Summary
아스 코르 빈산은 최근 몇 년 동안 빛을 온 많은 중, 세포 대사에 많은 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 중간 처리, 세포 배양 모두 내 및 세포 외 아스코르브 산염의 결정에 대한 구체적인 저렴 마이크로 분석을 설명합니다.
Abstract
비타민 C (아스 코르 빈산)는 만 최근 몇 년 동안 빛을 온 많은 중 세포 대사에서 많은 중요한 역할을한다. 뇌 아스 코르 빈산의 항상성에 중요한 것으로 보인다 관계 - 예를 들어, 뇌 내에서, 아스코르브 산염은 뉴런과의 인접한 성상 세포 사이의 아스 코르 빈산 순환을 포함하는 신경과 neuromodulatory 방식으로 작동합니다. 또한, 새로운 증거가 강력하게 아스코르브 산염은 고전적인 인식되는 것보다 세포 및 조직 철의 신진 대사를 조절에 크게 확장 된 역할을하는 것이 좋습니다. 정상 및 자유화 세포 및 유기체 생리학 아스코르브의 필수적인 역할의 증가 인식은 매우 고가의 전문 장비를 필요로하지 않고 실행될 수있는 매체 처리량 및 고감도 분석 방법의 범위를 요구한다. 여기에서 우리는 중간 처리량을 명시 적으로 지시, 보의 결정에 대한 구체적이고 상대적으로 저렴한 마이크로 분석을 제공세포 배양에서 일 내 및 세포 외 아스 코르 빈산.
Introduction
1928 년에서 1934 년 1에 게시 된 신문에 아스 코르 빈산 (비타민 C), 그리고 염원 알버트 Szent-Györgyi로 "반 괴혈병 인자", 및 다른 사람과 같은 그 식별의 화학적 특성의 발견은 역사에서 획기적인 사건이었다 생화학. 사실, 이러한 발견은, Szent-Györgyi 1937 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수여된다. 동물과 식물 생리학 아스 코르 빈산의 역할의 끊임없이 확장 제품군뿐만 아니라 인간의 건강에 기여 활성 과학의 주제로 계속 조사와 논쟁.
L-아스 코르 빈산 풍부한 생리 환원제와 포유류의 시스템에서 보조 인자 (cofactor) 효소, 콜라겐 수산화, 카르니틴과 노르 에피네프린 생합성, 티로신 대사 및 펩타이드 호르몬 아미드 2를 포함하는 다수의 잘 정의 된 효소 반응에 기여한다. 흥미롭게도, 설치 evide후부는 아스 코르 베이트는 수산화 관련된 프 롤릴와 아스 파라 hydroxylases 다른 철에 의존 dioxygenases을 자극하고, 저산소증 유도 인자 (HIFs) 1α 및 2α 3 대상의 역할을하는 것이 좋습니다. 최근 보고서는 아스 코르 빈산 핵 hydroxylases, 몬지 C (JmjC) 도메인 단백질을 자극에서의 활동을 통해 크로 마틴의 탈 메틸화에 영향을 미치는을 통해 T-세포 성숙에 중요한 역할을하는 것이 좋습니다; 후자의 전체 활동 4 아스 코르 빈산을 필요로 나타납니다. 실제로, 아스 코르 빈산에 의해 이러한 효소의 자극은 HIF 콜라겐 hydroxylases의 아스 코르 빈산에 의해 자극과 유사한 메커니즘에 의해 발생하는 것으로 나타납니다. 다른 고전적인 효과 중, 아스 코르 빈산 수용성 연쇄적인 라디칼 스 캐빈 저 5 셀룰러 항산화와 세포막의 재활용에 크게 기여 α-토코페롤 W, 6 α-토코페롤의 급진적 인 감소를 통해 (비타민 E)HICH는 막 지질 과산화 7에 대해 보호하는 것이 중요합니다. 대부분의 포유류는 D-포도당 아스 코르 빈산의 드 노보 간 합성 할 수 있지만 중요한 것은, 높은 영장류, 기니아 피그 및 일부 박쥐 비타민 8의식이 소스에 따라 달라집니다. 이 GULO 유전자의 불 활성화로 인해 영향을받지 포유 동물에서의 orthologues 9-13 산화 효소 효소, γ-굴로-락톤을 인코딩합니다. 이 효소는 포도당 13 아스 코르 빈산 생합성의 최종 반응이 필요합니다.
인간의 창자 루멘에서 수송 매개 흡수 후, 아스 코르 베이트는 순환 시스템에 의해 몸 전체에 배포됩니다. 비타민은 일반적으로 (농도가 일반적으로 통용 혈장 농도와 유사하다하는 적혈구의 주목할만한 예외) 세포 내 밀리몰 농도에서와 마이크로 몰 진한에서 자사의 감소 형태로 발견대부분의 세포 외 체액 (14, 15)에 entrations (예를 들면 50 ~ 200 μM).
생리적 조건 하에서, 아스 코르 베이트는 일반적 아스코 자유 라디칼에 가역성 원 전자 산화를 겪는다 (AFR '또한 monodehydroascorbate 또는 semidehydroascorbate라고도 함). AFR 다시 아스코르브에 급속한 한 전자 환원 효소의 부재, 상대적으로 안정 라디칼 (16)이지만,이 AFRs 한 아스코르브 하나 dehydroascorbate (DHA) 9,13,17에 dismutate을 발전 할 수있다. 셀의 내부에, 아스 코르 베이트, DHA의 2 전자 산화 생성물은 급속 글루타티온 및 NAD (P) H-의존적 효소 적 및 비 효소 반응 (13)에 의해 확대 아스코르브로 감소 될 수있다.
이 고전 철 대사에 아스 코르 빈산의 유일한 중요한 역할이 아닌 헴 철 (18)의식이 흡수를 자극하는 것을 허용하는 동안, 우리와 다른 증거들을 제공 한trongly 그 아스 코르 빈산을 제안하는 것은이 금속의 대사에 크게 확장 된 역할을한다. 첫째, 아스 코르 빈산 - 구비 세포에 의해 방출되는 아스 코르 빈산 세포 (19, 20)에 의해 비 트랜스페린 바인딩 철의 흡수를 조절하는 데 중요한 역할을하고, 아주 최근의 증거는 아스 코르 빈산도 트랜스페린 바인딩 철의 흡수를 조절된다는 것을 의미합니다 나타납니다 셀 (21)에서, 후자는 주요 생리적 철 흡수 경로 (22)에 대응한다.
아스 코르 빈산 포유류 (23, 24) 정상 중추 신경계 기능을 위해 필수적입니다. 함께 부신 피질, 뇌하수체, 흉선, 망막 및 황체로, 뇌는 다른 신체 조직 23,25-27에 아스 코르 빈산 상대적으로 높은 농도가 포함되어 있습니다. 또한, 성상 세포 (28, 29) 및 신경 세포와 같은 세포의 글루타메이트 30 두의 노출은 ascorbat 세포 외 공간에 아스 코르 빈산의 방출을 유발하는 것으로 알려져있다전자는 글루타민산에 의한 신경 장애 (31)에 대해 신경 세포를 보호하는 것으로 생각된다. 성상 세포에서 글루타메이트에 의한 아스 코르 빈산 자료의 정확한 메커니즘은 알 수 있지만, 우리는 최근 성상 세포의 글루타메이트와 아스파 라진 산염 수송 (GLAST에 의해 글루타메이트 섭취로 인한 부종 세포의 관련을 나타내는 증거를 제공하고, 또한 알려진 흥분성 아미노산 수송 이소 1 [EAAT1 ] 인간)와 같은 아스 코르 빈산 32 작은 유기 음이온 투과성 볼륨에 민감한 osmolyte과 음이온 채널 (VSOACs)의 결과의 활성화. VSOAC 형성에 관여 세포막 도관의 분자량은 33, 34 신원을 식별하기 위해 남아있다.
많은 분석이 분광 형광 및 크로마토 그래피 분석 (35, 36)를 포함 생물학적 시료에서 아스코르브 산염의 결정을 위해 개발되었지만, 특이도, 민감도, interferenc에 많은 변화가있다화학적 오염 물질, 효과적인 선형 범위 및 끝점 분석 물의 안정성 E. 또한, 분석의 선택에 영향을 다른 중요한 요인은 신속성, 사용의 용이성과 같은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 장치로서 비교적 특수 장비에 접근한다.
여기에서 우리는 배양 된 세포에서 세포 내 아스코의 판정뿐만 아니라, 배양 된 세포로부터 아스코르브-유출의 결정을위한 별도의 분석에 대한 간단하고 매우 구체적인 비색 마이크로 분석을 제시한다. 후자의 분석으로 인해 나트륨 의존 아스 코르 빈산 포터 (SVCTs)가 발표 한 아스 코르 빈산의 신속한 재 흡수에 세포에서 아스 코르 빈산 릴리스의 과소 평가의 문제를 회피하는 것을 목표로하고있다. 두 방법 모두는 우리의 이전의 출판물 19,20,32,37,38의 일부에 출연했지만,이 원고는 지침과 자신의 효과적인 실행을위한 가이드 라인의 명시 적 세트를 제공합니다.
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Protocol
1. 배양 세포에서 세포 내 아스 코르 빈산을 결정
- 세포 배양 및 수확
- 표준 배양 절차 19-21,32,38를 사용하여 현탁액 (예를 들어 인간의 백혈병, K562) 또는 부착 세포 (예를 들어, 기본 성상 세포)를 성장. 참고 : 세포, 아스코르브 산염을 포함하는 아스 코르 빈산 하나 아스코르브 산염 또는 DHA 33,39 등으로 배양 된 세포를로드 할 수 있도록.
- 아스코르브 산염 함유 세포 추출물을 만들기
- 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 세척 정지 또는 얼음처럼 차가운 휴대 Permeabilization 버퍼 [CPB의 450 μL와 자기편 세포의 적절한 수를 품어; PBS에 0.1 % (W / V) 사포닌; 4 °의 C]. 주 : 경험적으로 최종 사용자 (아래 참조) 분석의 선형 범위 내의 흡광도 값을 획득하는데 필요한 세포의 수를 결정한다. 참고 : 조직 추출물도 (자세한 내용은 설명을 참조)을 사용할 수 있습니다.
- AGITA10 분 동안 얼음에 테 세포는 완전한 세포 용해를 보장합니다.
- 냉장 마이크로 원심 (4 ℃)에서 5 분간 16,000 × g에서 원유 해물의 원심 분리하여 세포 파편을 제거하여 정화 된 아스코르브 산염 함유 세포 추출물을 만듭니다.
- 조심스럽게 각 샘플에서 4 × 100 ㎕의 분취 액을 제거하고도 만 25 μL / 웰 45.5 U의 PBS ( "-AO")의 25 μL / 하나를 포함하는 96 - 웰 평면 바닥 판 우물의 수평 순서에 추가 / ㎖ PBS ( "+ AO")에서 L-아스 코르 빈산-산화 효소 (AO)의 원액. 참고 :이 (아래 참조) 표준의 준비와 병렬로 수행해야합니다.
- 아스 코르 빈산 표준 곡선 건설 (각 분석을 위해 새롭게 구성해야합니다)
- 얼음처럼 차가운 PBS에서 10 mM의 아스 코르 빈산의 재고 솔루션을 준비합니다. 주 : 분광 광도계로 한 석영 큐벳을 이용하여 아스코르브의 농도를 확인265 나노 미터 (흡광 계수 = 14.5 밀리미터 -1 cm -1) 40에서 CM 경로 길이.
- 조심스럽게 0과 20 μM 사이 아스 코르 빈산의 일련의 표준을 준비합니다.
- 1.2.4 단계와 병행하여, 신중하게 각각의 표준에서 4 × 100 ㎕의 분취 액을 제거하고 PBS ( "-AO") 또는 25 μL / 잘 들어있는 96 - 웰 평면 바닥 판에있는 우물의 수평 순서에 추가 PBS의 AO ( "+ AO")의 45.5 U / ㎖의 원액. 참고 : 위의 아스 코르 빈산 기준의 100 μL는 아스 코르 빈산의 0-2 nmol을 포함됩니다. 참고하시기 바랍니다, AO의 목적은 감소 페리 시안화 비 아스 코르 빈산 환원제의 기여에 대해 제어하는 것입니다.
- 세포 내 아스 코르 빈산을 결정 - 1 단계 : 선택적 아스 코르 베이트를 제거하고 정량적 페리 시안화와 아스 코르 빈산 산화
- 공전 호일 접시를 덮음으로써 다크에서 5 분 동안 실온에서 550 rpm에서 96 - 웰 플레이트를 섞는다. 주 : T그의 단계는 DHA에 "+ AO"우물의 모든 아스 코르 빈산을 산화한다. "-AO"우물은 영향을받지 않습니다.
- 모든 웰에 PBS에 (이하 "페리 시안화"이라한다)의 3.5 mM의 페리 시안화 칼륨의 50 μl를 추가합니다. 마지막으로 [페리 시안화] = 1 ㎜. 참고 : multipipettor를 사용합니다.
- 궤도 다크 또 다른 5 분 동안 실온에서 550 rpm에서 플레이트를 섞는다. 참고 :이 단계는 산화 아스코르브 산염의 1 분자 당 감소 페리 시안화 2 분자의 화학 양론 비에 아스 코르 빈산에 의해 페로 시안화 수의 감소가 발생한다.
- 즉시 50 % (V / V) 아세트산 30 % (W / V) 트리클로로 아세트산 (TCA)를 포함하는 새로 구축 솔루션의 25 μl를 추가합니다. 참고 : multipipettor를 사용합니다.
- 세포 내 아스 코르 빈산을 결정 - 2 단계 : 정량 페로의 양 (37)을 형성
- 전자에 페로 시안화 결정 솔루션 (37)의 100 μl를 추가합니다잘 ACH. 참고 : 작업 솔루션은 사용하기 직전에해야한다 : 3 M 나 - 아세테이트 (산도 6.0) 2 ㎖를; 빙초산 (17.4 ~ M 아세트산) 0.5 ㎖; 0.2 M 구연산 2 ㎖; 0.1 M 아세트산 3.3 밀리미터에 FeCl 3 2 ㎖; 30 mM의 ferene-S 1 ㎖. 이 작업 용액의 최종 부피는 7.5 ㎖를해야한다.
- 궤도 상을 실온에서 30 분 동안 550 rpm에서 어둠 속에서 플레이트를 섞는다.
- 593 nm에서 웰의 흡광도 값을 읽고 (즉, 철 (II) (ferene-S) 3 착체의 흡광도 최대).
- (단계 1.3 참조 각 샘플에 대한 - 'AO'우물 후 아스코 표준 곡선으로부터 보간 초기 대응에서 '+ AO'웰의 593 nm의 값을 뺀 만 셀 당 나노 몰 아스 코르 빈산 등의 세포 내 아스 코르 빈산의 양을 계산 ). 표준 곡선을 생성 할 때, ascorb의 양에 대해 각 기본이 '차분 값을 "플롯물론 당 먹었다.
배양 된 세포에서 아스 코르 빈산 - 유출의 2. 결정
- 세포 배양 및 수확
- (단계 1.1 참조) 위의 정지 또는 부착 세포를 성장. 참고 : 최상의 결과를 위해 서스펜션과 자기편 세포와 24 - 웰 플랫폼 형식으로 아래의 분석을 수행한다.
- 재현 탁 서스펜션 세포, 또는 또는 칼슘과 마그네슘하지 않고, 미리 예열 HEPES 완충 생리 식염수 400 ㎕ 씩, 부착 세포를 오버레이, 5 ㎜ D-글루코스 포함, 우물 (HBS / D의 pH 7.3, 37 ° C)를 24 웰 플레이트. 검사 각 24 웰 플레이트에 지정된 셀이없는 우물에 HBS / D의 동일한 볼륨을 추가합니다. 참고 : 후자는 (아래 참조)의 기준 반응 세포가없는 컨트롤이 될 것입니다.
3. 출시 아스 코르 빈산의 양을 결정
- 다음 주식 솔루션은 사전에 준비를해야합니다 : 120U / ㎖ AO HBS / D (신선한 준비)에서; 2.4 mM의 Ferene-S HBS / D에; 120 μM에 FeCl 3 HBS / D (농축 된 원액에서 바로 준비)에 600 μM NA-구연산.
- ferrireduction 반응 (물론 당 최종 부피가 600 ㎕를해야한다)을 시작하려면 이미 HBS / D 400 μl를 포함하는 각각의 우물에 시약의 다음 볼륨을 추가 :
- 세중 우물을 쌍으로하는 AO (120 U / ㎖) 또는 HBS / D의 50 μl를 추가합니다. 최종 AO 농도가 10 U / ㎖이어야한다. 참고 : 레이블로 우물을 쌍 "- AO"와 "+ AO".
- 37 ℃에서 5 분 동안 부드러운 궤도 믹싱 판을 혼합
- 모든 웰에 2.4 mM의 ferene-S의 50 μl를 추가합니다. 최종 ferene-S 농도가 200 μM해야한다. 37 ℃에서 5 분 이상으로 판을 혼합
- 새로 제조 된 120 μM 구연산 철의 50 μl를 추가합니다. 최종 철, 구연산 농도는 10 μM의 철과 50 μM 구연산해야한다. 잘 섞는다.
- 세 세중 제어 웰스, 위에있는 매체를 대기음 및 0.1 %의 사포닌을 함유하는 600 ㎕의 HBS / D를 추가합니다. 참고 :이 (아래 참조)를 병행하는 젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 시험은 "100 % 세포 용해"컨트롤이 될 것입니다.
- 37 ° C에서 어둠 속에서 60 분 동안 품어
- 아스 코르 빈산 - 유출 분석의 끝에서, 빠르게도 각에서 500 μl를 대기음하고 적절하게 24 웰 플레이트에 우물을 표시하기 위해 추가 할 수 있습니다. 참고 : 서스펜션 셀, 처음 4 ℃에서 원심 분리하여 세포를 제거
- 96 - 웰 플레이트에 상층 액 300 ㎕의 분취 량을 추가 한 후 593 nm에서 읽었다.
세포 외 아스 코르 빈산의 4. 결정
- 593 nm에서 웰의 흡광도 값을 읽습니다.
- 세포 내 아스코르브 산염의 결정에 대해 기재된 바와 같이 단백질 1mg 당 (또는 백만 셀마다) 나노 몰 아스코르브로서 세포 아스코르브의 양을 계산단계 1.5.4에서. 참고 : 아스코르브 방출은 세포 내 아스코 의해 제한되지 않도록 최종 사용자가 조건을 최적화한다.
LDH 출시 5. 결정
- 각 샘플에서 세포 외 용액의 나머지 200 μL와 셀룰러 용해의 정도를 결정하기 위하여 LDH 방출 분석을 실시 32,41. 참고 : 전체 박리 LDH의 %로 계산합니다. 0.1 %의 사포닌으로 처리 된 샘플에서 박리 LDH를 결정합니다.
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Representative Results
배양 된 서스펜션 세포의 세포 내 아스 코르 빈산의 결정
첫 번째 분석 (그림 1)에서, 세포 내 아스 코르 베이트는 이전에 출판 된 절차 (37)에 의해 페로의 매우 중요한 결정을 사용하여, 페로 시안화하는 페리 시안화 (즉, AO 구분) 감소 아스 코르 빈산 별에 따라 결정된다. 아스 코르 베이트의 검출은 페로 시안화 제 1 철에 의해 철의 환원시킴으로써 페로하는 페리 시안화 아스코르브 의존 환원에 의해 생성되는 제 1 철의 색채 킬레이트 화에 기초한다. 일부 2가 금속 이온 (예 : 구리 2 +, 공동 2 + 및 Zn으로 2 +)의 supraphysiological 농도는 아마도 ferene-S로 킬 레이션에 대한 제 1 철과 경쟁에 의해 방해 할 수있는 바와 같이, 적절한 예방 조치는 이러한 조건 37에서주의해야한다.
그림2 아스 코르 빈산 기준 0-20 μM의 집합에 대한 일반적인 표준 곡선을 보여줍니다 (또는 96 - 웰 플레이트의 웰 당 0-2 nmol을 아스 코르 빈산을, "프로토콜"의 단계 6.5를 참조하십시오.). 이 도면에 도시되지 않았지만, 선형성 (즉 순 ~ 1.6의 593 나노 미터) ~ 80 μM의 샘플 아스코르브 산염 농도에 대응하고, 웰 당 13 nmol을 아스코르브까지 유지된다. 분석은 성공적 웰 당 0.25 nmol을 아스코르브 산염 (2.5 μM 샘플 아스코르브 산염 농도) 이하 아스코르브 수준을 검출하는데 사용될 수있다.
K562 세포는 빠르게 세포 DHA에서 세포 내 아스 코르 빈산을 축적,하지만 아스 코르 빈산 (그림 3 참조; 레인과 Lawen 19 2008의 허가를 재현). 이 대표 실험에서, PBS-세척 K562 세포 (4 × 10 6 세포 / ml)가 아스 코르 빈산 (ASC) 중 하나를 500 μM로 PBS에서 배양, DHA, DHA + 50 μM의 사이토 B (DHA + CB), 오름차순 + 5 mM의 페리 시안화 (A사우스 캐롤라이나 / FIC) 또는 오름차순 + 50 U / ㎖ AO 30 분 (ASC / AO) 37 ° C에서 "프로토콜"에 설명 된대로 세포 내 아스코가 결정되었다.
K562 세포로 DHA 흡수는 촉진 적 포도당 수송 (GLUT) 매개 수송에 의해 발생합니다 (그림 4 참조; 레인과 Lawen 2009 (42)로부터 허가를 재생). 이 대표 실험에서 DHA 섭취의 과잉의 참여를 평가하기 위해, K562 세포를 증가 사이토 B의 농도 (CB) 또는 37 ° C에서 15 분 동안 0.5 %의 에탄올을 포함하는 MBS에 용해 dihydrocytochalasin의 B (H 2 CB)와 함께 배양 사전 같은 배지에서 37 ° C에서 30 분 동안 400 μM DHA (그림 4A)와 부화. 셀은 다음 빙냉 MBS 100 권 3 번 세척하고, "프로토콜"에서 설명한대로 그 세포 내 아스코 결정. CB와 H 2 CB 모두 마이크로 몰에서 운동성이 과정을 억제하면서주의하는 것이 중요하다농도 (1-100 μM), 하나의 이중 결합의 존재에 의해 H 2 CB 다릅니다 만 CB는 낮은 마이크로 몰 농도 (1-10 μM) 43에서 GLUT 의존 전송을 억제한다. DHA 섭취가 IC (50) <2.5 μM와 CB에 의해 inhibitable했지만, H 2 CB로 inhibitable 아니었다 따라서, DHA의 섭취는 아마 GLUT-매개 교통 (38)에 의해 발생합니다. O-메틸-D-글루코스 (3 - OMG) 또는 비 GLUT 수송 기능 글루코스 입체 이성체의 L - - 대안 적으로,도 4b에, 세정 균체의 GLUT 수송 기능 만이 아닌 대사 글루코오스 유사체 3 증가 농도에 노출되었다 다시 결과는 GLUT-수송 포도당 아날로그의 존재에서 발생하는 세포 내 아스 코르 빈산 축적의 억제로 DHA 수입에 GLUT의 참여를 표시하기 전에 패널 A. 같이 DHA와 배양에 포도당.
디터 미나 (Determina)자기편 세포에서 아스 코르 빈산 - 유출의 기
두 번째 분석에서 배양 된 세포에서 아스 코르 빈산 - 유출의 속도가 결정될 수있다. 세포에서 아스 코르 빈산의 방출 셀 (19, 20)에 의해 비 트랜스페린 바인딩 철의 아스 코르 베이트 규제 세포의 흡수에 중요한 것으로 나타나는이 특정 분석이 중요합니다. 비 트랜스페린 바인딩 철의 흡수는 같은 hemochromatoses 22뿐만 아니라, 포유류의 뇌 (22) 성상 세포 - 신경 세포의 철 교환 및 항상성에 같은 철 과부하 장애의 병태 생리에 관련된 것으로 간주됩니다. 사실, 우리는 최근의 주요 흥분성 신경 전달 물질, L-글루타민산, GLAST 및 추정 VSOACs 32로 아스 코르 빈산의 석방을 트리거 이후의 세포 부종에 의한 L-글루타민산 흡수에 의존하는 방식으로 성상 세포에서 아스 코르 빈산의 방출을 유발하는 것으로 나타났습니다. 유사하게, 아스 코르 빈산의 연구에서아스코르브로드 교세포에서 elease은 흥분성 아미노산, L-아스파라긴산, 그러나 비 흥분성 아미노산 L-글루타민에 의해 자극 될 수있다. 이 효과는 아스 코르 빈산의 자극 (AA) 아스 파르 테이트 (폐쇄 원)로 출시 글루타민의 차 문화에서 (오픈 원)에 대한 용량 - 반응 곡선을 보여준다 (레인과 Lawen 2012 32의 허가를 재생) 그림 5에 도시된다 아스 코르 베이트로드 마우스 성상 세포를.
그것은이 아스 코르 빈산 - 유출 분석은 세포 내 아스 코르 빈산의 결정에 대해 제공되는 분석 다른 방법을 논의하는 것이 중요합니다. 주요한 차이점은 용액에 남아있는 아스코르브의 레벨이 세포 내 아스코 결정 방법에 대한 경우와 같이, 주어진 시점의 단부에서 실시 화학 반응에 의해 결정되지 않는다는 사실에있다. 대신, "환원 서명"축적의 기간 동안 아스 코르 베이트는 세포에서 방출된다. 이 환원성 서명 대형 세포 외 및 막 - impermeant로서 1 철의 급격한 킬레이트이어서 세포 시트르산 철의 아스코르브 의존적 감소의 형태로 포착 [철 (II) (ferene-S) 3] 4 - 킬레이트 . Ferene-S는 분석의 단시간 코스 위에 마찬가지로 막 impermeant 간주 될 수있다. 이 발색 복합체의 농도는 엔드 포인트 측정으로 결정될 수있다. 이 킬레이트 만 AO 구분 레벨이 결정되는 바와 같이, 분석은 세포 외 L-아스 코르 빈산의 판정에 대한 특이성의 높은 정도를 제공한다.
그림 1.에 대한 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 다이어그램 흐름세포 내 아스코르브 산염의 결정.
그림 2 아스 코르 빈산 기준 0-20 μM의 집합에 대한 일반적인 표준 곡선.. (또는 96 - 웰 플레이트의 웰 당 0-2 nmol을 아스 코르 빈산,. "의정서"의 단계 6.5 참조) 오차 막대는 다음과 같이 표시되지 않습니다 이들은 기호가 차지하는 범위 내에있다.
그림 3. K562 세포는 빠르게 세포 DHA에서 세포 내 아스 코르 빈산을 축적,하지만 아스 코르 빈산. PBS-세척 K562 세포 (4 × 10 6 세포 / ㎖)를 500 μM 오와 PBS에서 배양 하였다F 중 하나 아스 코르 빈산 (ASC), DHA, DHA + 50 μM의 사이토 B (DHA + CB), 오름차순 + 5 mM의 페리 시안화 (ASC / FIC) 또는 오름차순 + 50 U / ㎖ AO (ASC / AO) 37 °에서 30 분 동안 C. "프로토콜"에 설명 된대로 세포 내 아스코가 결정되었다. 나타난 결과는 세 개의 개별 실험 (+ SD)의 수단입니다. * 세포 내 아스 코르 빈산의 농도는 K562 세포 (즉, ~ 1.6 μl/106 세포) (19, 20)에 대한 미리 정해진 세포 내 물 공간을 이용하여 추정 하였다. 이 그림은 레인과 Lawen 19 2008의 허가를 재현 할 수 있습니다.
K562 세포에 의해 그림 4. DHA 흡수는 촉진 적 포도당 수송 (GLUT)에 의해 발생 전송을 매개. + 10 % RPMI 6-8 × 10 6 세포 / ml (로 성장했다 K562 세포는37 ° C에서 V / V) 태아 혈청, 5 % CO 2, 95 %의 공기는 MBS로 3 회 세척 처음이었다. 또는 dihydrocytochalasin의 B 걸레 완충 식염수에 용해 (H 2 CB) (MBS; 137 mM의 NaCl을 2.7 밀리미터의 KCl, 15 mM의 MOPS - 나 +, 산도 7.3, 세척 후 세포 사이토 B의 농도 (시그마 CB)를 증가에 노출 된 ) 이전에 37 ° C에서 30 분 동안 400 μM DHA와 배양에 0.5 %의 에탄올을 포함하는 (A). 세포는 차가운 MBS 100 권으로 3 회 세척하고, "프로토콜"에서 설명한대로 그 세포 내 아스코 결정. DHA 섭취가 CB로 inhibitable 있지만 H 2 CB되면서, DHA의 섭취는 GLUT-매개 교통으로 발생합니다. 대안 적으로, (B)에서, 세정 균체의 증가하는 농도에 노출 된 GLUT 수송 기능 만이 아닌 대사 포도당 아날로그 3 - O-메틸-D-글루코스 (3 - OMG) 또는 비 GLUT 수송 기능 글루코스 입체 (A)에서와 같이 DHA와 배양 중 L-포도당. 다시 결과는 DHA의 섭취에 GLUT의 참여를 나타냅니다. 이 그림은 레인과 Lawen 2008 (42)로부터 허가를 재현 할 수 있습니다.
아스코르브로드 교세포에서도 5. 아스코르브 산염 동의서 흥분성 아미노산 L-아스파라긴산 의해 자극 아니지만 비 흥분성 아미노산 L-글루타민된다.이 도면은 아스 코르 베이트의 자극 (AA) 방출에 의해 투여 량 - 반응 곡선을 나타낸다 아스 파르 테이트 아스 코르 베이트로드 마우스 성상 세포의 차 문화에서 (폐쇄 원)과 글루타민 (오픈 원). 표시된 데이터는 세 가지 실험의 (SD ±) 수단입니다. P <0.001 대'기초'상태. 이 그림은 레인과 Lawen 2012 32의 허가를 재현 할 수 있습니다.
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Discussion
본 논문에서는 배양 된 세포의 내부와 세포 구획에서 파생 된 아스 코르 빈산의 결정을위한 두 가지, 신속한 특정 상대적으로 민감한 색채 마이크로의 분석을 제시한다. 분석 표준 실험실 장비 및 시약에 대한 액세스를 완료 할 수 있습니다. 분석에 필요한 적당히 비싼 시약은 L-아스 코르 빈산을 향해 피 분석 특이성의 높은 정도를 부여하는 등의 필수이다 AO이다. 분석은 어느 서스펜션 세포 (예 : K562) 또는 부착 세포 (예를 들면 인 HepG2 또는 기본 설치류 성상 세포)에 적합하고, 성공적으로 세포에게 19,20,32,37,38를 사용하여 이전의 출판물에 사용되어왔다. 그들은 L-아스 코르 빈산을 위해 충분히 특정하지 않기 때문에 AO 대신에 다른 아스코르브 산염 산화제 (예 TEMPOL)의 사용은 피해야한다. 또한, 다음과 같은 화합물의 용도아스코르브 산염 방출 분석에서 TEMPOL은 세포막을 건너 세포 내 아스 코르 베이트 44을 산화하는 TEMPOL의 능력에 의해 혼동됩니다. AO는 본질적으로 막 impermeant 사용되는 시간의 과정에있다.
우리는 위에서 설명한 비색 아스 코르 빈산 분석 및 Vislisel 및 동료 (36)의 형광 아스코르브 산염 결정으로 얻은 결과의 직접적인 비교를 수행했습니다. 우리는 모두 분석은 세포 내 아스 코르 빈산 결정 분석 (데이터가 표시되지 않음)에 대해 동일한 결과를 준 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 위에서 설명한 아스코르브 산염 방출 분석은 형광 엔드 포인트 분석보다 아스코 유출의 명백한 속도에 훨씬 더 높은 값을했다. 이는 본원에 기재된 아스코르브-유출 분석뿐만 용이 아스코르브 세포에 의한 재 흡수의 가능성에 의해 혼동되지 명백 "-아스코르브 유출」의 판정을 허용하는 것이 제안; 가능성이 PL을 포함하는 프로세스ASMA 막 SVCTs. 이러한 재 흡수는 엔드 포인트 아스 코르 빈산 측정이 수행 된 경우 일정 기간 동안 출시 된 아스 코르 빈산의 실제 수준의 과소을 일으키는 경향이있다. 그것은 조직 샘플 (예를 들면 근육, 폐 또는 뇌) 대신에 세포 내 아스코 판별 분석을위한 배양 된 세포 중에서 사용하고자 할 경우 다음 조직 파쇄 액은 (빙냉 CPB 및 기계류 중단의 일부 형태를 사용하여 생성되어야한다는 것을 주목해야한다 예를 들어 다운스 균질화, 프로브 팁 초음파 등 프랑스어를 누릅니다.). 세포 파편은 원심 분리에 의해 제거하고, 사용자가 단계 1.2.4로 진행하기 전에 샘플 단백질 제거 및 / 또는 프로테아제 억제제를 첨가 할 필요성을 고려해야한다.
우리는 또한 사이토 B (<10 μM)의 이전이 낮은 마이크로 몰 농도를보고 분석 (32)에 의해 결정되었다 아스 코르 빈산 - 유출의 명백한 속도를 억제하지 않았다 사용은, 페리시 아나이드는 아스 코르 베이트의 세포 풀 주로 감소로서 시트르산 철은 세포 아스 코르 베이트 (19)에 의해 우세하게 감소되는 동안 (transplasma 막 전자 수송의 과정을 통해), 페리 시안화보다 선호 될 20,38.
이러한 프로토콜의 여러 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 본 명세서에 기재된 분석법을 선택적 급속 페어링 샘플에서 아스 코르 베이트를 제거 AO의 능력에 결정적으로 의존한다. AO의 제제의 활성은 특정 공칭와 추측 된 활성보다 현저하게 작 으면 가능하다 AO 함유 발 소재 아스코르브 모든amples가 제거됩니다. 이것은 미지 시료의 아스코르브 산염의 양을 과소 평가가 발생할 수 아스코르브 존재하는 양을 계산하는 "직접 방식」을 사용하는 경우. 하나가 추천하는 "표준 곡선 법"을 사용하는 경우에는, AO의 낮은 활동 준비는 분석 감도의 손실로 이어질 것입니다. 우리는 좋은 결과가 지속적으로 다음보다는 더 이상을 위해 -80 ° C에 저장됩니다 100 ㎕의 분취 량으로 나누어 져 PBS 또는 MBS, 하나의 1 ml의 AO 1000 U를 용해하여 구성 AO의 준비를 사용하여 얻어지는 것을 발견했다 일개월. AO는 단백질 가수 분해 세포 용 해물에 의해 분해 될 수있는 단백질로서 또한, 프로테아제 억제제는 AO 함유하는 웰에 첨가하기 전에 용 해물의 세포 용해 액에 첨가 할 수있다. 이 단백질 분해 효소 활성이 풍부한 세포 또는 조직 해물을 사용할 때 고려해야 할 유용한 변경 될 수 있습니다.
또한, 분석의 감도가 기재된스터스 보브 크게 발색 두자리 철 (II) 킬레이트, Ferene-S의 사용에 따라 달라집니다. 이 킬레이트는 ferrozine 및 bathophenanthroline 술포 네이트와 같은 화학적으로 유사한 킬레이트로 대체하지만, 자신의 철 (II)의 흡광 계수에 해당하는 감도의 감소와 함께 37 킬레이트 할 수 있습니다. 이 Ferene-S 또는 Ferrozine 37,45보다 구연산 철 복합체의 존재 명백한 촉매 ferrireduction의 높은 속도로 이어질 것으로 나타나는, bathophenanthroline 술포 네이트를 사용할 때 더욱주의가 필요합니다. 이것은 (II) 킬레이트는 분석의 민감도를 감소한다 철의 비 아스코르브 의존 외관 등 아스코르브 방출 분석의 경우 적절한 관심사이다.
세포 내 아스 코르 베이트 판별 분석은 자기편 세포와 호환되는 반면, 세포의 용해 전에 이러한 세포의 분리는 기계적 스크래핑보다는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 의해 수행되어야한다. 트립신은 단백질 분해 효소이므로그것은 가능성이 AO, 단백질있는 후자와 아스 코르 빈산 - 고갈 단계에 부정적으로 방해합니다. 또한, EDTA 가능성이 ferene-S (37)과의 경쟁에서 철 킬레이트로 FOC 결정 단계에 방해가됩니다. 이러한 에이전트는 피해야한다. 마지막으로, 아스 코르 빈산 자료 분석은 쉽게 서스펜션 셀에 적용 할 수 있습니다. 대신 상부 철 (II) (ferene-S)를 오프 흡입 3 - 함유 분석의 끝에 킬레이트, 세포는 급속하게 세포 내 아스코 판별 분석법 등은 원심 분리에 의해 침강한다. 상등액의 593 ㎚에서 흡광도를 다음 결정되어야한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 성상 세포 배양의 관대 한 공급 박사 스티븐 로빈슨과 미스 하니아 Czerwinska (모나 쉬 대학)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
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