играет важную роль в защите от перекисного окисления липидов мембраны 7. Важно отметить, что хотя большинство млекопитающих способны процессов нового печени синтеза аскорбиновой кислоты из D-глюкозы, высшие приматы, морские свинки и некоторые летучие мыши зависит от пищевых источников витамина 8. Это связано с инактивации гена Gulo, то ортологи которых в незатронутых млекопитающих кодирует фермент, γ-лактон gulono-оксидазы 9-13. Этот фермент необходим для окончательного реакции в аскорбат биосинтеза глюкозы из 13.

После транспортера-опосредованной всасывания из просвета кишечника в организме человека, аскорбиновая кислота распространяется по всему телу по кровеносной системе. Витамин обычно можно найти в восстановленной форме в миллимолярных концентрации внутри клеток (с исключением эритроцитов, в которых концентрации обычно похож на преобладающей концентрации в плазме), и в микромолярном концentrations (например 50-200 мкМ) в большинстве внеклеточных жидкостях 14,15.

В физиологических условиях, аскорбиновая кислота обычно претерпевает обратимое одноэлектронную окисление в аскорбил свободных радикалов (AFR, также известный как monodehydroascorbate или semidehydroascorbate). В то время как AFR является относительно стабильный радикал 16, в отсутствие его быстрого одноэлектронного снижению ферментативной обратно в аскорбат, два AFRs может дополнительно dismutate одному аскорбата и один дегидроаскорбат (DHA) 9,13,17. В внутрь клетки, окисление продукта двухэлектронного аскорбата, DHA, могут быть быстро снижается обратно в аскорбат на глутатион-и NAD (P) H-зависимой ферментной и не ферментативных реакций 13.

В то время как в классическом принято считать, что только значительную роль аскорбиновой кислоты в метаболизме железа является стимулирование диетическое всасывание не тема железа 18, мы и другие предоставили доказательств сtrongly предполагая, что аскорбат играет значительно более значительную роль в метаболизме этого металла. Во-первых, аскорбат, который высвобождается аскорбата-изобилует клеток по-видимому, играют важную роль в модуляции поглощения не-трансферрином железа связаны клетками 19,20, и совсем недавно данные показывают, что аскорбиновая кислота также модулирует поглощение трансферрином железа неизбежно 21 клетками, последний из которых соответствует основным физиологическим захватывающие железо маршрута 22.

Аскорбат необходим для нормального центральной нервной системной функции у млекопитающих 23,24. Вместе с коры надпочечников, гипофиза, вилочковой, сетчатки и желтого тела, мозг содержит высокие концентрации аскорбата по отношению к другим тканям организма 23,25-27. Кроме того, воздействие как астроциты 28,29 и нейроноподобных элементов 30 на глутамат, как известно, вызывают высвобождение аскорбата во внеклеточное пространство, где ascorbatе, как полагают, чтобы помочь защитить нейроны против индуцированной глутаматом нейронов дисфункции 31. В то время как точный механизм глутамат-индуцированный аскорбат выхода из астроцитов неизвестно, недавно мы представили доказательства, указывающий участие клетки опухоль, вызванная захвата глутамата на астроцитов глутамата и аспартата транспортера (GLAST, также известный возбуждающих аминокислот транспортер изоформы 1 [EAAT1 ] у людей) и, как следствие активация объема чувствительных осмолита и анионных каналов (VSOACs), которые проницаемы для малых органических анионов, таких как аскорбиновая кислота 32. Молекулярные тождества плазменных мембранных каналов, участвующих в образовании VSOAC остаются должны быть определены 33,34.

Хотя многие тесты были разработаны для определения аскорбиновой кислоты в биологических образцах, которые включают в спектрофотометрических, флуорометрические и хроматографические анализы 35,36, есть много изменчивость в специфичности, чувствительности, interferencэ на химических загрязнителей, эффективного линейного диапазона и стабильности аналита конечной точки. Кроме того, другие важные факторы, влияющие на выбор анализа являются быстрота, простота в использовании и доступ к относительно специализированного оборудования, таких как жидкостной хроматографии высокоэффективной (ВЭЖХ) аппарата.

