Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51322
Automatic Translation
1, 2
1Molecular Pharmacology and Pathology Program, Department of Pathology & Bosch Institute, University of Sydney, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Biomedical Sciences, Monash University

Summary

أسكوربات يلعب العديد من الأدوار الهامة في عملية الأيض الخلوية، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. نحن هنا وصف-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة لتحديد كلا أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

Abstract

فيتامين C (أسكوربات) يلعب دورا هاما في العديد من الأيض الخلوي، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. على سبيل المثال، داخل الدماغ، أسكوربات يتصرف بطريقة اعصاب وneuromodulatory التي تنطوي أسكوربات ركوب الدراجات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية vicinal - وهي العلاقة التي يبدو أن تكون حاسمة لأسكوربات الدماغ التوازن. بالإضافة إلى ذلك، والأدلة الناشئة تشير بقوة إلى أن أسكوربات دورا توسع كبير في تنظيم استقلاب الحديد الخلوية والنظامية مما هو معترف بها تقليديا. الاعتراف المتزايد بدور لا يتجزأ من أسكوربات في الفيزيولوجيا الخلوية والعضوي الطبيعي وحررت تطالب مجموعة من المتوسطة الإنتاجية وذات حساسية عالية التقنيات التحليلية التي يمكن تنفيذها دون الحاجة إلى معدات متخصصة مكلفة للغاية. هنا نقدم تعليمات صريحة ل-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة نسبيا لتحديد بوال أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

Introduction

كان اكتشاف الطبيعة الكيميائية للحمض الاسكوربيك (فيتامين C)، وتحديد على أنه "عامل مكافحة حفري" يسعى منذ فترة طويلة، من قبل ألبرت زينت-جيورجي وغيرهم في الأبحاث المنشورة 1928-1934 1 الأحداث البارزة في التاريخ الكيمياء الحيوية. في الواقع، ساهمت هذه الاكتشافات إلى زينت جيورجي-حصوله على جائزة نوبل في الفسيولوجيا أو الطب عام 1937. جناح الآخذة في التوسع من أدوار لأسكوربات في علم وظائف الأعضاء الحيوانية والنباتية، وكذلك صحة الإنسان، لا تزال نشطة من الموضوعات العلمية التحقيق والجدل.

L-أسكوربات هو اختزال الفسيولوجية وفيرة وانزيم العامل المساعد في نظم الثدييات، وتساهم في العديد من التفاعلات الإنزيمية محددة جيدا تنطوي على الهيدروكسيل والكولاجين، والكارنيتين بافراز الحيوي، والتمثيل الغذائي التيروزين وهرمون الببتيد amidation 2. يثير الاهتمام والفضول، evide تصاعديوحي بأن الامتحانات التنافسية الوطنية أسكوربات يلعب دورا في تحفيز dioxygenases التي تعتمد على الحديد الأخرى، مثل prolyl وasparaginyl hydroxylases المشاركة في الهيدروكسيل واستهداف عوامل محرض نقص الأكسجة (HIFs) 1α و2α 3. يقترح تقرير حديث أن أسكوربات يلعب دورا في نضوج الخلايا التائية من خلال لونين تؤثر نزع الميثيل عبر نشاطها في تحفيز hydroxylases النووية، Jumonji C (JmjC) البروتينات المجال؛ وهذه الأخيرة التي يبدو أنها تتطلب أسكوربات عن النشاط الكامل 4. في الواقع، يبدو أن التحفيز هذه الانزيمات التي كتبها أسكوربات أن يحدث من خلال آلية مماثلة إلى التحفيز من قبل أسكوربات من مؤسسة الحرمين والكولاجين hydroxylases. من بين الآثار الكلاسيكية الأخرى، أسكوربات يساهم بشكل كبير في مضادة الأكسدة الخلوية وكسر سلسلة زبال الراديكالية للذوبان في الماء (5) وإلى إعادة تدوير غشاء البلازما α توكوفيرول (فيتامين E) عن طريق الحد من α-tocopheroxyl جذرية 6، ثhich المهم في حماية الغشاء ضد بيروكسيد الدهون 7. الأهم من ذلك، على الرغم من أن معظم الثدييات قادرة على دي نوفو توليف كبدي من أسكوربات من مد الجلوكوز، القرود العليا، خنازير غينيا وبعض الخفافيش تعتمد على المصادر الغذائية من فيتامين 8. وهذا يرجع إلى تثبيط الجين GULO، وorthologues منها في الثدييات تتأثر ترميز الانزيم، γ-gulono-اكتون أوكسيديز 9-13. مطلوب هذا الانزيم للتفاعل النهائي في أسكوربات الحيوي من الجلوكوز 13.

بعد امتصاص بوساطة نقل من تجويف الأمعاء في البشر، ويتم توزيع أسكوربات في جميع أنحاء الجسم عن طريق الدورة الدموية. وعادة ما يتم العثور على الفيتامين في شكله انخفاض في تركيزات millimolar داخل الخلية (مع استثناء ملحوظ من الكريات الحمراء في تركيزات التي عادة ما تكون مماثلة لتركيز البلازما السائدة)، واضرب في مكروموليentrations (على سبيل المثال 50-200 ميكرومتر) في معظم سوائل خارج الخلية 14،15.

في ظل الظروف الفسيولوجية، أسكوربات عادة تخضع لعملية الأكسدة عكسها إلكترون واحد إلى اسكوربيل الجذور الحرة (AFR؛ المعروف أيضا باسم monodehydroascorbate أو semidehydroascorbate). في حين أن AFR هو مستقر نسبيا الراديكالية 16، في غياب السريع إلكترون واحد للحد من الأنزيمية عودتها الى أسكوربات، يمكن أن اثنين AFRs تعزيز dismutate إلى أسكوربات واحد واحد dehydroascorbate (DHA) 9،13،17. في المناطق الداخلية من الخلية، وهما الإلكترون الأكسدة نتاج أسكوربات، DHA، ويمكن تخفيض بسرعة العودة إلى أسكوربات بواسطة الجلوتاثيون وNAD (P) الأنزيمية H-تعتمد وردود الفعل غير الأنزيمية 13.

في حين أنه من المقبول أن كلاسيكي دورا هاما فقط أسكوربات في استقلاب الحديد هو تحفيز امتصاص الغذائية من الحديد غير الهيم 18، نحن وآخرون قدموا الأدلة قمما يشير إلى أن trongly إستعمال أسكوربات يلعب دورا توسع كبير في عملية التمثيل الغذائي لهذا المعدن. الأولى، أسكوربات التي يتم تحريرها من قبل خلايا أسكوربات تزخر يبدو أن تلعب دورا هاما في تحوير امتصاص الحديد غير ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا 19،20، والأدلة الأخيرة تشير إلى أن أسكوربات جدا أيضا ينظم امتصاص الحديد ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا 21، وهذه الأخيرة التي يناظر الفسيولوجية ممر رئيسي لامتصاص الحديد 22.

أسكوربات أمر ضروري لوظيفة عادية في الجهاز العصبي المركزي الثدييات 23،24. جنبا إلى جنب مع القشرة الكظرية والغدة النخامية، الغدة الصعترية، الشبكية والجسم الأصفر، والدماغ يحتوي على تركيزات عالية من أسكوربات نسبة إلى أنسجة الجسم الأخرى 23،25-27. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف أن تعرض كل من الخلايا النجمية 28،29 والعصبية التي تشبه الخلايا خلايا 30 إلى الغلوتامات لتؤدي إلى الإفراج عن أسكوربات في الفضاء خارج الخلية، حيث ascorbatويعتقد الإلكترونية للمساعدة في حماية الخلايا العصبية التي يسببها ضد الغلوتامات العصبية العجز 31. في حين أن الآلية الدقيقة التي يسببها الغلوتامات الإفراج أسكوربات من الخلايا النجمية غير معروف، وقدمنا ​​مؤخرا أدلة تشير إلى تورط خلية التورم الناجم عن امتصاص الغلوتامات من الغلوتامات نجمية ونقل اسبارتاتي (GLAST؛ المعروف أيضا الأحماض الأمينية مثير نقل الإسوي 1 [EAAT1 ] في البشر) ويترتب على ذلك تفعيل osmolyte وأنيون قنوات الحساسة الحجم (VSOACs) التي هي قابلة للاختراق لالأنيونات العضوية الصغيرة مثل أسكوربات 32. تبقى الهويات الجزيئية للقنوات غشاء البلازما المشاركة في تشكيل VSOAC الكشف عن هويته 33،34.

على الرغم من أن وضعت العديد من فحوصات لتحديد أسكوربات في العينات البيولوجية، والتي تشمل الطيف، وفلوروميتريك الكروماتوغرافي المقايسات 35،36، هناك الكثير من التباين في خصوصية وحساسية، interferencه من الملوثات الكيميائية، ومجموعة خطية فعالية واستقرار الحليلة نقطة النهاية. بالإضافة إلى ذلك، عوامل الأخرى التي تؤثر على اختيار الاختبار هي سرعة، وسهولة الاستخدام والوصول إلى المعدات المتخصصة نسبيا مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) الجهاز.

نحن هنا تقديم مقايسة اللونية صفيحة ميكروسكوبية بسيطة ومحددة للغاية لتحديد أسكوربات الخلايا في الخلايا المستزرعة، فضلا عن فحص منفصل لتحديد أسكوربات-هروب رأس المال من الخلايا المستزرعة. يهدف الفحص الأخير للالتفاف على مشكلة التقليل من الإفراج أسكوربات من الخلايا نظرا لسرعة إعادة امتصاص أسكوربات صدر عن نقل أسكوربات التي تعتمد على الصوديوم (SVCTs). على الرغم من أن كل من هذه الأساليب التي ظهرت في بعض منشوراتنا السابقة 19،20،32،37،38، يوفر هذا المخطوط مجموعة واضحة من التعليمات والمبادئ التوجيهية للتنفيذ على نحو فعال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة

  1. زراعة الخلايا والحصاد
    1. تنمو التعليق (مثل ابيضاض الدم الاحمراري الإنسان، K562) أو الخلايا الملتصقة (مثل الخلايا النجمية الأساسي) باستخدام الإجراءات القياسية الثقافة 19-21،32،38. ملاحظة: لضمان الخلايا تحتوي على أسكوربات، تحميل الخلايا المستزرعة مع أسكوربات إما أسكوربات أو DHA 33،39.
  2. إنشاء مقتطف الخلوية التي تحتوي على أسكوربات
    1. احتضان عدد مناسب من الفوسفات مخزنة المالحة تعليق (PBS) غسلها أو الخلايا الملتصقة مع 450 ميكرولتر من خلية الجليد الباردة العازلة Permeabilization [CPB؛ 0.1٪ (ث / ت) سابونين في برنامج تلفزيوني؛ 4 ° C]. ملاحظة: تحديد عدد الخلايا المطلوبة للحصول على قيمة الامتصاصية ضمن مجموعة خطية من الفحص (انظر أدناه) تجريبيا من قبل المستخدم النهائي. ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم مستخلصات الأنسجة (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل).
    2. Agitaخلايا الشركة المصرية للاتصالات على الجليد لمدة 10 دقيقة لضمان تحلل الخلوية شامل.
    3. إنشاء المحتوية على استخراج الخلايا أسكوربات أوضح عن طريق إزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي للالمحللة الخام عند 16،000 × ز لمدة 5 دقائق في microcentrifuge المبردة (4 درجة مئوية).
    4. إزالة بعناية 4 × 100 ميكرولتر مأخوذة من كل عينة وإضافة إلى سلسلة الآبار الأفقية في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا أن يحتوي إما 25 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني ("AO") فقط أو 25 ميكرولتر / جيد من 45.5 U / مل محلول المخزون من L-أسكوربات-أوكسيديز (AO) في برنامج تلفزيوني ("+ AO"). ملاحظة: يجب أن يتم ذلك بالتوازي مع إعداد المعايير (انظر أدناه).
  3. أسكوربات البناء القياسية منحنى (يجب أن تبنى من جديد لكل مقايسة)
    1. إعداد محلول المخزون من 10 ملم حمض الاسكوربيك في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. ملاحظة: تحقق من تركيز أسكوربات طيفيا باستخدام كفيت الكوارتز مع 1سم طول المسار 265 نانومتر في (معامل الانقراض = 14.5 مم -1 سم -1) 40.
    2. إعداد بعناية سلسلة من المعايير أسكوربات بين 0 و 20 ميكرومتر.
    3. بالتوازي مع الخطوة 1.2.4، وإزالة بعناية 4 × 100 ميكرولتر مأخوذة من كل معيار، ويضاف إلى سلسلة الآبار الأفقية في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا أن يحتوي على 25 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني ("AO") أو 45.5 U / مل محلول المخزون من AO في برنامج تلفزيوني ("+ AO"). ملاحظة: ستكون 100 ميكرولتر من المعايير أسكوربات أعلاه تحتوي على 0-2 nmole من أسكوربات. يرجى ملاحظة أن الغرض من AO هو السيطرة للمساهمة الاختزال غير أسكوربات إلى الحد فيري سيانيد.
  4. تحديد الخلايا أسكوربات - الخطوة 1: إزالة انتقائي أسكوربات وكميا أكسدة أسكوربات مع فيري سيانيد
    1. مزيج Orbitally 96 لوحة جيدا في 550 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام من خلال تغطية لوحة في احباط. ملاحظة: Tخطوته يجب أكسدة جميع أسكوربات في "+ AO" الآبار لهيئة الصحة بدبي. يجب أن تكون الآبار "AO" لم تتأثر.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من 3.5 ملي فيري سيانيد البوتاسيوم (المشار إليها هنا "فيري سيانيد") في برنامج تلفزيوني لجميع الآبار. المباراة النهائية [فيري سيانيد] = 1 ملم. ملاحظة: استخدام multipipettor.
    3. مزيج Orbitally لوحة في 550 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أخرى في الظلام. ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن يؤدي إلى الحد من فيري سيانيد لفيروسيانيد بواسطة أسكوربات في نسبة متكافئة من 2 جزيئات فيري سيانيد تخفيض لكل 1 جزيء من أسكوربات أكسدة.
    4. إضافة على الفور 25 ميكرولتر من حل شيدت حديثا تحتوي على 50٪ (ت / ت) وحامض الخليك 30٪ (ث / ت) وحامض الخليك ثلاثي الكلور (TCA). ملاحظة: استخدام multipipettor.
  5. تحديد الخلايا أسكوربات - الخطوة 2: quantitate مقدار فيروسيانيد شكلت 37
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الحل فيروسيانيد تقرير 37 إلى البريدمنظمة العمل ضد الجوع أيضا. ملاحظة: يجب أن يتم حل العمل فورا قبل الاستخدام: 2 مل من 3 M نا خلات (الرقم الهيدروجيني 6.0)؛ 0.5 مل من حمض الخليك الجليدي (~ 17.4 M حمض الخليك)؛ 2 مل من 0.2 M حمض الستريك؛ 2 مل من 3.3 ملي FeCl 3 في 0.1 حمض الخليك M؛ 1 مل من 30 ملي ferene-S. يجب أن يكون الحجم النهائي من هذا الحل يعمل 7.5 مل.
    2. مزيج Orbitally لوحة في الظلام في 550 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. قراءة القيم الامتصاصية من آبار في 593 نانومتر (أي الحد الأقصى لامتصاص الحديد (II) (ferene-S) 3 المعقدة).
    4. حساب كمية أسكوربات داخل الخلايا كما nmoles أسكوربات لكل مليون الخلايا عن طريق طرح في البداية A 593 نانومتر القيم للآبار و'+ AO' من المقابلة - آبار 'AO' لكل عينة ثم التحريف من منحنى أسكوربات القياسية (انظر الخطوة 1.3 ). عند بناء منحنى القياسية، رسم هذا "قيمة الاختلاف" لكل معيار مقابل مبلغ من ascorbأكلت لكل بئر.

2. تحديد أسكوربات-هروب رأس المال من الخلايا المستزرعة

  1. زراعة الخلايا والحصاد
    1. تنمو تعليق أو الخلايا الملتصقة على النحو الوارد أعلاه (انظر الخطوة 1.1). ملاحظة: تنفيذ مقايسة أدناه في شكل بلات 24 جيدا مع التعليق والخلايا الملتصقة للحصول على أفضل النتائج.
    2. تعليق الخلايا في resuspend، أو تراكب الخلايا الملتصقة، مع 400 ميكرولتر من قبل حرارة محلول ملحي HEPES مخزنة، مع أو بدون الكالسيوم والمغنيسيوم، وتحتوي على 5 ملي مد الجلوكوز (HBS / D؛ درجة الحموضة 7.3، 37 ° C) في الآبار من 24 لوحة جيدا. إضافة نفس حجم HBS / D إلى الآبار خالية من الخلايا المحددة في كل لوحة 24 جيدا لفحصها. ملاحظة: هذا الأخير سيكون بمثابة الضوابط خالية من الخلايا للتفاعل الأساس (انظر أدناه).

3. تحديد مقدار أسكوربات الاصدار

  1. وينبغي إعداد الحلول الأسهم التالية مسبقا: 120U / مل AO في HBS / D (إعداد الطازجة)؛ 2.4 ملي Ferene-S في HBS / D؛ 120 ميكرومتر FeCl 3 و 600 ميكرومتر نا السيترات في HBS / D (إعداد فورا من الحلول الأسهم أكثر تركيزا).
  2. لبدء رد فعل ferrireduction (الحجم النهائي لكل بئر يجب أن يكون 600 ميكرولتر)، إضافة الكميات التالية من الكواشف إلى الآبار الفردية التي تحتوي بالفعل 400 ميكرولتر من HBS / D:
    1. إضافة 50 ميكرولتر من AO (120 U / مل) أو HBS / D لإقران الآبار في ثلاث نسخ. وينبغي أن يكون تركيز AO النهائي 10 U / مل. ملاحظة: تسمية تقرن الآبار و"- AO" و "+ AO".
    2. مزيج من لوحات مع خلط المدارية لطيف لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من 2.4 ملي ferene-S لجميع الآبار. وينبغي أن يكون النهائي تركيز ferene-S 200 ميكرومتر. مزيج من لوحات على النحو الوارد أعلاه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من الطازجة 120 ميكرومتر سترات الحديديك. يجب أن تكون نهائية وتركيزات الحديد سترات الحديد 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر سيترات. تخلط جيدا.
    5. في ثلاثة آبار المراقبة ثلاث نسخ، نضح المتوسطة الفوقية وإضافة 600 ميكرولتر HBS / D تحتوي على 0.1٪ سابونين. ملاحظة: ستكون هذه بمثابة "بنسبة 100٪ خلية تحلل" الضوابط لاكتات نازعة (LDH) الإفراج الفحص التي ستجرى بالتوازي (انظر أدناه).
    6. احتضان لمدة 60 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية.
    7. في نهاية الفحص أسكوربات هروب رأس المال، ونضح بسرعة 500 ميكرولتر من كل بئر وإضافة إلى الآبار المسمى بشكل مناسب في 24 لوحة جيدا. ملاحظة: للخلايا التعليق، وإزالة البداية الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية.
    8. إضافة 300 ميكرولتر مأخوذة من طاف لوحة 96 جيدا وثم قرأ في 593 نانومتر.

    4. تحديد أسكوربات خارج الخلية

    1. قراءة القيم الامتصاصية من آبار في 593 نانومتر.
    2. حساب كمية أسكوربات خارج الخلية كما nmoles أسكوربات في ملغ من البروتين (أو لكل مليون خلية) كما هو موضح لتحديد الخلايا أسكورباتفي الخطوة 1.5.4. ملاحظة: يجب على المستخدم النهائي تحسين الظروف بحيث الإفراج أسكوربات لا يقتصر بواسطة أسكوربات داخل الخلايا.

    5. تحديد LDH الإصدار

    1. مع 200 ميكرولتر المتبقية من حل خارج الخلية من كل عينة إجراء فحص الإفراج LDH 32،41 لتحديد مدى تحلل الخلوية. ملاحظة: حساب كنسبة مئوية من إجمالي LDH نشره. تحديد LDH نشره من العينات التي تم تعامل مع 0.1٪ سابونين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة تعليق

في مقايسة الأولى (الشكل 1)، يتم تحديد أسكوربات داخل الخلايا، وبعد أسكوربات محددة (أي AO-الحساسة) الحد من فيري سيانيد لفيروسيانيد، وذلك باستخدام تقرير حساسة للغاية من فيروسيانيد بواسطة إجراء نشرت سابقا 37. ويستند الكشف عن أسكوربات على عملية إزالة معدن ثقيل من الحديد اللونية الحديدية التي يتم إنشاؤها بواسطة تخفيض تعتمد على أسكوربات من فيري سيانيد لفيروسيانيد، تليها الحد من الحديد إلى الحديد الحديدية التي كتبها فيروسيانيد. كما تركيزات supraphysiological بعض أيونات المعادن ثنائي التكافؤ (مثل النحاس 2 +، 2 + شركة والزنك 2 +) يمكن أن تتداخل، ويفترض من خلال التنافس مع الحديد الحديدية لعملية إزالة معدن ثقيل من قبل ferene-S، ينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة في ظل هذه الظروف 37.

شخصية2 يبين منحنى القياسية نموذجية لمجموعة من المعايير أسكوربات 0-20 ميكرومتر (أو 0-2 أسكوربات nmole لكل بئر من لوحة 96 جيدا؛ راجع الخطوة 6.5 في "البروتوكول"). وإن لم يكن هو مبين في هذا الشكل، ويتم الاحتفاظ الخطي يصل إلى 8 أسكوربات nmole لكل بئر (أي صافي A 593 نيوتن متر من ~ 1.6)، والتي تتطابق مع تركيز العينة أسكوربات من ~ 80 ميكرومتر. الفحص يمكن استخدامها للكشف عن مستويات بنجاح أسكوربات أدناه 0.25 أسكوربات nmole لكل بئر (2.5 ميكرومتر عينة تركيز أسكوربات).

الخلايا K562 تتراكم داخل الخلايا بسرعة أسكوربات من خارج الخلية DHA، ولكن ليس أسكوربات (انظر الشكل 3؛ مستنسخة بإذن من لين و2008 لاوين 19). في هذه التجربة التمثيلية، وحضنت الخلايا K562 PBS غسلها (4 × 10 6 خلية / مل) في برنامج تلفزيوني مع 500 ميكرومتر إما أسكوربات (تصاعدي)، DHA، DHA + 50 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا B (DHA + CB)، تصاعدي + 5 ملي فيري سيانيد (Aالشوري / FIC) أو تصاعدي + 50 U / مل AO (تصاعدي / AO) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم تحديد أسكوربات داخل الخلايا كما هو موضح في "البروتوكول".

DHA امتصاص الخلايا K562 يحدث من قبل التيسير نقل الجلوكوز (تخمة) بوساطة النقل (انظر الشكل 4؛ مستنسخة بإذن من لين و2009 لاوين 42). لتقييم مشاركة افراط في امتصاص DHA في هذه التجربة التمثيلية، وحضنت الخلايا K562 مع زيادة تركيزات مثبط حركة الخلايا B (CB) أو dihydrocytochalasin B (H 2 CB) المذاب في MBS تحتوي على الإيثانول بنسبة 0.5٪ لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل إلى الحضانة مع 400 ميكرومتر DHA لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في نفس المتوسطة (الشكل 4A). والخلايا ثم غسلها ثلاث مرات في 100 مجلدا من MBS الجليد الباردة وأسكوربات بهم داخل الخلايا تحديد كما هو موضح في "البروتوكول". من المهم أن نلاحظ في حين أن كلا CB وH 2 CB تمنع عمليات متحركة في مكروموليتركيزات (1-100 ميكرون)، إلا CB، والذي يختلف من H 2 CB من وجود رابطة ثنائية واحدة، يمنع النقل التي تعتمد على تخمة في تركيزات منخفضة مكرومولي (1-10 ميكرون) 43. لذلك، كما كان من قبل هيئة الصحة بدبي امتصاص inhibitable CB مع IC 50 <2.5 ميكرومتر، ولكن لم يكن inhibitable بواسطة H 2 CB، DHA امتصاص ربما يحدث من قبل بوساطة تخمة النقل 38. بدلا من ذلك، في الشكل 4B، تعرضت الخلايا غسلها لتركيزات متزايدة للتخمة للنقل، ولكن غير التمثيلية التناظرية الجلوكوز 3 - O-ميثيل مد الجلوكوز (3 OMG) أو غير تخمة نقل الجلوكوز stereoisomer L - الجلوكوز قبل الحضانة مع هيئة الصحة بدبي كما هو الحال في لوحة A. مرة أخرى تشير النتائج إلى تورط تخمة في هيئة الصحة بدبي الواردات وتثبيط تراكم الخلايا أسكوربات يحدث فقط في وجود الجلوكوز التناظرية تخمة نقل.

Determinaنشوئها أسكوربات-هروب رأس المال من خلايا منتسب

في مقايسة الثاني، يمكن تحديد معدل أسكوربات-هروب رأس المال من الخلايا المستزرعة. هذا الاختبار محددة لا تقل أهمية عن الإفراج عن أسكوربات من الخلايا ويبدو أن تكون حاسمة لامتصاص الخلوية التنظيم أسكوربات من الحديد غير ملزمة ترانسفيرين من قبل الخلايا 19،20. ويعتبر امتصاص الحديد غير ملزمة ترانسفيرين لتكون مناسبة لالفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات الحديد الزائد مثل hemochromatoses 22، فضلا عن نجمية الخلايا العصبية الصرف الحديد والتوازن في الدماغ في الثدييات 22. في الواقع، لقد أظهرت مؤخرا أن الناقل العصبي مثير الرئيسية، L-الغلوتامات، يؤدي الافراج عن أسكوربات من الخلايا النجمية بطريقة تعتمد على-L الغلوتامات امتصاص GLAST وتورم الخلوية اللاحقة التي يؤدي الافراج عن أسكوربات بواسطة VSOACs المفترضة 32. في التشبيه، أسكوربات صelease من الخلايا النجمية محملة أسكوربات يمكن يحفزه على حمض أميني مثير، L-اسبارتاتي، ولكن ليس غير مثير الأحماض الأمينية L-الجلوتامين. ويصور هذا التأثير في الشكل 5 (مستنسخة بإذن من لين و2012 لاوين 32)، مما يدل على منحنيات الاستجابة للجرعة لتحفيز أسكوربات (AA) من قبل الافراج اسبارتاتي (الدوائر المغلقة) والجلوتامين (الدوائر المفتوحة) من ثقافات الرئيسي لل الخلايا النجمية الماوس محملة أسكوربات.

فمن المهم لمناقشة كيف يختلف هذا أسكوربات-هروب رأس المال من الفحص الفحص المنصوص عليه في تحديد أسكوربات داخل الخلايا. الفرق الرئيسي يكمن في حقيقة أن مستوى أسكوربات المتبقية في الحل لا يحدده تفاعل كيميائي أجريت في نهاية نقطة زمنية معينة، كما هو الحال بالنسبة لطريقة تحديد الخلايا أسكوربات. بدلا من ذلك، تراكمت لديها "التوقيع الاختزالية"خلال الفترة التي يتم تحريرها أسكوربات من الخلايا. يتم التقاط هذا التوقيع مختزلة في شكل خفض تعتمد على أسكوربات من سترات الحديديك خارج الخلية تليها عملية إزالة معدن ثقيل من الحديد السريع الحديدية كما كبيرة خارج الخلية وغشاء impermeant [الحديد (II) (ferene-S) 3] 4 - كلاب . Ferene-S يمكن اعتبار بالمثل غشاء impermeant على مدى وقت قصير من الفحص. ومن ثم يمكن تحديد مستويات هذا المجمع باعتباره مولد اللون قياس نقطة النهاية. كما يتم تحديد مستويات فقط AO-حساسة من هذا كلاب، ويوفر الفحص على درجة عالية من الدقة لتحديد الخلية L-أسكوربات.

الشكل 1
الشكل 1. تدفق الرسم البياني يبين الخطوات الرئيسية في بروتوكول لتحديد أسكوربات داخل الخلايا.

الرقم 2
لا تظهر، (انظر الخطوة 6.5 في "البروتوكول" أو 0-2 أسكوربات nmole لكل بئر من لوحة 96 جيدا.) أشرطة الخطأ كما الشكل 2 منحنى القياسية نموذجية لمجموعة من المعايير أسكوربات 0-20 ميكرومتر. وجودهم داخل النطاق التي تحتلها الرموز.

الرقم 3
الرقم 3. K562 الخلايا تتراكم داخل الخلايا بسرعة أسكوربات من خارج الخلية DHA، ولكن الخلايا K562 لا أسكوربات. PBS غسلها (4 × 10 6 خلية / مل) وحضنت في برنامج تلفزيوني مع 500 ميكرومتر سو إما أسكوربات (تصاعدي)، DHA، DHA + 50 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا B (DHA + CB)، تصاعدي + 5 ملي فيري سيانيد (تصاعدي / FIC) أو تصاعدي + 50 U / مل AO (تصاعدي / AO) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة C. تم تحديد أسكوربات داخل الخلايا كما هو موضح في "البروتوكول". النتائج المعروضة هي وسيلة لثلاث تجارب الفردية (+ SD). * ويقدر تركيز أسكوربات الخلايا باستخدام الفضاء الماء داخل الخلايا محددة سلفا لK562 خلايا (أي 1.6 ~ μl/106 الخلايا) 19،20. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من لين ولاوين 2008 19.

الرقم 4
الشكل 4. امتصاص DHA من قبل خلايا K562 يحدث من قبل نقل الجلوكوز التيسير (تخمة) بوساطة النقل. K562 الخلايا التي كانت قد نمت إلى 6-8 × 10 6 خلية / مل في RPMI + 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني عند 37 درجة مئوية، وكانت 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء في البداية غسلها ثلاث مرات مع MBS. الخلايا وغسلها ثم تعرضوا لزيادة تركيزات مثبط حركة الخلايا B (CB؛ سيغما) أو dihydrocytochalasin B (H 2 CB) الذائب في المياه المالحة المماسح مخزنة (MBS؛ 137 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 15 ملي اجتماعات الأطراف نا +، ودرجة الحموضة 7.3 ) تحتوي على 0.5٪ من الإيثانول قبل الحضانة مع 400 ميكرومتر DHA لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (A). والخلايا ثم غسلها ثلاث مرات في 100 مجلدا من MBS الباردة وأسكوربات بهم داخل الخلايا تحديد كما هو موضح في "البروتوكول". كما كان من قبل هيئة الصحة بدبي امتصاص inhibitable CB، ولكن ليس H 2 CB، يحدث DHA امتصاص بواسطة وسائل النقل بوساطة تخمة. بدلا من ذلك، في (B)، تعرضت الخلايا غسلها لتركيزات متزايدة للتخمة للنقل، ولكن غير التمثيلية التناظرية الجلوكوز 3 - O-ميثيل مد الجلوكوز (3 OMG) أو الجلوكوز stereoisomer غير تخمة للنقل (A). مرة أخرى تشير النتائج إلى تورط تخمة في امتصاص DHA. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من لين ولاوين 2008 42.

الرقم 5
يتم تحفيز الرقم 5. الإفراج أسكوربات من الخلايا النجمية محملة أسكوربات من قبل مثير الأحماض الأمينية L-اسبارتاتي، ولكن ليس غير مثير الأحماض الأمينية L-الجلوتامين. هذا الرقم يدل منحنيات الاستجابة للجرعة لتحفيز أسكوربات (AA) من قبل الإفراج اسبارتاتي (الدوائر المغلقة) والجلوتامين (الدوائر المفتوحة) من ثقافات الأولية من الخلايا النجمية الماوس محملة أسكوربات. البيانات المعروضة هي الوسائل (± SD) من ثلاث تجارب. P <0.001 مقابلالشرط 'القاعدية'. وقد تم استنساخ هذا الرقم بإذن من لين ولاوين 2012 32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الورقة نقدم اثنين السريع ومحددة وحساسة نسبيا المقايسات صفيحة ميكروسكوبية اللونية لتحديد أسكوربات المستمدة من المقصورات داخل وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة. المقايسات يمكن أن تكتمل مع إمكانية الوصول إلى المعدات المختبرية القياسية والكواشف. كاشف فقط تكلفة معتدلة المطلوبة للفحص هي AO، وهو أمر ضروري لأنه يضفي على درجة عالية من الحليلة خصوصية نحو L-أسكوربات. المقايسات هي مناسبة تماما لخلايا إما تعليق (على سبيل المثال K562) أو الخلايا الملتصقة (على سبيل المثال HepG2 أو النجمية القوارض الأولية)، ولقد استخدمت بنجاح في المنشورات السابقة باستخدام مثل هذه الخلايا 19،20،32،37،38. وينبغي تجنب استخدام غيرها من العوامل المؤكسدة أسكوربات (على سبيل المثال Tempol) في مكان AO لأنها ليست محددة بما فيه الكفاية لL-أسكوربات. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام مركبات مثلوسوف يكون مرتبك Tempol في مقايسة أسكوربات الإفراج من قبل قدرة Tempol لعبور الأغشية الخلوية وأكسدة الخلايا أسكوربات 44. AO هو أساسا غشاء impermeant خلال الدورات الزمنية المستخدمة.

قمنا بإجراء مقارنات مباشرة للنتائج التي تم الحصول عليها مع مقايسة أسكوربات اللونية المذكورة أعلاه وتحديد أسكوربات فلوروميتريك من Vislisel وزملاؤه 36. وجدنا أن كلا المقايسات اعطت نتائج مماثلة لفحص الخلايا تقرير أسكوربات (لا تظهر البيانات). ومن المثير للاهتمام، وفحص أسكوربات الإفراج المذكورة أعلاه أعطى قيم أعلى بكثير عن معدل واضح من أسكوربات هروب رأس المال من نقطة النهاية مع مقايسة فلوروميتريك. هذا يشير إلى أن الفحص أسكوربات هروب رأس المال الموصوفة هنا يسمح لتحديد واضح "أسكوربات-هروب رأس المال" التي لا مرتبك كما بسهولة من احتمال أسكوربات إعادة امتصاص من قبل خلايا؛ وهي العملية التي من المرجح ينطوي ررأسماء SVCTs الغشاء. ان مثل إعادة امتصاص تميل الى التسبب التقليل من المستويات الفعلية للأسكوربات التي تم إصدارها خلال فترة معينة إذا اتخذ على قياس نقطة النهاية أسكوربات. تجدر الإشارة إلى أنه إذا عينات الأنسجة (مثل العضلات والرئة أو الدماغ) هي لاستخدامها بدلا من الخلايا المستزرعة لتحديد الخلايا أسكوربات الفحص، ثم يجب أن تبنى على جناسة الأنسجة باستخدام بروتوكول قرطاجنة الجليد الباردة، ونوعا من الاضطراب الميكانيكية ( على سبيل المثال dounce التجانس، مسبار طرف صوتنة، الصحافة الفرنسية الخ). يجب إزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي ويجب على المستخدم النظر في الحاجة المحتملة لعينة تجريد من البروتين و / أو إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني قبل الشروع في الخطوة 1.2.4.

نحن كما ذكرت سابقا أن تركيزات مكرومولي انخفاض مثبط حركة الخلايا B (<10 ميكرومتر) لم تمنع نسبة واضحة من أسكوربات-هروب رأس المال التي تم تحديدها من قبل مقايسة 32 19، 20،38.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذه البروتوكولات. أولا، المقايسات الموصوفة هنا تعتمد بشكل حاسم على قدرة AO انتقائي وبسرعة لإزالة أسكوربات في عينات المقترنة. إذا كان النشاط المحدد لإعداد AO هو أقل بشكل ملحوظ من النشاط الاسمي والمفترضة، فمن الممكن أن ليس كل من أسكوربات في ليالي AO المحتوية علىستتم إزالة amples. وهذا قد يؤدي إلى التقليل من كمية أسكوربات في العينات غير معروف في حالة استخدام "الطريقة المباشرة" لحساب كمية أسكوربات الحاضر. ومع ذلك، إذا كان أحد يستخدم "الطريقة القياسية منحنى"، والذي أوصى، فإن الاستعدادات المنخفضة نشاط AO يؤدي فقط إلى فقدان فحص حساسية. لقد وجدنا أن نتائج جيدة ويتم الحصول باستمرار عن طريق استخدام مستحضرات من AO شيدت عن طريق إذابة 1،000 U من AO في 1 مل من برنامج تلفزيوني أو إما MBS، الذي ثم تنقسم إلى 100 ميكرولتر مأخوذة التي يتم تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تزيد على شهر واحد. كذلك، AO هو البروتين الذي يمكن أن يتحلل proteolytically من قبل الخلية لست]، مثبطات الأنزيم البروتيني يمكن أن تضاف إلى الخلية لست] قبل اضافة لست] إلى الآبار التي تحتوي على AO. قد يكون هذا التعديل مفيدا للنظر عند استخدام الخلايا أو الأنسجة لست] التي هي غنية في نشاط الأنزيم البروتيني.

علاوة على ذلك، حساسية المقايسات وصفهبوف يعتمد إلى حد كبير على استخدام ثنائي الأسنان مولد اللون الحديد (II) خالب، Ferene-S. هذا خالب يمكن الاستعاضة عن chelators كيميائيا مماثلة مثل ferrozine وbathophenanthroline disulfonate، ولكن مع انخفاض في حساسية المقابلة لمعامل الانقراض من الحديد الخاصة بهم (II) يخلب 37. علاوة على ذلك، ينبغي توخي الحذر عند استخدام bathophenanthroline disulfonate، كما يظهر أن تؤدي إلى معدلات أعلى من ferrireduction بالحفز واضحا في وجود المجمعات سترات الحديد من Ferene-S أو Ferrozine 37،45. هذا هو مصدر قلق ذات الصلة في حالة الفحص أسكوربات الإفراج باعتبارها مظهر غير المعتمد على أسكوربات من الحديد سوف (II) كلاب تقليل حساسية الفحص.

في حين أن الخلايا أسكوربات المصير مقايسة متوافق مع الخلايا الملتصقة، يجب أن يتم تنفيذ مثل هذه الخلايا المفرزة من قبل تحلل الخلوية عن طريق تجريف الميكانيكية بدلا من التربسين / EDTA. كما هو التربسين البروتينيفمن المرجح أن تتدخل سلبا مع الخطوة أسكوربات استنفاد مع AO، وهذه الأخيرة التي هي البروتين. بالإضافة إلى ذلك، فإن من المرجح EDTA تتداخل مع خطوة تقرير لجنة مسؤولي المنتدى من قبل شيلاتينغ الحديد في منافسة مع ferene-S 37. وينبغي تجنب مثل هذه العوامل. أخيرا، يمكن بسهولة أن تتكيف مقايسة الافراج أسكوربات للخلايا تعليق. بدلا من الشفط قبالة المغطي الحديد (II) (ferene-S) 3 التي تحتوي على كلاب في نهاية الفحص، والخلايا ينبغي الرسوبية بسرعة عن طريق الطرد المركزي بالنسبة للداخل الخلايا أسكوربات المصير الفحص. وينبغي بعد ذلك تحديد الامتصاصية في 593 نانومتر من طاف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونحن ممتنون للدكتور ستيفن روبنسون والسيدة هانية Czerwinska (جامعة موناش) لتوريد سخية من الثقافات نجمية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
  2. Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
  3. Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
  4. Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
  5. Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
  6. Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
  7. May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
  8. Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
  9. Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
  10. Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
  11. Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
  12. Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
  13. Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
  14. May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
  15. Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
  16. Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
  17. May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
  18. Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
  19. Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
  20. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
  21. Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
  22. Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
  23. Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
  24. Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
  25. Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
  26. Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
  27. Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
  28. Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
  29. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  30. May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
  31. Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
  32. Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
  33. Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
  34. Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
  35. Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
  36. Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
  37. Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
  38. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
  39. Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
  40. Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
  41. Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
  42. Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
  43. Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
  44. May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
  45. Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 86، وفيتامين C، أسكوربات، تورم الخلية، الغلوتامات، صفيحة ميكروسكوبية الفحص، النجمية
A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lane, D. J. R., Lawen, A. A Rapid… More

Lane, D. J. R., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter