Summary
Ascorbaat speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een middelgrote doorvoer, specifiek en goedkoop microplate assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.
Abstract
Vitamine C (ascorbaat) speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Bijvoorbeeld, in de hersenen, ascorbaat handelt in een neuroprotectieve en neuromodulatory manier die ascorbaat fietsen tussen neuronen en astrocyten vicinaal betreft - een relatie die lijkt cruciaal voor de hersenen ascorbaat homeostase te zijn. Daarnaast opkomende er sterke aanwijzingen dat ascorbaat heeft een sterk uitgebreide rol in het reguleren van de cellulaire en systemische ijzer metabolisme dan is klassiek erkend. De toenemende erkenning van de integrale rol van ascorbaat in normale en gedereguleerde cellulaire en organismale fysiologie vereist een reeks middelgrote doorvoer en zeer gevoelige analytische technieken die kunnen worden uitgevoerd zonder de noodzaak van zeer dure specialistische apparatuur. Hier geven we expliciete instructies een middelgrote doorvoer, specifieke en relatief goedkoop microplate assay voor de bepaling van boe intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.
Introduction
De ontdekking van de chemische aard van ascorbinezuur (vitamine C) en de identificatie als het lang gezochte "anti-scheurbuik factor", door Albert Szent-Györgyi en anderen in papers 1928-1934 1 werden mijlpalen in de geschiedenis biochemie. Inderdaad, deze ontdekkingen hebben bijgedragen aan Szent-Györgyi de toekenning van de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 1937. De steeds groeiende reeks van rollen voor ascorbaat in dierlijke en plantaardige fysiologie, evenals de menselijke gezondheid, blijven de onderwerpen van actieve wetenschappelijke zijn onderzoek en controverse.
L-ascorbaat is een overvloedige fysiologisch reductiemiddel en enzym cofactor in zoogdierlijke systemen en draagt talrijke welbepaalde enzymatische reacties die collageen hydroxylering, carnitine en norepinefrine biosynthese, tyrosine metabolisme en peptide hormoon amidering 2. Intrigerend, montage evidence stelt ascorbaat speelt een rol bij het stimuleren van andere ijzer-afhankelijke dioxygenases, zoals prolyl-en asparaginyl hydroxylases betrokken bij de hydroxylering en de gerichtheid van de hypoxia-induceerbare factor (HIFs) 1α en 2α 3. Een recent rapport blijkt dat ascorbaat speelt een rol in de T-cel rijping, door invloed chromatine demethylation via haar activiteiten in het stimuleren van de nucleaire hydroxylases, Jumonji C (JmjC) domein eiwitten; waarvan de laatste lijken te ascorbaat voor de volledige activiteit 4 nodig. Inderdaad lijkt de stimulatie van dergelijke enzymen door ascorbaat plaatsvinden via een vergelijkbaar mechanisme om de stimulatie door ascorbaat van de HIF en collageen hydroxylases. Onder andere klassieke effecten, ascorbaat aanzienlijk bij tot cellulaire antioxidatie als een in water oplosbare keten vrijkomen radicalen 5 en de recycling van plasmamembraan α-tocoferol (vitamine E) via de vermindering van de α-tocopheroxyl groep 6, which is belangrijk bij de bescherming tegen membraan lipide peroxidatie 7. Belangrijk, hoewel de meeste zoogdieren kunnen de novo hepatische synthese van ascorbaat uit D-glucose, hogere primaten, cavia's en sommige knuppels afhankelijk voedingsbronnen van vitamine 8. Dit is vanwege inactivering van de Gulo gen, de orthologen van die onaangetast zoogdieren coderen voor het enzym, γ-gulono-lacton oxidase 9-13. Dit enzym is vereist voor de laatste reactie in ascorbaat biosynthese uit glucose 13.
Na-transporter gemedieerde absorptie vanuit het darmlumen in mensen wordt ascorbaat hele lichaam verspreid door de bloedsomloop. De vitamine is doorgaans te vinden in zijn gereduceerde vorm bij millimolaire concentraties intracellulair (met de opmerkelijke uitzondering van erytrocyten waarin de concentraties zijn meestal vergelijkbaar met de gangbare plasma concentratie), en bij micromolaire concentrations (bijv. 50-200 uM) in de meeste extracellulaire vloeistoffen 14,15.
Onder fysiologische omstandigheden, ascorbaat ondergaat typisch een omkeerbare een elektron oxidatie tot het ascorbinezuur vrije radicalen (AFR, ook bekend als monodehydroascorbate of semidehydroascorbate). Terwijl de AFR is een relatief stabiel radicaal 16, bij het ontbreken van een snelle een-elektron enzymatische reductie terug naar ascorbaat, kunnen twee AFRS dismutate verder een ascorbaat en een dehydroascorbaat (DHA) 9,13,17. In het inwendige van de cel, de twee-elektron oxidatieproduct ascorbaat, DHA, kunnen snel naar ascorbaat verminderd glutathion en NAD (P) H-afhankelijke enzymatische en niet-enzymatische reacties 13.
Hoewel het klassiek wordt aanvaard dat ascorbaat enige belangrijke rol in het metabolisme van ijzer is om de voeding absorptie van non-heem ijzer 18 stimuleren, hebben wij en anderen leverde bewijs strongly suggereert dat ascorbaat speelt een aanzienlijk grotere rol in het metabolisme van dit metaal. Ten eerste lijkt ascorbaat die vrijkomt door ascorbaat-vol-cellen een belangrijke rol spelen bij het moduleren van de opname van niet-transferrine gebonden ijzer door cellen 19,20, en zeer recente gegevens blijkt dat ascorbaat moduleert ook de opname van transferrine gebonden ijzer door cellen 21, deze overeenkomt met een grote fysiologische ijzeropname-route 22.
Ascorbaat is essentieel voor normale centraal zenuwstelsel functie zoogdieren 23,24. Samen met de bijnierschors, hypofyse, thymus, netvlies en gele lichaam, de hersenen bevat hoge concentraties ascorbaat ten opzichte van andere lichaamsweefsels 23,25-27. Bovendien wordt de blootstelling van zowel astrocyten 28,29 en neuron-achtige cellen 30 tot glutamaat waarover de afgifte van ascorbaat leiden in de extracellulaire ruimte, waarbij de ascorbate wordt gedacht om te helpen neuronen beschermt tegen glutamaat-geïnduceerde neuronale dysfunctie 31. Hoewel het exacte mechanisme van glutamaat-geïnduceerde ascorbaat vrijlating uit de astrocyten onbekend is, hebben we onlangs bewijs geleverd waaruit blijkt de betrokkenheid van de cel zwelling veroorzaakt door glutamaat opname door de astrocyten glutamaat en aspartaat transporter (GLAST; ook bekend prikkelende aminozuurtransporter isovorm 1 [EAAT1 ] bij de mens) en daaropvolgende activatie van volume-gevoelige osmolyt en anionkanalen (VSOACs) dat doorlaatbaar is voor kleine organische anionen zoals ascorbaat 32 zijn. De moleculaire identiteit van de plasmamembraan leidingen die deze VSOAC formatie nog worden geïdentificeerd 33,34.
Hoewel veel assays ontwikkeld voor het bepalen van ascorbaat in biologische monsters, die spectrofotometrische, fluorometrische en chromatografische bepalingen 35,36 zijn er grote variatie in specificiteit, gevoeligheid, interference door chemische contaminanten, effectieve lineaire bereik en de stabiliteit van het eindpunt analyt. Bovendien, andere belangrijke factoren beïnvloeden de assay snelheid, gebruiksgemak en toegang tot betrekkelijk gespecialiseerde apparatuur zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) apparaat.
Hier presenteren we een eenvoudige en zeer specifieke colorimetrische microplate assay voor de bepaling van intracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen, evenals een afzonderlijke assay voor de bepaling van ascorbaat-uitstroming uit gekweekte cellen. De laatste test is bedoeld om het probleem van de onderschatting van ascorbaat vrijlating uit de cellen te omzeilen door snelle heropname van vrijgegeven ascorbaat door natrium-afhankelijke ascorbaat transporters (SVCTs). Hoewel beide van deze methoden zijn verschenen in een aantal van onze eerdere publicaties 19,20,32,37,38, dit manuscript biedt een expliciete set van instructies en richtsnoeren voor de daadwerkelijke uitvoering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bepaal Intracellular Ascorbate in gekweekte cellen
- Celcultuur en oogsten
- Grow schorsing (bv. menselijke erythroleukemie, K562) of aanhangende cellen (bijv. primaire astrocyten) met behulp van standaard cultuur procedures 19-21,32,38. Opmerking: om ervoor te zorgen cellen bevatten ascorbaat, laden gekweekte cellen met ascorbaat hetzij als ascorbaat of DHA 33,39.
- Maak een-ascorbaat met cellulaire extract
- Incubeer een passend aantal fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-gewassen schorsing of hechtende cellen met 450 pi van ijskoude Cell Permeabilisatie Buffer [CPB; 0,1% (gew / vol) saponine in PBS; 4 ° C]. Opmerking: Bepaal het aantal cellen nodig is om een absorptiewaarde binnen het lineaire bereik van de assay te verkrijgen (zie hieronder) empirisch door de eindgebruiker. Opmerking: weefsel extracten kunnen ook worden gebruikt (zie Overleg voor meer details).
- Agitate cellen op ijs gedurende 10 minuten grondig celafbraak waarborgen.
- Een geklaarde-ascorbaat bevattende intracellulaire extract verwijderen celresten door centrifugeren van het ruwe lysaat bij 16.000 x g gedurende 5 min in een gekoelde microcentrifuge (4 ° C).
- Verwijder voorzichtig 4 x 100 pi aliquots van elk monster en aan een horizontale reeks van putjes in een 96-well plaat met vlakke bodem die ofwel 25 ul / putje PBS ("AO") alleen of 25 ul / putje van 45,5 U bevat / ml voorraad oplossing van L-ascorbaat-oxidase (AO) in PBS ("+ AO"). Opmerking: dit moet parallel met de opstelling van de normen (zie hieronder).
- Ascorbaat standaard-curve constructie (moet opnieuw worden gebouwd voor elke test)
- Bereid een voorraadoplossing van 10 mM ascorbinezuur in ijskoude PBS. Let op: Controleer de concentratie van ascorbaat spectrofotometrisch met behulp van een kwarts cuvet met een 1cm weglengte bij 265 nm (extinctiecoëfficiënt = 14,5 mM -1 cm -1) 40.
- Stelt een reeks standaarden ascorbaat tussen 0 en 20 uM voorzichtig.
- Parallel met stap 1.2.4, verwijder 4 x 100 ul aliquots van elke standaard en aan een horizontale reeks van putjes in een 96-well plaat met vlakke bodem die 25 ul / putje bevat PBS ("AO") of 45.5 U / ml stockoplossing van AO in PBS ("+ AO"). Opmerking: 100 pl van de bovengenoemde ascorbaat normen 0-2 nmol ascorbaat bevatten. Let op, het doel van de AO is om te controleren voor de bijdrage van niet-ascorbaat reductanten tot vermindering ferricyanide.
- Bepaal intracellulaire ascorbaat - Stap 1: selectief verwijderen ascorbaat en kwantitatief oxideren ascorbaat met ferricyanide
- Orbitaal meng de 96-well plaat bij 550 tpm bij kamertemperatuur gedurende 5 min in het donker door het bedekken van de plaat in folie. Opmerking: Tzijn stap moeten alle ascorbaat oxideren in de "+ AO" putten DHA. De "AO" bronnen moeten worden beïnvloed.
- Voeg 50 ul van 3,5 mM kaliumferricyanide in PBS (hierna "ferricyanide") aan alle putjes. De uiteindelijke [ferricyanide] = 1 mM. Opmerking: Gebruik een multipipettor.
- Orbitaal meng de plaat bij 550 tpm bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 5 minuten in het donker. Opmerking: Deze stap moet leiden tot een vermindering van ferricyanide tot ferrocyanide door ascorbaat in een stoichiometrische verhouding van 2 moleculen ferricyanide verlaagd per 1 molecuul ascorbaat geoxideerd.
- Voeg onmiddellijk 25 ul van een vers geconstrueerde oplossing met 50% (v / v) azijnzuur en 30% (w / v) trichloorazijnzuur (TCA). Opmerking: Gebruik een multipipettor.
- Bepaal intracellulaire ascorbaat - Stap 2: het kwantificeren hoeveelheid ferrocyanide gevormd 37
- Voeg 100 ul van ferrocyanide vastberadenheid oplossing 37 tot each goed. Opmerking: Een werkende oplossing moet onmiddellijk voor het gebruik te worden gemaakt: 2 ml 3 M Na-acetaat (pH 6,0); 0,5 ml ijsazijn (~ 17,4 M azijnzuur); 2 ml 0,2 M citroenzuur; 2 ml 3,3 mM FeCl3 in 0,1 M azijnzuur; 1 ml 30 mM ferene-S. Het eindvolume van de werkoplossing moet 7,5 ml.
- Orbitaal meng de plaat in het donker bij 550 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur geroerd.
- Lees de absorptiewaarden van de putjes bij 593 nm (het absorptiemaximum van de Fe (II) (ferene-S) 3 complex).
- Bereken de hoeveelheid intracellulaire ascorbaat als nmol ascorbaat per miljoen cellen door eerst het aftrekken van de A 593 nm waarden voor de '+ AO' putten uit de overeenkomstige '- AO' wells voor elk monster en het interpoleren van de ascorbaat standaardkromme (zie stap 1.3 ). Bij de bouw van de standaard curve, plotten dit "verschil waarde" voor elk standaard tegen de hoogte van ascorbaten per putje.
2. Bepaling van ascorbaat-efflux van gekweekte cellen
- Celcultuur en oogsten
- Grow schorsing of aanhangende cellen zoals hierboven (zie stap 1.1). Opmerking: het uitvoeren van de onderstaande test in een 24-well plat formaat met schorsing en hechtende cellen voor de beste resultaten.
- Resuspendeer cellen suspensie of overlay hechtende cellen met 400 ul voorverwarmde HEPES-gebufferde zoutoplossing, met of zonder calcium en magnesium bevattende 5 mM D-glucose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) in putjes van een 24-wells plaat. Voeg dezelfde hoeveelheid HBS / D gespecificeerde celvrije putjes op elke plaat met 24 putjes worden onderzocht. Opmerking: deze zal dienen als celvrij controles voor de basislijn reactie (zie hieronder).
3. Bepaal de hoeveelheid Ascorbate Uitgebracht
- De volgende voorraad oplossingen moeten van tevoren worden bereid: 120U / ml AO in HBS / D (vers bereid); 2,4 mm Ferene-S in HBS / D; 120 uM FeCl3 en 600 uM Na-citraat in HBS / D (onmiddellijk bereiden van meer geconcentreerde voorraad oplossingen).
- Om de ferrireduction reactie (eindvolume per putje moet 600 pi zijn) te starten, voeg de volgende hoeveelheden leveren aan elk putten reeds met 400 ul van HBS / D:
- Voeg 50 ul van AO (120 E / ml) of HBS / D om putten in drievoud gekoppeld. De uiteindelijke AO concentratie dient 10 E / ml zijn. Opmerking: Label gepaarde putten als "- AO" en "+ AO".
- Meng de platen met zachte orbitale mengen gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 50 ul van 2,4 mM ferene-S aan alle putjes. De uiteindelijke ferene-S concentratie moet 200 uM. Meng de platen zoals hierboven voor 5 min bij 37 ° C.
- Voeg 50 ul van vers bereide 120 uM ijzercitraat. De uiteindelijke ijzer en citraatconcentraties moet 10 uM ijzer en 50 uM citraat zijn. Meng goed.
- In drie drievoud controle putten, zuig het bovenliggende medium en voeg 600 ul HBS / D met 0,1% saponine. Opmerking: Deze zullen als "100% cel-lysis" regelaars voor een lactaat dehydrogenase (LDH) afgifte assay worden parallel uitgevoerd (zie hieronder).
- Incubeer gedurende 60 min in het donker bij 37 ° C.
- Aan het einde van de ascorbaat-efflux assay snel zuigen 500 pl van elk putje toevoegen adequaat geëtiketteerd putten in een 24-wells plaat. Opmerking: voor suspensiecellen aanvankelijk de cellen verwijderd door centrifugeren bij 4 ° C.
- Voeg 300 ul aliquots van het supernatant van een 96-well plaat en lees bij 593 nm.
4. Bepaling van extracellulaire ascorbaat
- Lees de absorptiewaarden van de putjes op 593 nm.
- Bereken de hoeveelheid extracellulaire ascorbaat als nmol ascorbaat per mg eiwit (of per miljoen cellen) zoals beschreven voor de bepaling van intracellulaire ascorbaatin stap 1.5.4. Let op: de eindgebruiker dient te optimaliseren zodat ascorbaat vrijlating niet wordt beperkt door intracellulaire ascorbaat.
5. Bepaling van LDH release
- Met de resterende 200 ul van extracellulaire oplossing van elk monster voeren een LDH afgifte test 32,41 om de mate van cellulaire lysis. Opmerking: berekenen als% van totale afgeefbare LDH. Bepaal losmaakbare LDH uit de monsters die werden behandeld met 0,1% saponine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bepaling van intracellulaire Ascorbate in gekweekte suspensiecellen
In het eerste assay (figuur 1), wordt bepaald intracellulaire ascorbaat, na ascorbaat-specifieke (bijvoorbeeld AO-gevoelige) reductie van ferricyanide tot ferrocyanide, met de zeer gevoelige bepaling van ferrocyanide een eerder gepubliceerde werkwijze 37. De detectie van ascorbaat is gebaseerd op de colorimetrische chelatie van ferro-ijzer dat wordt gegenereerd door de ascorbaat-afhankelijke reductie van ferricyanide tot ferrocyanide, gevolgd door de reductie van ijzer tot tweewaardig ijzer met ferrocyanide. Zoals suprafysiologische concentraties van sommige tweewaardige metaalionen (bijvoorbeeld Cu 2 +, Co 2 + en Zn 2 +) kunnen interfereren, vermoedelijk door te concurreren met ferro-ijzer voor chelatietherapie door ferene-S, moeten passende voorzorgsmaatregelen worden genomen onder dergelijke omstandigheden 37.
Figuur2 toont een typische standaard curve voor een set van ascorbaat normen 0-20 uM (of 0-2 nmol ascorbaat per putje van de 96-well plaat, zie stap 6.5 in het "Protocol".). Hoewel in deze figuur niet getoonde, lineariteit wordt gehandhaafd tot 8 nmol ascorbaat per putje (een netto Een 593 nm van ~ 1,6), wat overeenkomt met een monster ascorbaat concentratie van ~ 80 uM. De test kan worden gebruikt om ascorbaat niveaus succesvol detecteren dan 0,25 nmol ascorbaat per putje (2,5 pM monster ascorbaat concentratie).
K562 cellen snel te accumuleren intracellulaire ascorbate van extracellulaire DHA, maar niet ascorbaat (zie figuur 3, overgenomen met toestemming van Lane en Lawen 2008 19). In dit representatieve experiment werden PBS-gewassen K562-cellen (4 x 10 6 cellen / ml) geïncubeerd in PBS met 500 pM of ascorbaat (Asc), DHA, DHA + 50 uM cytochalasine B (DHA + CB), Asc + 5 mM ferricyanide (Asc / FIC) of Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) gedurende 30 min bij 37 ° C. Intracellulaire ascorbaat werd bepaald zoals beschreven in de "protocol".
DHA opname door K562 cellen gebeurt door faciliterende glucose transporter (GLUT)-gemedieerd transport (zie figuur 4, overgenomen met toestemming van Lane en Lawen 2009 42). Om de betrokkenheid van gluts DHA opname in deze representatief experiment evalueren, werden K562 cellen geïncubeerd met toenemende concentraties van cytochalasine B (CB) of dihydrocytochalasin B (H2 CB) opgelost in MBS dat 0,5% ethanol gedurende 15 minuten bij 37 ° C vóór incubatie met 400 uM DHA gedurende 30 minuten bij 37 ° C in hetzelfde medium (Fig. 4A). Cellen werden vervolgens driemaal gewassen met 100 volumes ijskoude MBS en hun intracellulaire ascorbaat bepaald zoals beschreven in de "protocol". Het is belangrijk op te merken terwijl zowel CB en H2 CB remmen beweeglijke processen bij micromolaireconcentraties (1-100 uM), alleen CB, die verschilt van H2 CB door de aanwezigheid van enkele dubbele binding remt GLUT-afhankelijk transport bij lage micromolaire concentraties (1-10 uM) 43. Daarom DHA opname geremd worden door CB met een IC50 <2,5 uM, maar was niet geremd door H 2 CB, DHA opname waarschijnlijk optreedt door GLUT-gemedieerd transport 38. Ook in figuur 4B, gewassen cellen werden blootgesteld aan toenemende concentraties van de GLUT-verplaatsbare, maar niet-metaboliseerbare glucose analoog 3 - O-methyl-D-glucose (3-OMG) of de niet-GLUT-verplaatsbare glucose stereoisomeer L - glucose voorafgaand aan incubatie met DHA als in paneel A. Ook de resultaten blijkt GLUT betrokkenheid DHA tot invoer remming van intracellulaire accumulatie ascorbaat treedt alleen op in aanwezigheid van de GLUT-vervoerbare glucose analoog.
Determinatie van Ascorbaat-Efflux van hechtende cellen
In de tweede test, kan de snelheid van ascorbaat-efflux van gekweekte cellen worden bepaald. Deze specifieke test is belangrijk omdat het vrijkomen van ascorbaat uit cellen blijkt cruciaal voor het ascorbaat-gereguleerde cellulaire opname van niet-transferrine gebonden ijzer door cellen 19,20 te zijn. De opname van niet-transferrine gebonden ijzer wordt beschouwd als de pathofysiologie van ijzer-overbelasting aandoeningen zoals hemochromatoses 22, alsmede astrocyt-neuron ijzer uitwisseling en homeostase in de hersenen van zoogdieren 22 relevant. Inderdaad hebben we onlangs aangetoond dat de belangrijkste excitatoire neurotransmitter, L-glutamaat, leidt tot het vrijkomen van ascorbaat uit astrocyten op een wijze die afhangt van L-glutamaat opname door GLAST en daaropvolgende cellulaire zwelling die de afgifte van ascorbaat door veronderstelde VSOACs 32 triggers. In analogie ascorbaat rElease van ascorbaat-loaded astrocyten kan worden gestimuleerd door de prikkelende aminozuren, L-aspartaat, maar niet de niet-exciterende aminozuur L-glutamine. Dit effect is weergegeven in Figuur 5 (weergegeven met toestemming van Lane en Lawen 2012 32) die dosis-respons curven toont voor het stimuleren van ascorbaat (AA) afgifte van aspartaat (dichte cirkels) en glutamine (open cirkels) van primaire, -ascorbaat geladen muis astrocyten.
Het is belangrijk om te bespreken hoe dit ascorbaat-efflux assay verschilt van de test bedoeld voor de bepaling van intracellulaire ascorbaat. Het belangrijkste verschil ligt in het feit dat het niveau van ascorbaat resterende oplossing wordt bepaald door een chemische reactie uitgevoerd aan het einde van een gegeven tijdstip, zoals het geval is voor de intracellulaire ascorbaat bepalingsmethode. In plaats daarvan wordt een "reductieve handtekening" geaccumuleerdegedurende de periode waarin ascorbaat wordt vrijgemaakt uit cellen. Deze reductieve handtekening wordt vastgelegd in de vorm van ascorbaat-afhankelijke reductie van extracellulair ferricitraat gevolgd door de snelle chelatie van het ferro-ijzer als een groot extracellulair en membraan-impermeant [Fe (II) (ferene-S) 3] 4 - chelaat . Ferene-S kan worden beschouwd soortgelijke membraan-impermeant via korte tijdsverloop van de test. De niveaus van deze chromogene complex kan dan worden bepaald als eindpunt meting. Aangezien alleen de AO-gevoelige niveaus van dit chelaat bepaald, de test levert een hoge mate van specificiteit voor de bepaling van extracellulair L-ascorbaat.
Figuur 1. Stroomdiagram toont de belangrijkste stappen in het protocol voorde bepaling van intracellulaire ascorbaat.
Figuur 2 Een typische standaard curve voor een set van ascorbaat normen 0-20 uM.. (Of 0-2 nmol ascorbaat per putje van de 96-well plaat;. Zie stap 6.5 in het "Protocol") Foutbalken worden niet als zij binnen het bereik bezet door de symbolen.
Figuur 3. K562 cellen snel accumuleren intracellulaire ascorbaat uit extracellulaire DHA, maar niet ascorbaat. PBS gewassen K562-cellen (4 x 10 6 cellen / ml) werden geïncubeerd in PBS met 500 pM of ofwel ascorbaat (ASC), DHA, DHA + 50 B uM cytochalasine (DHA + CB), ASC + 5 mM ferricyanide (ASC / FIC) of ASC + 50 E / ml AO (ASC / AO) gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Intracellulaire ascorbaat werd bepaald zoals beschreven in de "protocol". De getoonde resultaten zijn gemiddelden van drie individuele experimenten (+ SD). * De intracellulaire ascorbaat concentratie werd geschat met behulp van een vooraf bepaalde intracellulaire water ruimte voor K562-cellen (dwz ~ 1.6 μl/106 cellen) 19,20. Dit cijfer is overgenomen met toestemming van Lane en Lawen 2008 19.
Figuur 4. DHA opname door K562 cellen gebeurt door faciliterende glucose transporter (GLUT)-gemedieerd transport. K562 cellen die waren gegroeid tot 6-8 x 10 6 cellen / ml in RPMI + 10% (v / v) foetaal runderserum bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% lucht aanvankelijk drie keer gewassen met MBS. Gewassen cellen werden vervolgens blootgesteld aan toenemende concentraties van cytochalasine B (CB, Sigma) of dihydrocytochalasin B (H2 CB) opgelost in Mops-gebufferde zoutoplossing (MBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na +, pH 7,3 ) dat 0,5% ethanol vóór incubatie met 400 uM DHA gedurende 30 minuten bij 37 ° C (A). Cellen werden vervolgens driemaal gewassen met 100 volumen koude MBS en hun intracellulaire ascorbaat bepaald zoals beschreven in de "protocol". DHA opname geremd worden door CB, maar niet H 2 CB, DHA opname gebeurt door-GLUT gemedieerd transport. Ook in (B), gewassen cellen werden blootgesteld aan toenemende concentraties van de GLUT-verplaatsbare, maar niet-metaboliseerbare glucose analoog 3 - O-methyl-D-glucose (3-OMG) of de niet-GLUT-vervoerbare glucose stereoisomeer (A). Opnieuw de resultaten geven GLUT betrokkenheid bij DHA opname. Dit cijfer is overgenomen met toestemming van Lane en Lawen 2008 42.
Figuur 5. Ascorbaat afgifte uit-ascorbaat loaded astrocyten wordt gestimuleerd door de prikkelende aminozuur L-aspartaat, maar niet de niet-exciterende aminozuur L-glutamine. Deze figuur toont dosis-respons curves voor de stimulatie van ascorbaat (AA) vrijgave door aspartaat (gesloten cirkels) en glutamine (open cirkels) van primaire kweken van-ascorbaat geladen muis astrocyten. De getoonde gegevens zijn gemiddelden (± SD) van drie experimenten. P <0,001 vsde 'basale' conditie. Dit cijfer is overgenomen met toestemming van Lane en Lawen 2012 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel presenteren we twee snelle, specifieke en relatief gevoelige colorimetrische microplate assays voor het bepalen van ascorbaat afgeleid van de intra-en extracellulaire compartimenten in gekweekte cellen. De testen kunnen worden aangevuld met toegang tot standaard laboratorium apparatuur en reagentia. Het slechts matig duur reagens die voor de test is AO, die essentieel omdat het zorgt voor een hoge mate van specificiteit analyt naar L-ascorbaat. De testen zijn goed geschikt om ofwel suspensiecellen (bijv. K562) of aanhangende cellen (bv HepG2 of primaire knaagdier astrocyten), en zijn met succes toegepast in eerdere publicaties gebruik van dergelijke cellen 19,20,32,37,38. Het gebruik van andere ascorbaat oxiderende middelen (bv. Tempol) in plaats van AO moet worden vermeden omdat ze niet specifiek genoeg zijn voor L-ascorbaat. Bovendien kan het gebruik van verbindingen zoalsTEMPOL in de ascorbaat-afgifte test zal worden beschaamd door het vermogen van Tempol om cellulaire membranen te passeren en oxideren intracellulaire ascorbaat 44. AO is in wezen membraan-impermeant over de tijd cursussen gebruikt.
Wij hebben directe vergelijkingen van de resultaten verkregen met de colorimetrische ascorbaat bovenbeschreven bepaling en de fluorometrische ascorbaat bepaling van Vislisel en collega's 36 resultaten uitgevoerd. We vonden dat beide testen gaven identieke resultaten voor de intracellulaire ascorbaat bepaling assay (gegevens niet getoond). Interessant is dat de ascorbaat-afgifte assay hierboven beschreven, gaf significant hogere waarden voor de schijnbare snelheid ascorbaat efflux dan de fluorometrische assay eindpunt. Dit suggereert dat de ascorbaat-efflux assay hierin beschreven maakt de bepaling van de schijnbare "ascorbaat-efflux 'die niet zo gemakkelijk wordt verstoord door de waarschijnlijkheid van ascorbaat heropname door cellen; een werkwijze die waarschijnlijk pl impliceertasma membraan SVCTs. Dergelijke heropname zou neigen tot een onderschatting van het werkelijke niveau van ascorbaat dat gedurende een bepaalde periode werden uitgebracht als een eindpunt ascorbaat meting werd genomen veroorzaken. Er zij opgemerkt dat als weefselmonsters (bijvoorbeeld spieren, longen of hersenen) worden gebruikt in plaats van gekweekte cellen voor intracellulaire ascorbaat bepaling assay dan een weefsel homogenaat worden geconstrueerd met ijskoud CPB en een vorm van mechanische verbreking ( bv dounce homogenisering, probe-tip sonificeren Franse pers enz.). Cellulair puin moeten worden verwijderd door centrifugeren en de gebruiker moet de eventuele noodzaak voor het monster deproteinization en / of toevoeging van proteaseremmers rekening houden voordat u stap 1.2.4.
We hebben ook eerder gerapporteerd dat lage micromolaire concentraties van cytochalasine B (<10 uM) heeft de schijnbare snelheid van ascorbaat-efflux die werden bepaald door de test 32 niet remmen 19, 20,38.
Er zijn een aantal cruciale stappen in deze protocollen. Ten eerste, de hierin beschreven bepalingen kritisch afhankelijk van het vermogen van AO selectief en snel ascorbaat verwijderen gepaarde. Als de specifieke activiteit van het preparaat van AO aanmerkelijk lager dan de nominale en veronderstelde activiteiten, is het mogelijk dat niet alle ascorbaat in de AO-bevattende samples zullen worden verwijderd. Dit kan leiden tot een onderschatting van de hoeveelheid ascorbaat in de onbekende monsters bij gebruik van de "directe methode" naar de hoeveelheid ascorbaat aanwezig berekenen. Indien men gebruik maakt van de "standaard-curve methode", die wordt aanbevolen, lage activiteit bereidingen van AO slechts leiden tot een verlies van assay-gevoeligheid. We hebben gevonden dat goede resultaten consistent met bereidingen van AO geconstrueerd worden verkregen door oplossen van 1000 U AO in 1 ml van ofwel PBS of MBS, die vervolgens wordt verdeeld in 100 ul aliquots die worden bewaard bij -80 ° C gedurende niet meer dan een maand. Verder, zoals AO is een eiwit dat proteolytisch kan worden afgebroken door cellysaten, proteaseremmers kunnen op cellysaten toegevoegd vóór toevoeging van de lysaten op de AO-bevattende putjes. Dit kan een nuttige wijziging te overwegen wanneer het gebruik van mobiele of weefsellysaten die rijk zijn aan protease activiteit zijn.
Bovendien is de gevoeligheid van de testen beschreven eenbove hangt grotendeels af van het gebruik van de chromogene bidentaat Fe (II)-chelator, Ferene-S. Deze chelator kan worden vervangen door chemisch soortgelijke chelatoren zoals ferrozine en bathophenanthroline disulfonaat, maar met een vermindering van de gevoeligheid overeenkomt met de extinctiecoëfficiënt van de Fe (II) chelaten 37. Bovendien moet erop worden gelet bij het gebruik bathophenanthroline disulfonaat, als het lijkt te leiden tot hogere tarieven van schijnbare autocatalytische ferrireduction in de aanwezigheid van ijzer citraat complexen dan Ferene-S of ferrozine 37,45. Dit is een relevant belang bij de ascorbaat-afgifte test als niet-ascorbaat-afhankelijke weergave van de Fe (II)-chelaat is de gevoeligheid van de assay verlagen.
Hoewel de intracellulaire ascorbaat-bepaling assay Geschikt hechtende cellen moeten losmaken van dergelijke cellen voor cellulaire lyse worden uitgevoerd door mechanische schrapen dan trypsine / EDTA. Trypsine is een proteasezal waarschijnlijk negatief interfereren met de ascorbaat-uitputting stap met AO, de laatste is een eiwit. Daarnaast zal de EDTA waarschijnlijk interfereren met de FOC bepaling stap chelerende ijzer in concurrentie met ferene-S 37. Dergelijke middelen moeten worden vermeden. Tenslotte, het ascorbaat afgifte test kan gemakkelijk worden aangepast voor suspensiecellen. In plaats van het opzuigen van de bovenliggende Fe (II) (ferene-S) 3-bevattende chelaat aan het einde van de test, de cellen worden snel gesedimenteerd door centrifugatie en voor de intracellulaire ascorbaat-bepaling assay. De absorptie bij 593 nm van de supernatant moet dan worden bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar voor Dr Stephen Robinson en mevrouw Hania Czerwinska (Monash University) voor de genereuze aanbod van astrocyten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
References
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
- Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
- Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
- Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
- Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
- Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
- Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
- Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
- Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
- Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
- Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
- Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
- May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
- Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
- Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
- Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
- Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
- Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
- Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
- Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
- Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
- Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
- Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
- Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
- Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
- Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
- Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
- Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
- Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
- Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
- May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
- Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).