Здесь мы приводим простой и очень специфический колориметрический микропланшет-анализ для определения внутриклеточного аскорбата в культивируемых клетках, а также в качестве отдельного анализа для определения аскорбат-отток из культивируемых клеток. Последний анализ направлен на обойти проблему недооценки аскорбат освобождение от клеток из-за быстрого обратного захвата высвобожденного аскорбата по транспортеров аскорбата натрия (в зависимости от SVCTs). Хотя оба этих метода появились в некоторых из наших предыдущих публикаций 19,20,32,37,38, эта рукопись обеспечивает явное набор инструкций и руководящих принципов для их эффективного выполнения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Определите внутриклеточных аскорбиновая кислота в культивируемых клетках

  1. Клеточная культура и сбор урожая
    1. Расти суспензии (например эритролейкемии человека, К562) или прилипшие клетки (например, первичные астроциты) с использованием стандартных процедур культуры 19-21,32,38. Примечание: для обеспечения клетки содержат аскорбиновой кислоты, загрузить культивируемых клеток с аскорбиновой кислотой либо как аскорбиновая кислота или DHA 33,39.
  2. Создайте аскорбат содержащих клеточного экстракта
    1. Инкубировать соответствующее количество забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) промывают суспензии или адгезивные клетки с 450 мкл охлажденного на льду буфера проницаемости клеточной мембраны [КПБ; 0,1% (вес / объем) сапонин в PBS; 4 ° C]. Примечание: Определить количество клеток, необходимых для получения значения оптической плотности в пределах линейного диапазона анализа (см. ниже) эмпирически конечному пользователю. Примечание: можно также использовать тканевые экстракты (см. Обсуждение для получения дополнительной информации).
    2. AgitaTE клетки на льду в течение 10 мин, чтобы обеспечить тщательное клеточный лизис.
    3. Создание осветленного аскорбат, содержащие внутриклеточный экстракт удалением клеточного дебриса путем центрифугирования неочищенного лизата при 16000 х г в течение 5 мин в микроцентрифуге охлажденном (4 ° C).
    4. Осторожно удалить 4 х 100 мкл аликвоты из каждого образца и добавить к горизонтальной последовательности скважин в 96-лунками с плоским дном, который содержит либо 25 мкл / лунку PBS ("-АО") или только 25 мкл / лунку 45,5 U / мл маточного раствора L-аскорбиновая кислота-оксидазы (АО) в PBS ("+ АО"). Примечание: это должно быть сделано параллельно с подготовкой стандартов (см. ниже).
  3. Аскорбат строительство стандарт-кривой (должен быть построен заново для каждого анализа)
    1. Подготовка исходного раствора 10 мм аскорбиновой кислоты в ледяной PBS. Примечание: Убедитесь, концентрацию аскорбиновой кислоты спектрофотометрически с использованием кварцевой кювете с 1см путь длиной в 265 нм (коэффициент ослабления = 14,5 мМ -1 см -1) 40.
    2. Тщательно подготовить серию стандартов аскорбиновой кислоты от 0 до 20 мкм.
    3. Параллельно с шагом 1.2.4, осторожно удалить 4 × 100 мкл аликвоты из каждого стандарта и добавить к горизонтальной последовательности скважин в 96-лунками с плоским дном, содержащего 25 мкл / лунку PBS ("-АО") или 45,5 Ед / мл стоковый раствор АО в PBS ("+ AO"). Примечание: 100 мкл вышеуказанных стандартах аскорбата будет содержать 0-2 нмоль аскорбата. Пожалуйста, обратите внимание, цель АО является контроль за вклад без аскорбиновой кислоты восстановителей в феррицианида снижение.
  4. Определите внутриклеточный аскорбат - Шаг 1: выборочно удалить аскорбат и количественно окисляется аскорбат с феррицианида
    1. Траекторно смешать 96-луночного планшета при 550 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 5 мин в темноте, покрывая пластину в фольге. Примечание: Тего шаг должен окислять все аскорбат в "+ АО" скважин до ДГК. Скважины "-АО" должен быть неизменным.
    2. Добавить 50 мкл 3,5 мМ кровяной соли (далее по тексту "феррицианида") в PBS в каждую лунку. Конечный [феррицианид] = 1 мМ. Примечание: Используйте multipipettor.
    3. Траекторно смешивать пластины при 550 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение еще 5 мин в темноте. Примечание: Этот шаг должен привести к снижению феррицианида в ферроцианид на аскорбата в стехиометрическом соотношении 2 молекулы феррицианида снижение на 1 молекулу аскорбиновой кислоты окисленного.
    4. Сразу же добавить 25 мкл свежеприготовленного построенной раствора, содержащего 50% (об / об) уксусной кислоты и 30% (вес / объем) трихлоруксусной кислоты (ТСА). Примечание: Используйте multipipettor.
  5. Определите внутриклеточный аскорбат - Шаг 2: количественного количество ферроцианидом формируется 37
    1. Добавить 100 мкл ферроцианид решения определения 37 еACH хорошо. Примечание: рабочий раствор следует непосредственно перед использованием: 2 мл 3 М Na-ацетата (рН 6,0); 0,5 мл ледяной уксусной кислоте (~ 17,4 М уксусной кислоты); 2 мл 0,2 М лимонной кислоты; 2 мл 3,3 мм FeCl 3 в 0,1 М уксусной кислоты; 1 мл 30 мМ ferene-S. Конечный объем данного рабочего раствора должна быть 7,5 мл.
    2. Траекторно смешивать пластину в темноте при 550 оборотах в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Считать значения поглощение лунки при 593 нм (то есть поглощение максимум Fe (II) (ferene-S) 3 комплекс).
    4. Рассчитайте количество внутриклеточного аскорбиновой кислоты в качестве нмоль аскорбиновой кислоты на миллион клеток изначально вычитания нм значения 593 для колодцев в '+ АО' из соответствующих - скважин 'АО' для каждого образца, а затем интерполяции по калибровочной кривой аскорбат (см. шаг 1.3 ). При построении стандартной кривой, построить эту «разность значение" для каждого стандарта против размере ascorbели на лунку.

2. Определение аскорбиновой кислоты-оттока из культивируемых клеток

  1. Клеточная культура и сбор урожая
    1. Расти перерыве или прилипшие клетки, как описано выше (см. шаг 1.1). Примечание: проводить следующую анализа в формате платформы 24-и с подвеской и прилипшие клетки для достижения наилучших результатов.
    2. Ресуспендируют подвески клетки, или накладывать прилипшие клетки, с 400 мкл подогретого HEPES-буферного солевого раствора, с или без кальция и магния, и содержащего 5 мМ D-глюкозы (HBS / D, рН 7,3, 37 ° С) в скважинах из 24-луночный планшет. Добавить такой же объем HBS / D для указанных бесклеточных скважин на каждом 24-луночный планшет, подлежащих рассмотрению. Примечание: последний будет служить в качестве контроля бесклеточных для базового реакции (см. ниже).

3. Определить количество аскорбата выхода

  1. Следующие растворы должны быть готовы заранее: 120Ед / мл АО в HBS / D (подготовить свежий); 2,4 мм Ferene-S в HBS / D; 120 мкМ FeCl 3 и 600 мкМ Na-цитрат в HBS / D (подготовить непосредственно из более концентрированных растворов).
  2. Для начала реакции ferrireduction (конечный объем на лунку должно быть 600 мкл), добавьте следующие объемы реагентов к отдельным скважинам, уже содержащие 400 мкл HBS / D:
    1. Добавить 50 мкл АО (120 ед / мл) или HBS / D, чтобы в паре скважин в трех экземплярах. Конечная концентрация О. должно быть 10 Ед / мл. Примечание: Ярлык паре скважин как "- АО" и "+ АО".
    2. Смешайте таблички с нежным орбитальной перемешивания в течение 5 мин при 37 ° С
    3. Добавить 50 мкл 2,4 мМ ferene-S во все лунки. Конечная концентрация ferene-S должна быть 200 мкм. Смешайте пластины как выше в течение 5 мин при 37 ° С
    4. Добавить 50 мкл свежеприготовленного 120 мкм цитрат железа. Окончательный железо и цитрат концентрации должна составлять 10 мкМ железа и 50 мкМ цитрат. Все хорошо перемешать.
    5. В трех трех лунок контроля, аспирация лежащего среду и добавить 600 мкл HBS / D, содержащий 0,1% сапонина. Примечание: Они будут служить "100% клеток лизис" управлений для лактатдегидрогеназы (ЛДГ) релиз анализа, которые будут проводиться параллельно (см. ниже).
    6. Выдержите в течение 60 мин в темноте при 37 ° С
    7. В конце аскорбат-истечение анализа, быстро аспирации 500 мкл из каждой лунки и добавить к соответствующей маркировкой в ​​лунки 24-луночного планшета. Примечание: для суспензии клеток, первоначально удалить клетки центрифугированием при 4 ° С.
    8. Добавить 300 мкл аликвоты супернатанта в 96-луночный планшет и затем считывали при 593 нм.

    4. Определение внеклеточной аскорбат

    1. Прочитайте значения абсорбции лунок при 593 нм.
    2. Рассчитать количество внеклеточной аскорбата как нмоль аскорбата на мг белка (или на миллион клеток), как описано для определения внутриклеточного аскорбатав шаге 1.5.4. Примечание: конечный пользователь должны оптимизировать условия, чтобы аскорбат релиз не ограничивается внутриклеточного аскорбиновой кислоты.

    5. Определение ЛДГ релиз

    1. С остальных 200 мкл раствора из внеклеточной каждого образца проводить LDH анализа высвобождения 32,41, чтобы определить степень клеточного лизиса. Примечание: вычисления в% от общей съемной ЛДГ. Определить разъемное ЛДГ из образцов, которые были обработаны 0,1% сапонина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Определение внутриклеточного аскорбат в культуре клеток суспензии

В первом тесте (рис. 1), внутриклеточный аскорбат определяется после аскорбат конкретным (т.е. АО-чувствительных) уменьшение феррицианида чтобы ферроцианид, используя высокочувствительный определение ферроцианидом по ранее опубликованной процедуры 37. Обнаружение аскорбата основана на колориметрического комплексообразования двухвалентного железа, полученного с помощью аскорбат-зависимой снижению феррицианида в ферроцианид, с последующим восстановлением трехвалентного железа до двухвалентного железа, по ферроцианида. Как супрафизиологические концентрации некоторых ионов двухвалентных металлов (например Cu 2 +, Co 2 + и Zn 2 +) может вмешиваться, по-видимому, конкурируя с черной железа для хелатирования по ferene-S, соответствующие меры должны быть приняты в таких условиях 37.

Фигура2 показан типичный стандартную кривую для набора стандартов аскорбата 0-20 мкм (или 0-2 нмоль аскорбата на лунку в 96-луночный планшет, см. шаг 6.5 В "Протокол".). Хотя это не показано на этом чертеже, линейность сохраняется до 8 нмоль аскорбата на лунку (т.е. сеть 593 нм ~ 1,6), что соответствует концентрации аскорбата образец в ~ 80 мкм. Анализ может быть использован, чтобы успешно обнаруживать уровни аскорбата ниже 0,25 нмоль аскорбата на лунку (2,5 мкМ образец концентрации аскорбата).

К562 клетки быстро накапливаются внутриклеточный аскорбат от внеклеточного DHA, но не аскорбат (см. рисунок 3; воспроизведена с разрешения Лейн и Lawen 2008 19). В этом репрезентативного эксперимента, PBS-Промытые клетки К562 (4 × 10 6 клеток / мл) инкубировали в PBS с 500 мкм либо аскорбиновая кислота (ASC), DHA, DHA + 50 мкМ цитохалазин (ДГК + ЦБ), ASC + 5 мМ феррицианид (SC / FIC) или ASC + 50 ед / мл АО (по возрастанию / АО) в течение 30 мин при 37 ° С Внутриклеточного аскорбиновая кислота определяли, как описано в "Протокол".

Поглощение DHA на К562 происходит путем стимулированию транспортера глюкозы (GLUT)-опосредованной транспорт (см. рисунок 4; воспроизведена с разрешения Лейн и Lawen 2009 42). Для оценки участия в излишкам поглощения DHA в этом репрезентативного эксперимента, К562 клетки инкубировали с возрастающими концентрациями цитохалазином (СВ) или dihydrocytochalasin B (H 2 CB), растворенного в MBS, содержащих 0,5% этаноле в течение 15 мин при 37 ° С до в инкубации с 400 мкМ DHA в течение 30 мин при 37 ° С в той же самой среде (рис. 4). Затем клетки промывали три раза в 100 объемах ледяной MBS и их внутриклеточная аскорбиновая кислота определяли, как описано в "Протокол". Важно отметить, в то время как оба CB и H 2 CB ингибировать процессы на подвижные микромолейконцентрации (1-100 мкм) только CB, которая отличается от H 2 CB наличием одной двойной связью, ингибирует GLUT-зависимый транспорт в низких концентрациях мкмоль (1-10 мкМ) 43. Поэтому, как поглощение DHA был тормозимый ЦБ с IC 50 <2,5 мкм, но не было тормозимый по Н 2 ЦБ, поглощение DHA, вероятно, происходит от GLUT-опосредованной транспорта 38. Кроме того, на фиг.4В, Промытые клетки подвергали воздействию возрастающих концентраций GLUT-транспортабельный, но не-обменной аналоговый глюкозы 3 - О-метил-D-глюкоза (3-OMG) или не-GLUT-транспортабельный стереоизомер глюкоза L - глюкозу до инкубации с DHA, как и в панели A. Снова результаты указывают на вовлечение в GLUT импорта DHA как ингибирование внутриклеточного накопления аскорбат происходит только в присутствии GLUT-транспортабельный глюкозы аналога.

Решимостьюния аскорбат-отток из прикрепленных клеток

Во втором тесте, скорость аскорбат-оттока из культивируемых клеток может быть определена. Этот конкретный анализ является важным, как высвобождение аскорбиновой кислоты из клеток, кажется, решающее значение для аскорбата-регулируется клеточного поглощения не-трансферрина переплете железа клетками 19,20. Поглощение не-трансферрином железа связаны считается отношение к патофизиологии расстройств железа перегрузки, таких как hemochromatoses 22, а также к астроцитов нейронов обмена железа и гомеостаза в мозге млекопитающих 22. Действительно, в последнее время мы показали, что основным возбуждающим нейромедиатором, L-глутамата, вызывает высвобождение аскорбиновой кислоты из астроцитов в манере, которая зависит от L-глутамата поглощением GLAST и последующего клеточный отек, который вызывает высвобождение аскорбиновой кислоты по предполагаемых VSOACs 32. По аналогии, аскорбиновая кислота гelease от аскорбата загружены астроцитов может быть стимулирован возбуждающих аминокислот, L-аспартата, но не без возбуждающих аминокислот L-глутамина. Этот эффект изображен на рисунке 5 (воспроизводится с разрешения Лейн и Lawen 2012 32), который показывает кривые доза-эффект для стимуляции аскорбиновой кислоты (AA) релиз аспартата (закрашенные кружки) и глутамина (открытые кружки) от первичных культурах аскорбиновая кислота загружены астроциты мыши.

Важно, чтобы обсудить, как это аскорбат-истечение анализ отличается от анализа, приведенного для определения внутриклеточного аскорбата. Основное различие состоит в том, что уровень аскорбата, остающегося в растворе не определяется в результате химической реакции, проведенной в конце данный момент времени, как это имеет место для способа определения аскорбат внутриклеточной. Вместо этого, "восстановительное подпись" накапливаетсяв течение периода, в котором аскорбат высвобождается из клеток. Это восстановительное подпись захватывается в виде аскорбат-зависимой снижения внеклеточного цитрат железа с последующим быстрым хелатирования двухвалентное железо как большой внеклеточной и мембранного impermeant [Fe (II) (ferene-S) 3] 4 - хелат . Ferene-S можно рассматривать так же мембрана-impermeant над короткое время ходе анализа. Уровни этого хромогенного комплекса может быть определена как измерения конечной точки. Как только AO-чувствительные уровни этого хелата определяются, анализ обеспечивает высокую степень специфичности для определения внеклеточного L-аскорбиновой кислоты.

Рисунок 1
Рисунок 1. Структурная схема, показывающая основные этапы протокола дляопределение внутриклеточного аскорбиновой кислоты.

Рисунок 2
Рисунок 2 Типичный стандартную кривую для набора стандартов аскорбата 0-20 мкм.. (Или 0-2 нмоль аскорбата на лунку в 96-луночный планшет;. См. шаг 6.5 В "Протокол") Столбики ошибок не показаны, поскольку они находятся в пределах диапазона, занятого символов.

Рисунок 3
Рисунок 3. К562 клетки быстро аккумулировать внутриклеточный аскорбат из внеклеточной DHA, но не аскорбат. PBS-Промытые клетки К562 (4 × 10 6 клеток / мл) инкубируют в PBS с 500 мкМ Oе либо аскорбиновая кислота (по возрастанию), DHA, DHA + 50 мкМ цитохалазин (ДГК + ЦБ), ASC + 5 мМ феррицианид (по возрастанию / FIC) или ASC + 50 ед / мл АО (по возрастанию / АО) в течение 30 мин при 37 ° С. Внутриклеточного аскорбиновая кислота определяли, как описано в "Протокол". Результаты, показанные являются средством трех отдельных экспериментах (+ SD). * Внутриклеточная концентрация аскорбиновой кислоты была рассчитана с использованием заранее определенной внутриклеточного пространства воды для К562 (т.е. ~ 1,6 μl/106 клеток) 19,20. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Лейн и Lawen 2008 19.

Рисунок 4
Рисунок 4. Поглощение DHA на К562 происходит путем стимулированию транспортера глюкозы (GLUT) опосредованного транспорта. К562 клетки, которые были выращены до 6-8 × 10 6 клеток / мл в RPMI + 10% (объем / объем) фетальной бычьей сыворотки при 37 ° С, 5% СО 2 и 95% воздуха были первоначально промывали три раза MBS. Промытые клетки затем подвергают воздействию возрастающих концентраций цитохалазином (CB; Sigma) или dihydrocytochalasin B (H 2 CB), растворенный в швабры-буферном солевом растворе (MBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 15 мМ MOPS-Na +, рН 7,3 ), содержащий 0,5% этанола до инкубации с 400 мкМ DHA в течение 30 мин при 37 ° С (А). Затем клетки промывали три раза в 100 объемах холодного MBS и их внутриклеточный аскорбат определяли, как описано в "Протокол". Как поглощение DHA был тормозимый ЦБ, но не H 2 CB, поглощение DHA происходит путем GLUT-опосредованной транспорта. Кроме того, в позиции (В), промывают клетки подвергали воздействию возрастающих концентраций GLUT-транспортабельный, но не-обменной аналоговый глюкозы 3 - О-метил-D-глюкоза (3-OMG) или не-GLUT-глюкоза транспортируется стереоизомер (A). Опять результаты указывают на вовлечение GLUT в поглощении DHA. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Лейн и Lawen 2008 42.

Рисунок 5
Рисунок 5. Аскорбат освобождение от аскорбиновой кислоты загружены астроцитов стимулируется возбуждающих аминокислот L-аспартата, но не без возбуждающих аминокислот L-глютамин. Эта цифра показывает кривых доза-ответ для стимуляции аскорбиновой кислоты (AA) релиз аспартат (закрытые кружки) и глютамин (открытые кружки) от первичных культурах аскорбиновой кислоты загружены астроцитов мыши. Данные, приведенные в средство (± SD) трех экспериментов. Р <0,001 против'базальная' состояние. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Лейн и Lawen 2012 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы представляем два быстрых, конкретных и относительно чувствительных колориметрических микропланшета тесты для определения аскорбиновой кислоты, полученной из внутри-и внеклеточных отсеков в культивируемых клетках. Анализы могут комплектоваться доступа к стандартным лабораторным оборудованием и реактивами. Только умеренно дорогостоящий реагент, необходимое для анализа является АО, который имеет важное значение, поскольку это придает высокую степень специфичности к аналита L-аскорбиновой кислоты. Анализы хорошо подходят для либо суспензии клеток (например К562) или прикрепленных клеток (например HepG2 или первичные астроциты грызунов), и были успешно использованы в предыдущих публикациях, используя такие клетки 19,20,32,37,38. Использование других аскорбат окислителей (например Tempol) вместо АО следует избегать, поскольку они не являются достаточно конкретными для L-аскорбиновой кислоты. Кроме того, использование соединений, таких какTempol в аскорбат анализе высвобождения будут посрамлены способностью Tempol пересечь клеточные мембраны и окисления внутриклеточного аскорбат 44. АО является по существу мембрана-impermeant за время курсов, используемых.

Мы провели прямые сравнения результатов, полученных с колориметрическим аскорбат анализа, описанного выше, и флуорометрического определения аскорбата из Vislisel и коллег 36. Мы обнаружили, что оба анализы дали идентичные результаты для анализа внутриклеточного определения аскорбат (данные не показаны). Интересно, что аскорбат анализе высвобождения описано выше, дает значительно более высокие значения для видимой скоростью оттока аскорбата, чем с флуорометрического анализа конечных точек. Это предполагает, что аскорбат-истечение описанный здесь анализ позволяет для определения кажущегося "аскорбат-оттока", который не так легко путает вероятности аскорбата обратного захвата клетками; процесс, который, скорее всего включает плОУРА мембранные SVCTs. Такое обратного захвата бы как правило, вызывают недооценку фактических уровней аскорбата, которые были выпущены в течение данного периода, если было принято измерения конечной точки аскорбиновая кислота. Следует отметить, что если образцы тканей (например, мышцы, легких или головного мозга), которые будут использоваться вместо культивируемых клеток для анализа внутриклеточного определения аскорбат, затем гомогенат ткани должны быть построены с использованием ледяной КПБ и некоторую форму механическое разрушение ( например Dounce гомогенизации, зонд-наконечник ультразвуком, французская пресса и т.д..). Сотовый мусора должны быть удалены путем центрифугирования, а пользователь должен рассмотреть возможную необходимость образца депротеинизации и / или добавлением ингибиторов протеазы, прежде чем приступить к шагу 1.2.4.

Мы также сообщали ранее, что низкие концентрации микромолярных из цитохалазином (<10 мкм) не ингибирует кажущуюся скорость аскорбат-оттока, что были определены с помощью анализа 32 19, 20,38.

Есть несколько важных шагов в этих протоколах. Во-первых, анализы, описанные здесь, в решающей степени зависеть от способности АО выборочно и быстро удалить аскорбат в парных образцах. Если удельная активность препарата АО заметно меньше номинального и предполагаемой активности, вполне возможно, что не все из аскорбиновой кислоты в АО-содержащей Sные примеры будут удалены. Это может привести к недооценке количества аскорбиновой кислоты в неизвестных образцах при использовании "прямой метод", чтобы рассчитать количество аскорбата настоящее время. Тем не менее, если использовать «метод стандарт-кривой", которое рекомендуется, препараты с низким уровнем активности из АО приведет лишь к потере анализа чувствительности. Мы обнаружили, что хорошие результаты последовательно получены при использовании препаратов, построенные АО путем растворения 1000 U АО в 1 мл либо PBS или MBS, который затем делится на 100 мкл аликвоты, которые хранятся при температуре -80 ° С в течение не более один месяц. Кроме того, как АО является белком, который может быть протеолитически разрушается клеточных лизатов, ингибиторы протеазы могут быть добавлены к клеточных лизатов перед добавлением лизатов к АО-содержащих лунок. Это может быть полезным модификация рассмотреть при использовании клетку или ткань, лизаты, которые богаты активности протеаз.

Кроме того, чувствительность анализов, описанныхBove в значительной степени зависит от использования хромогенного бидентатно Fe (II)-хелатообразующий агент, Ferene-S. Этот хелатор может быть заменен химически подобных хелатирующих агентов, таких как феррозином и bathophenanthroline дисульфонкислого, но с уменьшением чувствительности, соответствующей коэффициента экстинкции их Fe (II) хелаты 37. Кроме того, следует позаботиться при использовании bathophenanthroline дисульфонат, как это, кажется, приведет к более высоким темпам очевидной автокаталитического ferrireduction в присутствии железа цитрат комплексов, чем Ferene-S или феррозин 37,45. Это уместно беспокойство в случае аскорбат анализе высвобождения как не-аскорбат-зависимой появления Fe (II)-хелат уменьшает чувствительность анализа.

В то время как внутриклеточный анализ аскорбат-определение совместим с адгезивными клетками, отряд таких клеток перед сотовой лизиса должны быть выполнены путем механического соскабливания, а не трипсин / ЭДТА. Как трипсина является протеазыон, вероятно, вмешиваться отрицательно с шагом аскорбат-обеднения с АО, последний из которых является белком. Кроме того, ЭДТА, скорее всего, вмешиваться в этапе определения ФОК по хелатировать железа в конкуренции с ferene-S 37. Такие агенты следует избегать. Наконец, аскорбат высвобождение анализ может быть легко адаптировать для суспензии клеток. Вместо аспирации от лежащего Fe (II) (ferene-S), содержащий 3-хелата в конце анализа, клетки должны быть быстро осаждают центрифугированием, как и для анализа внутриклеточного аскорбат-определения. Поглощение при 593 нм супернатанта затем должны быть определены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарны доктору Стивену Робинсон и г-жи Хании Czerwinska (Monash University) за щедрую поставку астроцитов культур.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
  2. Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
  3. Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
  4. Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
  5. Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
  6. Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
  7. May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
  8. Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
  9. Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
  10. Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
  11. Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
  12. Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
  13. Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
  14. May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
  15. Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
  16. Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
  17. May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
  18. Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
  19. Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
  20. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
  21. Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
  22. Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
  23. Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
  24. Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
  25. Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
  26. Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
  27. Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
  28. Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
  29. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  30. May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
  31. Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
  32. Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
  33. Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
  34. Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
  35. Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
  36. Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
  37. Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
  38. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
  39. Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
  40. Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
  41. Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
  42. Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
  43. Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
  44. May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
  45. Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).

Tags

Биохимия выпуск 86 Витамин С аскорбиновая кислота сотовый отек Глутамат Микропланшетный анализ Астроциты
Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lane, D. J. R., Lawen, A. A Rapid… More

Lane, D. J. R., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter