Summary
El ascorbato desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Aquí se describe un rendimiento medio, ensayo específico y de bajo costo de microplacas para la determinación tanto de ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.
Abstract
La vitamina C (ascorbato) desempeña numerosos papeles importantes en el metabolismo celular, muchos de los cuales sólo han salido a la luz en los últimos años. Por ejemplo, dentro del cerebro, ascorbato actúa de una manera neuroprotector y neuromodulador que implica el ciclismo ascorbato entre las neuronas y astrocitos vecinales - una relación que parece ser crucial para la homeostasis ascorbato cerebro. Además, la evidencia emergente sugiere fuertemente que el ascorbato tiene un papel ampliado en gran medida en la regulación del metabolismo del hierro celular y sistémica que se reconoce clásicamente. El creciente reconocimiento del papel integral de ascorbato en la fisiología celular y del organismo normal y desregulado exige un rango de mediano rendimiento y alta sensibilidad técnicas analíticas que se pueden ejecutar sin la necesidad de equipo especializado altamente costoso. Aquí proporcionamos instrucciones explícitas para un medio de rendimiento, ensayo específico y relativamente barato microplaca para la determinación de la boª ascorbato intra y extracelular en cultivos de células.
Introduction
El descubrimiento de la naturaleza química del ácido ascórbico (vitamina C), y su identificación como el largamente buscado "factor anti-escorbuto", de Albert Szent-Györgyi y otros en los artículos publicados desde 1928 hasta 1934 1 han sido hitos importantes en la historia de la bioquímica. De hecho, estos descubrimientos han contribuido a Szent-Györgyi siendo galardonado con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1937. La suite en constante expansión de los roles de ascorbato en la fisiología animal y vegetal, así como la salud humana, siguen siendo los temas de activo científica investigación y controversia.
L-ascorbato es una abundante reductor fisiológica y la enzima cofactor en sistemas de mamíferos, y contribuye a numerosas reacciones enzimáticas bien definidas que implican la hidroxilación del colágeno, carnitina y la biosíntesis de norepinefrina, metabolismo de la tirosina y de la hormona péptido amidación 2. Curiosamente, evide montajena vez que sugiere que el ascorbato juega un papel en la estimulación de otras dioxigenasas dependientes de hierro, tales como las prolil hidroxilasas y asparaginilo implicados en la hidroxilación y la orientación de los factores inducibles por hipoxia (HIF) 1α y 2α 3. Un informe reciente sugiere que el ascorbato juega un papel en la maduración de células T a través de desmetilación que afecta a la cromatina a través de su actividad en la estimulación de las hidroxilasas nucleares, Jumonji C (JmjC) dominio de las proteínas; el último de los cuales parecen requerir ascorbato para la plena actividad 4. De hecho, la estimulación de tales enzimas por el ascorbato parece ocurrir por un mecanismo similar a la estimulación por el ascorbato de las hidroxilasas de HIF y de colágeno. Entre otros efectos clásicos, ascorbato contribuye significativamente a la antioxidación celular como una cadena-romper eliminador de radicales soluble en agua 5 y para el reciclaje de membrana plasmática α-tocoferol (vitamina E) a través de la reducción de la α-tocoferoxilo radical 6, Which es importante en la protección contra la peroxidación lipídica de la membrana 7. Es importante destacar que, aunque la mayoría de los mamíferos son capaces de la síntesis hepática de novo de ascorbato a partir de D-glucosa, primates superiores, conejillos de indias y algunos murciélagos dependen de fuentes dietéticas de la vitamina 8. Esto es debido a la inactivación del gen GULO, los ortólogos de mamíferos que en no afectados codifican la enzima, γ-gulono-lactona oxidasa 9-13. Esta enzima es necesaria para la reacción final en la biosíntesis de ascorbato a partir de glucosa 13.
Después de la absorción mediada por transportador desde la luz intestinal en los seres humanos, ascorbato se distribuye por todo el cuerpo por el sistema circulatorio. La vitamina se encuentra típicamente en su forma reducida en concentraciones milimolares intracelularmente (con la notable excepción de los eritrocitos en la que las concentraciones son típicamente similar a la concentración de plasma que prevalece), y en HCl conc micromolarentrations (por ejemplo 50-200 micras) en la mayoría de los fluidos extracelulares 14,15.
En condiciones fisiológicas, ascorbato típicamente se somete a una oxidación de un electrón reversibles a la libre radical ascorbilo (AFR; también conocido como monodehydroascorbate o semidehydroascorbate). Mientras que la AFR es un radical relativamente estable 16, en ausencia de su rápida reducción enzimática de un electrón de nuevo a ascorbato, dos AFR pueden más dismutan a uno ascorbato y uno deshidroascorbato (DHA) 9,13,17. En el interior de la célula, el producto de oxidación de dos electrones de ascorbato, el DHA, se puede reducir rápidamente de nuevo a ascorbato por el glutatión-y NAD (P) H-enzimática dependiente y reacciones no enzimáticas 13.
Si bien se acepta que clásicamente único papel importante de ascorbato en el metabolismo del hierro es el de estimular la absorción dietética de hierro no hemo 18, nosotros y otros han aportado pruebas de strongly lo que sugiere que el ascorbato juega un papel ampliado en gran medida en el metabolismo de este metal. En primer lugar, ascorbato que se libera por las células-ascorbato repleta parece jugar un papel importante en la modulación de la absorción de hierro no unido a transferrina por las células 19,20, y la evidencia reciente indica que el ascorbato también modula la absorción de hierro unido a transferrina por las células 21, el último de los cuales corresponde a una ruta principal de hierro-captación fisiológica 22.
Ascorbato es esencial para la función normal del sistema nervioso central de los mamíferos 23,24. Junto con la corteza suprarrenal, glándula pituitaria, el timo, la retina y el cuerpo lúteo, el cerebro contiene altas concentraciones de ascorbato en relación con otros tejidos del cuerpo 23,25-27. Además, la exposición de ambos astrocitos 28,29 y neuronas como las células 30 al glutamato se sabe para accionar la liberación de ascorbato en el espacio extracelular, donde el ascorbate se cree que ayuda a proteger a las neuronas contra el glutamato inducida por la disfunción neuronal 31. Aunque el mecanismo exacto de glutamato inducida por la liberación de ascorbato de astrocitos se desconoce, se ha proporcionado recientemente pruebas que indican la implicación de células inflamación causada por la captación de glutamato por el glutamato de los astrocitos y transportador de aspartato (GLAST, también conocida aminoácido excitador transportador isoforma 1 [EAAT1 ] en los seres humanos) y la consiguiente activación de osmolíticas y aniones canales sensibles al volumen (VSOACs) que son permeables a las pequeñas aniones orgánicos tales como ascorbato 32. Las identidades moleculares de los conductos de membrana de plasma implicados en la formación VSOAC quedan aún por identificar 33,34.
Aunque muchos ensayos se han desarrollado para la determinación de ascorbato en muestras biológicas, que incluyen ensayos espectrofotométricos, fluorométricos y cromatográficas 35,36, existe mucha variabilidad en la especificidad, la sensibilidad, interference por contaminantes químicos, rango lineal efectiva y la estabilidad del analito punto final. Además, otros factores importantes que influyen en la elección de ensayo son la rapidez, la facilidad de uso y acceso a equipos relativamente especializada, como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) aparato.
Aquí presentamos un ensayo simple y altamente específico de microplacas colorimétrico para la determinación de ascorbato intracelular en células cultivadas, así como un ensayo separado para la determinación de ascorbato-flujo de salida a partir de células cultivadas. El último ensayo tiene como objetivo evitar el problema de la subestimación de la liberación de ascorbato a partir de células debido a la rápida re-absorción de ascorbato liberado por los transportadores de ascorbato de sodio-dependiente (SVCTs). Aunque ambos métodos han aparecido en algunas de nuestras publicaciones anteriores 19,20,32,37,38, este manuscrito proporciona un conjunto explícito de instrucciones y directrices para su ejecución efectiva.
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Protocol
1. Determinar ascorbato intracelular en células cultivadas
- Cultivo de células y la cosecha
- Crecer de suspensión (por ejemplo, la eritroleucemia humana K562) o células adherentes (por ejemplo, los astrocitos primarios) utilizando procedimientos estándar de cultivo 19-21,32,38. Nota: para garantizar las células contienen ascorbato, se cargan las células cultivadas con ascorbato, ya sea como ascorbato o DHA 33,39.
- Crear un extracto celular que contiene ascorbato-
- Incubar un número apropiado de solución salina tamponada con fosfato de suspensión (PBS), se lavó o células adherentes con 450 l de helado celular permeabilización Buffer [CPB; 0.1% (w / v) de saponina en PBS; 4 º C]. Nota: Determinar el número de células requeridas para obtener un valor de absorbancia en el intervalo lineal del ensayo (véase más adelante) empíricamente por el usuario final. Nota: Los extractos de tejidos también pueden utilizarse (véase la discusión para más detalles).
- Agitacélulas TE en hielo durante 10 minutos para asegurar la lisis celular completa.
- Crear un extracto intracelular que contiene ascorbato-aclarado mediante la eliminación de los desechos celulares por centrifugación del lisado crudo a 16.000 × g durante 5 min en una microcentrífuga refrigerada (4 º C).
- Retire cuidadosamente 4 x 100 ml de alícuotas de cada muestra y añadir a una secuencia horizontal de pozos en una placa de fondo plano de 96 pocillos que contiene ya sea 25 l / pocillo de PBS ("-AO") o sólo 25 l / pocillo de 45.5 U / ml solución madre de L-ascorbato-oxidasa (AO) en PBS ("+ AO"). Nota: esto debe hacerse en paralelo con la preparación de los estándares (ver más abajo).
- Construcción estándar de la curva ascorbato (debe ser construido de nuevo para cada ensayo)
- Preparar una solución madre de 10 mM de ácido ascórbico en helado de PBS. Nota: Verifique la concentración de ascorbato por espectrofotometría utilizando una cubeta de cuarzo con un 1cm de longitud de vía a 265 nm (coeficiente de extinción = 14,5 mM -1 cm -1) 40.
- Prepare cuidadosamente una serie de normas de ascorbato de entre 0 y 20 mM.
- En paralelo con el paso 1.2.4, retirar con cuidado 4 × 100 ml de alícuotas de cada estándar y añadir a una secuencia horizontal de pozos en una placa de fondo plano de 96 pocillos que contiene 25 l / pocillo de PBS ("-AO") o un 45,5 U / ml solución madre de AO en PBS ("+ AO"). Nota: 100 l de los estándares de ascorbato anteriores contendrán 0-2 nmol de ascorbato. Tenga en cuenta, el objetivo de la AO es para el control de la contribución de reductores no-ascorbato a ferricianuro reducción.
- Determinar ascorbato intracelular - Paso 1: eliminar selectivamente ascorbato y cuantitativamente oxidar ascorbato con ferricianuro
- Mezclar orbitalmente la placa de 96 pocillos a 550 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad, cubriendo la placa en papel de aluminio. Nota: Tsu paso debe oxidar todo ascorbato en los pozos "+ AO" a DHA. Los pozos "AO" no se verán afectados.
- Añadir 50 l de 3,5 mM ferricianuro de potasio (en lo sucesivo denominadas "ferricianuro") en PBS a todos los pocillos. La final [ferricianuro] = 1 mM. Nota: Utilice un multipipettor.
- Mezclar orbitalmente la placa a 550 rpm a temperatura ambiente durante otros 5 minutos en la oscuridad. Nota: Este paso debe resultar en la reducción de ferricianuro a ferrocianuro por el ascorbato en una relación estequiométrica de 2 moléculas de ferricianuro reducido por 1 molécula de ascorbato oxidado.
- Inmediatamente después, añadir 25 l de una solución recién construido que contiene 50% (v / v) de ácido acético y 30% (w / v) de ácido tricloroacético (TCA). Nota: Utilice un multipipettor.
- Determinar ascorbato intracelular - Paso 2: cuantificar la cantidad de ferrocianuro formado 37
- Añadir 100 l de solución de ferrocianuro de determinación del 37 al eada bien. Nota: Una solución de trabajo debe hacerse inmediatamente antes de su uso: 2 ml de 3 M acetato sódico (pH 6,0); 0,5 ml de ácido acético glacial (~ 17,4 M de ácido acético); 2 ml de ácido cítrico 0,2 M; 2 ml de 3,3 mM FeCl3 en ácido acético 0,1 M; 1 ml de 30 mM ferene-S. El volumen final de esta solución de trabajo debe ser 7,5 ml.
- Mezclar orbitalmente la placa en la oscuridad a 550 rpm durante 30 min a temperatura ambiente.
- Leer los valores de absorbancia de los pocillos a 593 nm (es decir, el máximo de absorbancia de la Fe (II) (Metodo-S) 3 complejo).
- Calcular la cantidad de ascorbato intracelular como nmoles ascorbato por millón de células restando inicialmente los valores de A 593 nm para los pozos de la '+ AO' de los correspondientes - pozos 'AO' para cada muestra y luego la interpolación de la curva estándar ascorbato (véase el paso 1.3 ). Al construir la curva estándar, trazar este "valor de la diferencia" para cada estándar frente a la cantidad de ascorbcomió por pocillo.
2. Determinación de ascorbato-eflujo de células cultivadas
- Cultivo de células y la cosecha
- Crecer suspensión o células adherentes que la anterior (véase el paso 1.1). Nota: llevar a cabo el ensayo a continuación en un formato de plataforma de 24 pocillos con la suspensión y las células adherentes para obtener mejores resultados.
- Volver a suspender las células en suspensión, o superponer las células adherentes, con 400 l de solución salina tamponada con HEPES precalentado, con o sin calcio y magnesio, y que contiene 5 mM de D-glucosa (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) en pozos de una placa de 24 pocillos. Añadir el mismo volumen de HBS / D para pozos sin células especificados en cada placa de 24 pocillos para ser examinados. Nota: este último servirá como controles libres de células para la reacción de la línea de base (ver más abajo).
3. Determinar la cantidad de ascorbato de lanzamiento
- Las siguientes soluciones madre deben prepararse de antemano: 120U / ml en HBS AO / D (preparar fresco); 2,4 mM Ferene-S en HBS / D; 120 M de FeCl3 y 600 mM Na-citrato en HBS / D (preparar inmediatamente de soluciones de reserva más concentradas).
- Para iniciar la reacción ferrireduction (volumen final por pocillo debe ser de 600 l), añadir los siguientes volúmenes de los reactivos a los pocillos individuales que ya contienen 400 l de HBS / D:
- Añadir 50 l de AO (120 U / ml) o HBS / D para emparejado pozos por triplicado. La concentración final AO debe ser de 10 U / ml. Nota: Label emparejado pozos como "- AO" y "+ AO".
- Mezclar las placas con mezcla orbital suave durante 5 min a 37 ° C.
- Añadir 50 l de 2,4 mM de fereno-S a todos los pocillos. La concentración final ferene-S debe ser de 200 mM. Mezclar las placas como anteriormente durante 5 min a 37 ° C.
- Añadir 50 l de 120 mM recién preparada citrato férrico. El hierro final y concentraciones de citrato de hierro deben ser 10 mM y 50 mM citrato. Mezclar bien.
- En tres pocillos de control por triplicado, aspirar el medio suprayacente y añadir 600 l de HBS / D que contiene 0,1% de saponina. Nota: Estos servirán como "100% de lisis celular" controles de lactato deshidrogenasa (LDH) ensayo de liberación que se realizará en paralelo (véase más adelante).
- Incubar durante 60 min en la oscuridad a 37 ° C.
- Al final del ensayo de ascorbato de flujo de salida, aspirar rápidamente 500 l de cada pocillo y añadir a etiquetado adecuadamente pozos en una placa de 24 pocillos. Nota: para células en suspensión, eliminar inicialmente las células por centrifugación a 4 ° C.
- Añadir 300 ml de alícuotas del sobrenadante a una placa de 96 pocillos y luego leer a 593 nm.
4. Determinación de ascorbato extracelular
- Lea los valores de absorbancia de los pocillos a 593 nm.
- Calcular la cantidad de ascorbato extracelular como nmoles de ascorbato por mg de proteína (o por millón de células) como se describe para la determinación de ascorbato intracelularen el Paso 1.5.4. Nota: el usuario final debe optimizar las condiciones de modo que la liberación de ascorbato no está limitada por el ascorbato intracelular.
5. Determinación de la LDH de lanzamiento
- Con los 200 l restantes de solución extracelular de cada muestra de llevar a cabo un ensayo de liberación de LDH 32,41 para determinar el grado de lisis celular. Nota: el cálculo en% del total de LDH liberable. Determinar la LDH liberable de las muestras que se trataron con 0,1% de saponina.
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Representative Results
Determinación de ascorbato intracelular en las células cultivadas en suspensión
En el primer ensayo (Figura 1), ascorbato intracelular se determina, después de ascorbato-específica (es decir, AO-sensible) reducción de ferricianuro a ferrocianuro, utilizando la determinación altamente sensible de ferrocianuro por un procedimiento publicado previamente 37. La detección de ascorbato se basa en la quelación colorimétrico de hierro ferroso que se genera por la reducción ascorbato dependiente de ferricianuro a ferrocianuro, seguido por la reducción de la férrico a hierro ferroso por ferrocianuro. Como las concentraciones suprafisiológicas de algunos iones metálicos divalentes (por ejemplo, Cu 2 +, Co 2 + y Zn 2 +) pueden interferir, presumiblemente al competir con el hierro ferroso para la quelación por Ferene-S, las precauciones apropiadas se deben tomar bajo estas condiciones 37.
FiguraLa figura 2 muestra una curva estándar típica de un conjunto de normas de ascorbato 0-20 micras (o 0-2 ascorbato nmol por pocillo de la placa de 96 pocillos; vea el paso 6.5 en el "Protocolo".). Aunque no se muestra en esta figura, la linealidad se mantiene hasta 8 ascorbato nmol por pocillo (es decir, una red A 593 nm de ~ 1,6), que corresponde a una concentración de la muestra ascorbato de ~ 80 m. El ensayo se puede usar para detectar con éxito los niveles de ascorbato por debajo de 0,25 nmol de ascorbato por pocillo (concentración de ascorbato de muestra de 2,5 M).
K562 células se acumulan rápidamente ascorbato intracelular del extracelular DHA, pero no ascorbato (véase la Figura 3; reproducido con permiso de Lane y Lawen 2008 19). En este experimento representativo, las células K562 se lavaron con PBS (4 × 10 6 células / ml) se incubaron en PBS con 500 mM de cualquiera de ascorbato (ASC), el DHA, el DHA + 50 M citocalasina B (DHA + CB), ASC + 5 ferricianuro mm (±sc / FIC) o Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) durante 30 min a 37 ° C. Ascorbato intracelular se determinó como se describe en el "Protocolo".
DHA absorción por las células K562 se produce por el transportador de facilitación de glucosa (GLUT) mediada por el transporte (véase la Figura 4; reproducido con permiso de Lane y Lawen 2009 42). Para evaluar la implicación de GLUTs en DHA absorción en este experimento representativo, células K562 fueron incubadas con concentraciones crecientes de citocalasina B (CB) o dihidrocitocalasina B (H 2 CB) disuelto en MBS que contienen etanol 0,5% durante 15 min a 37 ° C antes de la incubación con 400 mM de DHA durante 30 min a 37 ° C en el mismo medio (Fig. 4A). Las células fueron lavadas tres veces en 100 volúmenes de MBS enfriada con hielo y su ascorbato intracelular determinaron como se describe en el "Protocolo". Es importante tener en cuenta mientras tanto CB y H 2 CB inhiben procesos móviles a micromolarconcentraciones (1-100 m), sólo el CB, que se diferencia de H 2 CB por la presencia de un solo doble enlace, inhibe el transporte de GLUT-dependiente a concentraciones micromolares bajas (1-10 m) 43. Por lo tanto, como DHA captación podía inhibirse por CB con una CI 50 <2,5 M, pero no podía inhibirse por H 2 CB, DHA absorción ocurre probablemente en transporte GLUT mediada 38. Alternativamente, en la Figura 4B, las células lavadas fueron expuestas a concentraciones crecientes de la GLUT-transportables, pero análogo de glucosa no metabolizable 3 - O-metil-D-glucosa (3-OMG) o la no-GLUT-transportables estereoisómero L de glucosa - la glucosa antes de la incubación con DHA como en el panel A. Una vez más los resultados indican la implicación de GLUT en DHA de importación como la inhibición de la acumulación de ascorbato intracelular se produce sólo en presencia del análogo de la glucosa GLUT-transportables.
Determinación de ascorbato-eflujo de células adherentes
En el segundo ensayo, la tasa de ascorbato-flujo de salida a partir de células cultivadas se puede determinar. Este ensayo específico es importante como la liberación de ascorbato a partir de células parece ser crucial para la captación celular ascorbato-regulada de hierro no unido a transferrina por las células 19,20. La absorción de hierro no unido a transferrina se considera que es relevante para la fisiopatología de los trastornos de sobrecarga de hierro, tales como los hemochromatoses 22, así como a astrocito-neurona de cambio y la homeostasis de hierro en el cerebro de los mamíferos 22. De hecho, recientemente hemos demostrado que el principal neurotransmisor excitatorio, L-glutamato, provoca la liberación de ascorbato a partir de astrocitos de una manera que depende de la absorción de L-glutamato por GLAST y la hinchazón celular subsiguiente que desencadena la liberación de ascorbato por VSOACs putativos 32. En analogía, ascorbato de rElease a partir de astrocitos de ascorbato-cargado puede ser estimulado por el ácido excitatorio amino, L-aspartato, pero no la no excitador aminoácido L-glutamina. Este efecto se representa en la Figura 5 (reproducido con permiso de Lane y Lawen 2012 32), que muestra las curvas de dosis-respuesta para la estimulación de ascorbato (AA) de liberación por aspartato (círculos cerrados) y glutamina (círculos abiertos) de cultivos primarios de ascorbato-cargado astrocitos de ratón.
Es importante para discutir cómo este ensayo ascorbato-flujo de salida difiere de la ensayo proporcionado para la determinación de ascorbato intracelular. La principal diferencia radica en el hecho de que el nivel de ascorbato que queda en solución no está determinada por una reacción química llevada a cabo al final de un punto de tiempo dado, como es el caso para el método de determinación de ascorbato intracelular. En su lugar, una "firma reductiva" se acumuladurante el período en el que el ascorbato se libera de las células. Esta firma reductora se captura en forma de la reducción de ascorbato dependiente de citrato férrico extracelular seguido por la rápida quelación del hierro ferroso como un gran extracelular y la membrana impermeable a-[Fe (II) (Metodo-S) 3] 4 - quelato . Ferene-S puede ser considerado de manera similar a la membrana impermeable a en el transcurso corto período de tiempo del ensayo. Los niveles de este complejo cromogénico a continuación, se pueden determinar como una medición de punto final. Como se determinan sólo los niveles AO-sensibles de este quelato, el ensayo proporciona un alto grado de especificidad para la determinación de L-ascorbato extracelular.
Figura 1. Diagrama de flujo que muestra los pasos clave en el protocolo parala determinación de ascorbato intracelular.
Figura 2 Una curva estándar típica de un conjunto de normas de ascorbato 0-20 micras.. (O 0-2 ascorbato nmol por pocillo de la placa de 96 pocillos,. Vea el paso 6.5 en el "Protocolo") Las barras de error no se muestran como que están dentro del intervalo ocupado por los símbolos.
Figura 3. K562 células se acumulan rápidamente ascorbato intracelular de DHA extracelular, pero las células K562 lavados con PBS no ascorbato. (4 × 10 6 células / ml) se incubaron en PBS con 500 M Of sea ascorbato (Asc), DHA, DHA + 50 M citocalasina B (DHA + CB), ferricianuro Asc + 5 mM (Asc / FIC) o Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) durante 30 min a 37 ° C. Ascorbato intracelular se determinó como se describe en el "Protocolo". Los resultados mostrados son medias de tres experimentos individuales (+ SD). * La concentración de ascorbato intracelular se calculó utilizando un espacio agua intracelular predeterminado para K562 células (es decir, ~ 1.6 μl/106 células) 19,20. Esta cifra se ha reproducido con permiso de Lane y Lawen 2008 19.
Figura 4. DHA absorción por las células K562 se produce por el transportador de glucosa de facilitación (GLUT) de transporte-mediadas. K562 células que habían sido cultivadas a 6-8 × 10 6 células / ml en RPMI + 10% (v / v) de suero fetal bovino a 37 ° C, 5% de CO 2 y 95% de aire eran inicialmente se lavó tres veces con MBS. Las células lavadas fueron expuestas a concentraciones crecientes de citocalasina B (CB, Sigma) o dihidrocitocalasina B (H 2 CB) disuelto en solución salina tamponada con fregonas (MBS; NaCl 137 mM, 2,7 mM de KCl, 15 mM de MOPS-Na +, pH 7,3 ) que contiene 0,5% de etanol antes de la incubación con 400 mM de DHA durante 30 min a 37 ° C (A). Las células fueron lavadas tres veces en 100 volúmenes de MBS fríos y su ascorbato intracelular determinaron como se describe en el "Protocolo". Como DHA captación podía inhibirse por CB, pero no H 2 CB, DHA absorción se produce por el transporte GLUT-mediada. Alternativamente, en (B), células lavadas fueron expuestas a concentraciones crecientes de la GLUT-transportables, pero análogo de glucosa no metabolizable 3 - O-metil-D-glucosa (3-OMG) o la glucosa estereoisómero no GLUT-transportables
Figura 5. Liberación ascorbato a partir de astrocitos de ascorbato-cargado es estimulada por el excitador aminoácido L-aspartato, pero no la no excitador aminoácido L-glutamina. Esta figura muestra las curvas de dosis-respuesta para la estimulación de ascorbato (AA) de liberación por aspartato (círculos cerrados) y glutamina (círculos abiertos) a partir de cultivos primarios de astrocitos de ratón ascorbato-cargado. Los datos mostrados son medias (± DE) de tres experimentos. P <0,001 vsla condición 'basal'. Esta cifra se ha reproducido con permiso de Lane y Lawen 2012 32.
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Discussion
En este trabajo se presentan dos ensayos de microplaca colorimétricos rápidos, concretos y relativamente sensibles para la determinación de ascorbato derivado de los compartimentos intra y extracelulares en las células cultivadas. Los ensayos pueden ser completados con el acceso a equipos de laboratorio estándar y los reactivos. El reactivo sólo moderadamente costosa requerida para el ensayo es AO, que es esencial, ya que imparte un alto grado de especificidad analito hacia L-ascorbato. Los ensayos son muy adecuadas para cualquiera de las células de suspensión (por ejemplo, K562) o células adherentes (por ejemplo, HepG2 o astrocitos primarias de roedor), y se han empleado con éxito en publicaciones anteriores usando tales células 19,20,32,37,38. El uso de otros agentes oxidantes (por ejemplo, ascorbato TEMPOL) en lugar de la AO se debe evitar ya que no son lo suficientemente específicos para la L-ascorbato. Además, el uso de compuestos tales comoTempol en el ensayo de liberación de ascorbato se confundió por la capacidad de Tempol de atravesar las membranas celulares y oxidar ascorbato intracelular 44. AO es esencialmente la membrana impermeabilizante en los cursos de tiempo utilizados.
Hemos realizado comparaciones directas de los resultados obtenidos con el ensayo colorimétrico de ascorbato se ha descrito anteriormente y la determinación fluorométrica de ascorbato Vislisel y colegas 36. Se encontró que ambos ensayos dieron resultados idénticos para el ensayo de determinación de ascorbato intracelular (datos no mostrados). Curiosamente, el ensayo de liberación de ascorbato descrito anteriormente dio valores significativamente más altos para la tasa aparente de flujo de salida de ascorbato que con el ensayo de punto final fluorométrico. Esto sugiere que el ensayo de ascorbato de flujo de salida se describe en el presente documento permite la determinación de la aparente "ascorbato-flujo de salida" que no se confunde tan fácilmente por la probabilidad de ascorbato de re-absorción por las células; un proceso que implica probablemente PLSVCTs membrana ASMA. Tal recaptación tendería a provocar una subestimación de los niveles reales de ascorbato que se publicaron durante un período determinado, si se toma una medida de ascorbato de punto final. Cabe señalar que si las muestras de tejido (por ejemplo, músculo, pulmón o cerebro) son para ser utilizado en lugar de las células cultivadas para el ensayo de determinación de ascorbato intracelular, a continuación, un homogeneizado de tejido debe ser construido usando CEC enfriado con hielo y alguna forma de alteración mecánica ( por ejemplo Dounce homogeneización, sonicación con sonda de punta, prensa francesa, etc.). Los restos celulares se debe quitar por centrifugación y el usuario debe tener en cuenta la posible necesidad de desproteinización de la muestra y / o adición de inhibidores de la proteasa antes de proceder con el Paso 1.2.4.
También informó de concentraciones previamente que las bajas micromolares de citocalasina B (<10 M) no inhibió la tasa aparente de ascorbato-flujo de salida que se determina mediante el ensayo 32 19, 20,38.
Hay varios pasos críticos en estos protocolos. En primer lugar, los ensayos descritos en el presente documento dependen críticamente de la capacidad de AO para eliminar de forma selectiva y rápidamente ascorbato en muestras pareadas. Si la actividad específica de la preparación de AO es marcadamente menor que la actividad nominal y asumido, es posible que no todo el ascorbato en el s-AO que contieneserán removidos ejemplos. Esto puede llevar a una subestimación de la cantidad de ascorbato en las muestras desconocidas si se utiliza el "método directo" para calcular la cantidad de ascorbato presente. Sin embargo, si se usa el "método estándar de la curva", que se recomienda, las preparaciones de baja actividad de AO serán sólo conducen a una pérdida de la sensibilidad del ensayo. Hemos encontrado que se obtienen buenos resultados consistentemente mediante el uso de preparaciones de AO construidos por disolución de 1,000 U de AO en 1 ml de PBS o MBS, que se divide entonces en 100 ml de alícuotas que se almacenan a -80 ° C durante no más de un mes. Además, como AO es una proteína que puede ser proteolíticamente degradada por lisados de células, inhibidores de la proteasa pueden añadirse a lisados de células antes de la adición de los lisados a los pozos que contienen AO-. Esto puede ser una modificación útil considerar cuando se utiliza lisados de células o tejidos que son ricos en actividad de la proteasa.
Por otra parte, la sensibilidad de los ensayos descritos unaBove depende en gran medida de la utilización de la bidentado cromogénico de Fe (II)-quelante, Ferene-S. Este quelante puede ser sustituido por quelantes químicamente similares, tales como la ferrozina y disulfonato de batofenantrolina, pero con una disminución en la sensibilidad correspondiente al coeficiente de extinción de su Fe (II) se quela 37. Por otra parte, se debe tener cuidado al usar disulfonato batofenantrolina, ya que parece conducir a mayores tasas de aparente ferrireduction autocatalítica en la presencia de complejos de citrato de hierro que Ferene-S o Ferrozine 37,45. Esta es una preocupación pertinente en el caso del ensayo de liberación de ascorbato como el aspecto no-ascorbato-dependiente de la Fe (II)-quelato disminuirá la sensibilidad del ensayo.
Mientras que el ensayo de ascorbato determinación intracelular es compatible con las células adherentes, desprendimiento de tales células antes de la lisis celular debe ser realizado por raspado mecánico en lugar de tripsina / EDTA. Como la tripsina es una proteasaque es probable que interferir negativamente con el paso ascorbato-agotamiento con AO, el último de los cuales es una proteína. Además, el EDTA es probable que interfiera con el paso de determinación FOC quelando hierro en competencia con ferene-S 37. Tales agentes deben ser evitados. Por último, el ensayo de liberación de ascorbato podría ser fácilmente ser adaptado para células en suspensión. En lugar de aspirar fuera de la suprayacente de Fe (II) (Metodo-S) 3-que contiene quelato al final del ensayo, las células deben sedimentarse rápidamente por centrifugación como para el ensayo de ascorbato determinación intracelular. La absorbancia a 593 nm del sobrenadante debe entonces ser determinada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos agradecidos al Dr Stephen Robinson y la Sra. Hania Czerwinska (Universidad de Monash) por la generosa oferta de cultivos de astrocitos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
References
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
- Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
- Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
- Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
- Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
- Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
- Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
- Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
- Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
- Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
- Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
- Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
- May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
- Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
- Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
- Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
- Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
- Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
- Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
- Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
- Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
- Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
- Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
- Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
- Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
- Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
- Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
- Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
- Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
- Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
- May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
- Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).
