Summary
Askorbat sadece son yıllarda ışık gelmiş, birçoğu hücre metabolizmasında çok önemli rol oynar. Burada, orta hacmi, hücre kültürü içinde hem de hücre içi ve hücre dışı askorbat belirlenmesi için özel ve pahalı olmayan bir mikro-tahlili tarif eder.
Abstract
C Vitamini (askorbat) sadece son yıllarda ışık gelmiş birçoğu hücre metabolizmasında çok sayıda önemli rol oynar. Beyin askorbat homeostasis için çok önemli gibi görünen bir ilişki - Örneğin, beynin içinde, askorbat nöronlar ve komşu astrositlerden arasında askorbat bisiklet içeren bir nöroprotektif ve nöromodülatör şekilde davranır. Ayrıca, ortaya çıkan deliller güçlü askorbat klasik tanınır daha hücresel ve sistemik demir metabolizmasını düzenleyen bir ölçüde genişletilmiş bir role sahip olduğunu göstermektedir. Normal ve kuralsız hücresel ve organizma fizyolojisi askorbat ayrılmaz rolünün artan tanınması son derece pahalı uzman ekipman için gerek olmadan çalıştırılabilir orta verimlilik ve yüksek hassasiyetli analitik teknikleri bir dizi gerektirir. Burada, orta performans için açık talimatlar, bo tayini için özel ve nispeten pahalı olmayan mikro deneyi sağlarHücre kültüründe th içi ve hücre dışı askorbat.
Introduction
1928 1934 1 yayımlanan gazetelerde askorbik asit (C vitamini), ve uzun aranan Albert Szent-Györgyi tarafından "anti-iskorbüt hastalığı faktörü", ve diğerleri olarak kimlik kimyasal doğanın keşfi tarihinin önemli olaylar vardı biyokimyası. Nitekim, bu keşifler, Szent-Györgyi 1937 yılında Fizyoloji veya Tıp Nobel Ödülü kazandıktan. Hayvan ve bitki fizyolojisi askorbat rolleri giderek genişleyen paketi, yanı sıra insan sağlığını katkıda aktif bilimsel konular olmaya devam soruşturma ve tartışma.
L-askorbat bol miktarda fizyolojik bir indirgeme ürünü olan ve memeli sistemlerde enzim kofaktörü ve kollajen hidroksilasyon, karnitin ve norepinefrin biyosentezinin, tirosin metabolizma ve peptid hormonu amidasyonu 2 içeren çok iyi tanımlanmış bir enzimatik reaksiyonlar katkıda bulunur. Intriguingly, montaj evidence askorbat gibi hidroksilasyon ile ilgili prolil ve asparaginil hidroksilazları gibi diğer demir bağımlı dioxygenases, uyarıcı ve hipoksiyayla tetiklenebilen faktörleri (HIFs) 1α ve 3 2α hedeflenmesine bir rol oynadığını göstermektedir. Yeni bir rapor, askorbat, nükleer hidroksilazları, Jumonji C (JmjC) etki proteinlerinin teşvik etmedeki aktivitesi ile kromatin demetilasyonunu etki yoluyla T-hücresi olgunlaşmasında bir rol oynadığını göstermektedir; son olarak adı geçen tam aktivitesi 4 askorbat için gerekli gibi görünmektedir. Gerçekten de, askorbat ve bu tür enzimlerin uyarılması HIF ve kollajen hidroksilazları ve askorbat ile uyarılmaya benzer bir mekanizma ile meydana geldiği görülmüştür. Diğer klasik etkileri arasında, askorbat, suda çözünür zincir açan kök sürükleyici 5 gibi hücresel antioksidasyon ve plazma membranının geri dönüşüm önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır α-tokoferol w, 6 α-tokoferoksil radikalin indirgenmesi ile (vitamin E)hich membran lipid peroksidasyonu 7 karşı korunması önemlidir. En memeliler D-glikozdan, askorbat de novo hepatik sentezinin sahip olmasına rağmen Önemli bir şekilde, yüksek primatlar, kobay ve bazı bitler vitamin 8 besin kaynağa bağlıdır. Bu gulo geninin inaktivasyonu nedeniyle, etkilenmemiş memelilerde en orthologues 9-13 oksidaz enzim,-γ-lakton gulono kodlar. Bu enzim, glukoz 13 ila askorbat biyosentezindeki son reaksiyon için gereklidir.
Insanlarda bağırsak lümeninden taşıyıcı aracılı emme sonra, askorbat olarak dolaşım sistemiyle vücutta dağıtılır. Vitamin tipik haliyle (konsantrasyonlar tipik olarak geçerli olan plazma konsantrasyonu ile benzer olan eritrositlerin istisna ile) hücre milimolar konsantrasyonlarda mikromolar ve konsantre onun indirgenmiş formu bulunursaEn çok hücre dışı akışkanlar içinde 14,15 entrations (örneğin, 50-200 uM).
Fizyolojik koşullar altında, genellikle askorbat askorbil serbest radikali tersine çevrilebilir bir elektron oksitlenme geçirmektedir (AFR, aynı zamanda ya da monodehydroascorbate semidehydroascorbate olarak da bilinir). AFR geri askorbat için hızla bir elektron enzimatik azalma yokluğunda, nispeten kararlı bir radikal 16 iken, iki AFRS bir askorbat ve bir dehydroascorbate (DHA) 9,13,17 için dismutate daha fazla olabilir. Hücresinin iç içinde, askorbat, DHA iki elektron oksidasyon ürünü, hızlı bir şekilde ve glutation-NAD (P) H-bağımlı enzimatik ve enzimatik olmayan reaksiyonları 13 geri askorbat indirgenebilir.
Bu klasik demir metabolizması askorbat tek önemli rolü olmayan heme demir 18 diyet emilimini teşvik etmek olduğunu kabul ederken, biz ve diğerleri kanıt s sağladıtrongly bu askorbat düşündüren bu metal metabolizmasında büyük ölçüde genişletilmiş bir rol oynar. İlk olarak, askorbat-dolu hücreler tarafından salınır askorbat hücreleri 19,20 ile transferrine bağlanan demir alımını modüle edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır ve çok son kanıtlar askorbat da transferrin bağlı demir alımını modüle olduğunu gösterir gibi görünmektedir hücreleri 21 ile, ve ikinci bir ana fizyolojik demir alım yol 22 karşılık gelir.
Askorbat memelilerde 23,24 normal merkezi sinir sistemi fonksiyonu için gereklidir. Birlikte adrenal korteks, hipofiz bezi, timus, retina ve korpus luteum ile, beyin diğer vücut dokularında 23,25-27 askorbat göreli yüksek konsantrasyonlarda bulunur. Buna ek olarak, 28,29 ve nöron astrosit-benzeri hücreler glutamata 30 hem de maruz ascorbat hücre dışı alanı, içine askorbat salınmasını tetiklemek için bilinire glutamat kaynaklı nöronal disfonksiyon 31 karşısında nöronların korunması için düşünülmektedir. Astrositlerden glutamat kaynaklı askorbat serbest mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, son zamanlarda astrocyte glutamat ve aspartat taşıyıcı (Glast tarafından glutamat alımı nedeniyle şişlik hücrenin katılımını gösteren kanıt sağladı, aynı zamanda bilinen uyarıcı amino asit taşıyıcı izoformdur 1 [EAAT1 ] insanlarda) ve bu askorbat 32 gibi küçük organik anyonları geçiren hacim duyarlıdır osmolite ve anyon kanalları (VSOACs) bunun sonucunda aktivasyonu. VSOAC oluşumunda rol plazma membran borularının 33,34 moleküler kimlikleri tespit edilmesi gerekmektedir.
Birçok deneyler, spektrofotometrik fluorometrik tahliller ve kromatografik 35,36 dahil biyolojik numunelerde askorbat tayini için geliştirilmiş olmasına rağmen, seçicilik, hassasiyet, interferenc çok değişkenlik mevcutturkimyasal madde, etkili lineer aralığı ve son nokta analitin stabilite, e. Ayrıca, tahlil seçimini de etkileyecektir diğer önemli faktörleri hız, kullanım kolaylığı ve bu gibi bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) aygıtı nispeten özel ekipmanlara erişimi.
Burada kültürlenmiş hücrelerde hücre içi askorbat belirlenmesi yanı sıra, kültürlenmiş hücrelerden askorbat-efflux tayini için ayrı bir tahlili için basit ve son derece spesifik mikro kolorimetrik deneyi mevcut. İkinci tahlil nedeniyle sodyum-bağımlı askorbat nakliyecilere (SVCTs) tarafından yayımlanan askorbat hızla yeniden alım hücrelerden askorbat serbest ardı sorunu aşmak için amaçlamaktadır. Bu yöntemlerin her ikisi de önceki yayınlarda 19,20,32,37,38 bazı ortaya çıkmış olsa da, bu el yazması talimatları ve etkin yürütülmesi için kurallar açık bir kümesi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kültür Hücreleri Hücre içi askorbat belirleyin
- Hücre kültürü ve hasat
- Standart kültür prosedürler 19-21,32,38 kullanılarak süspansiyon (örneğin insan eritrolösemi, K562) veya yapışık hücreleri (primer astrositlere) büyür. Not: hücreler, askorbat içeren askorbat ya da askorbat veya DHA ile 33,39 gibi kültür hücreleri yük sağlamak.
- Bir askorbat içeren hücresel özü oluşturun
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkanmış ve süspansiyon buz gibi soğuk hücre Permeabilization Tamponu [CPB 450 ul ile yapışan hücreler bir uygun sayıda inkübe et; PBS içinde% 0.1 (ağ / hac) bir saponin; 4 ° C]. Not: deneysel olarak son kullanıcı tarafından (aşağıya bakınız) deneyinin lineer aralığında bir absorbans değeri elde etmek için gerekli olan hücre sayısını belirler. Not: doku ekstreleri de (daha fazla bilgi için Tartışma) kullanılabilir.
- Agita10 dakika boyunca buz üzerinde te ayrıntılı hücreleri hücre liziz sağlamak.
- Soğutulmuş bir mikrosantrifüj (4 ° C) 5 dakika için 16,000 x g'de ham lizat santrifüj ile hücre artıklarının çıkarılması ile berraklaştırılmış askorbat ihtiva eden hücre içi özü oluşturun.
- Her bir numune dikkatli bir şekilde 4 x 100 ul alikotları kaldırmak ve tek ya da 25 ul / oyuk 45.5 U PBS ("AO-"), 25 ul / ya da ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek / ml PBS ("+ AO") L-askorbat oksidaz-(AO) stok çözeltisi. Not: Bu (aşağıya bakınız) standartlarının hazırlanması paralel olarak yapılmalıdır.
- Askorbat standart eğri yapı (her bir deney için yeniden inşa edilmesi gerekir)
- Buz soğukluğunda PBS içinde 10 mM askorbik asit, bir stok çözelti hazırlayın. Not: spektrofotometrik olarak 1 olan bir kuartz küvet kullanılarak askorbatın konsantrasyonu doğrulama265 nm'de (yok olma katsayısı = 14.5 mM -1 cm-1) 40 cm yol uzunluğu.
- Dikkatle 0 ve 20 mcM arasında askorbat standartların bir dizi hazırlamak.
- Adım 1.2.4 paralel olarak, dikkatli bir şekilde, her bir standart 4 x 100 ul alikotları çıkarın ve PBS ("AO-") ya da 25 ul / yuva ihtiva eden bir 96-gözenekli düz tabanlı plaka içindeki kuyu yatay dizisine eklemek PBS AO ("+ AO") 45.5 U / ml stok solüsyonu. Not: Yukarıdaki askorbat standartların 100 ul askorbat 0-2 nmol içerir. Lütfen dikkat, AO amacı azalma ferricyanide olmayan askorbat redüktantların katkı için kontrol etmektir.
- Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 1: seçici askorbat kaldırmak ve kantitatif ferrisiyanit ile askorbat okside
- Orbital folyo ile plaka kaplama ile karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 550 rpm'de 96 oyuklu plaka karıştırın. Not: Tüvey DHA'ya "+ AO" kuyularda tüm askorbat okside gerekir. "-AO" kuyuları etkilenmemiş olmalıdır.
- Tüm oyuklara PBS içinde (burada "ferrisiyanür" olarak anılacaktır) 3.5 mM potasyum ferrisiyanür 50 ul ekle. Nihai [ferrisiyanür] = 1 mM. Not: a multipipettor kullanın.
- Orbital karanlıkta başka bir 5 dakika için oda sıcaklığında 550 rpm plaka karıştırın. Not: Bu adım okside askorbat 1 molekülü başına azaltılmış ferrisiyanit 2 molekülünün bir birleşme oranında askorbat ile ferrosiyanür için ferrisiyanür azalmaya neden olmalıdır.
- Hemen% 50 (v / v) asetik asit ve% 30 (a / h) trikloroasetik asit (TCA) ihtiva eden bir yeni inşa çözeltisi 25 ul ekle. Not: a multipipettor kullanın.
- Hücre içi askorbat belirlemek - Adım 2: quantitate Ferrosiyanat miktarı 37 oluşmuş
- E ferrosiyanür belirlenmesi çözüm 37 100 ul ekleyiniyi ach. Not: bir çalışma çözeltisi kullanımdan hemen önce yapılmalıdır: 3 M Na-asetat (pH 6.0) içinde 2 ml; Buzlu asetik asit (~ 17.4 M asetik asit), 0.5 mi; 0.2 M sitrik asit ve 2 mi; 0.1 M asetik asit içinde 3.3 mM FeCl3 2 mi; 30 mM ferene-S 1 ml. Bu çalışma çözeltinin son hacmi 7.5 ml olmalıdır.
- Orbital oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 550 rpm'de karanlıkta plaka karıştırın.
- 593 nm'de kuyuların absorbans değerleri oku (örneğin Fe (II) (ferene-S) 3 kompleksin absorbans maksimum).
- (Adım 1.3 'her bir örnek için -' AO 'kuyuları ve daha sonra askorbat standart eğriden interpolating ilk olarak karşılık gelen' + AO 'kuyular için bir 593 nm değerleri çıkarılarak milyon hücre başına nmol askorbat gibi hücre içi askorbat miktarını hesaplayın .) Standart eğri oluştururken, ascorb miktarına karşı her bir standart için, bu "fark değeri" arsaOyuk başına yedi.
Kültür Hücreler Askorbat efflux-2. Belirlenmesi
- Hücre kültürü ve hasat
- (Adım 1.1) yukarıdaki gibi süspansiyon veya yapışık hücreleri büyümek. Not: En iyi sonuçlar için süspansiyon ve yapışık hücreleri ile 24-iyi bir plat formatında aşağıda tahlil yürütmek.
- Süspanse süspansiyon hücreleri ya da ya da, kalsiyum ve magnezyum olmaksızın, önceden ısıtılmış HEPES tamponlu salin çözeltisi 400 ul, yapışkan hücreler kaplamak ve 5 mM D-glukoz içeren, kuyularda (HBS / D, pH 7.3, 37 ° C) Bir 24-yuvalı plaka. Incelenecek her bir 24-çukurlu plaka üzerinde belirli bir hücre içermeyen çukurlara HBS / D aynı hacim. Not: ikinci (aşağıya bakınız) temel reaksiyon için hücre içermeyen kontroller olarak hizmet edecektir.
3.. Çıkış Askorbat miktarı belirleyin
- Aşağıdaki stok çözeltileri önceden hazırlıklı olmalıdır: 120U / ml AO HBS / D (taze hazırlandı); 2.4 mM Ferene-S HBS / D; 120 uM FeCl3 ve HBS / D (daha fazla konsantre stok çözümleri hemen hazırlamak) 600 mcM Na-sitrat.
- Ferrireduction reaksiyonu (her son hacim 600 ul olmalıdır) başlatmak için, daha önce HBS / D 400 ul ihtiva eden tek tek oyuklara reaktiflerin aşağıdaki miktarlar ekleyin:
- , Üç kopya halinde kuyu eşleştirilmiş için AO (120 U / ml) ya da HBS / D 50 ul ekle. Nihai AO konsantrasyon 10 U / ml olmalıdır. Not: Etiket olarak kuyu eşleştirilmiş "- AO" ve "+ AO".
- 37 ° C'de 5 dakika boyunca hafif bir orbital karıştırma ile plakaları karıştırın
- Tüm oyuklara 2.4 mM ferene-S 50 ul ekle. Nihai ferene-S konsantrasyonu, 200 uM olmalıdır. 37 ° C'de 5 dakika boyunca, yukarıdaki gibi plakaları karıştırın
- Taze hazırlanmış 120 uM ferrik sitrat 50 ul ekle. Nihai demir ve sitrat konsantrasyonları 10 mcM demir ve 50 mM sitrat olmalıdır. İyice karıştırın.
- Üç üçlü kontrol kaplan olarak, üstte uzanan orta aspire ve% 0.1 saponin içeren 600 ul HBS / D ekleyin. Not: Bu (aşağıya bakınız) paralel olarak yapılacak bir laktat dehidrojenaz (LDH) salım deneyi için "% 100 hücre liziz" kontrol grubu olarak hizmet edecektir.
- 37 ° C'de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe
- Askorbat-akış deneyinde sonunda, hızlı bir şekilde her bir oyuğa 500 ul aspire ve uygun bir şekilde, bir 24-çukurlu plaka gözenekleri içinde etiketli ekleyin. Not: süspansiyon hücreleri için, ilk olarak 4 ° C'de santrifüj ile Hücreleri çıkarmak
- 96 oyuklu bir plakaya süpernatan 300 ul hacimde ilave edin ve daha sonra 593 nm'de okundu.
Hücre dışı Askorbat 4. Belirlenmesi
- 593 nm'de kuyuların absorbans değerleri okuyun.
- Hücre içi askorbat tayini için tarif edildiği gibi mg protein başına (ya da milyon hücre başına) nmol askorbat gibi hücre dışı askorbat miktarını hesaplayınAdım 1.5.4 'te. Not: askorbat serbest hücre içi askorbat ile sınırlı değildir, böylece son kullanıcının koşullarını optimize etmek gerekir.
LDH Release 5. Belirlenmesi
- Her bir numunenin hücre dışı çözeltinin geri kalan 200 ul hücre liziz boyutunu belirlemek için bir LDH salma tahlili 32,41 yaparlar. Not: toplam salınabilir LDH% olarak hesaplamak. % 0.1 saponin ile muamele edilmiştir örneklerinden ayrılabilir LDH belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kültür Süspansiyon hücreleri içinde hücre içi Askorbat belirlenmesi
İlk deneyde (Şekil 1) 'de, hücre içi askorbat, önceden yayınlanmış bir prosedüre göre 37 Ferrosiyanat son derece hassas saptaması kullanılarak, ferrosiyanür için ferrisiyanür (örneğin AO duyarlı) indirgeme askorbat-özgü ardından, tespit edilir. Askorbat tespiti ferrosiyanür ile demir ferrik demire indirgenmesi, ardından ferrosiyanür için ferrisiyanür askorbat bağımlı azalma, tarafından üretilen demir demirin kolorimetrik şelasyon dayanmaktadır. Bazı iki değerli metal iyonları (örneğin Cu 2 +, Co 2 + ve Zn 2 +) suprafizyolojik konsantrasyonları muhtemelen ferene-S çelatlamasına için demir demir ile rekabet ederek, müdahale gibi uygun önlemler gibi koşullar 37 altında alınmalıdır.
Rakam2 askorbat standartları 0-20 uM bir dizi için tipik standart eğrisini gösterir (ya da 96 oyuklu plaka içinde çukur başına 0-2 nmol askorbat, "protokol" in adım 6.5.). Bu şekilde gösterilmemiş olsa da, doğrusallık (örneğin bir ağ ~ 1.6 bir 593 nm) ~ 80 uM bir örneği, askorbat konsantrasyonuna karşılık gelen, oyuk başına 8 nmol askorbat kadar korunur. Deney, başarılı bir şekilde oyuk başına 0.25 nmol askorbat (2.5 uM örnek askorbat konsantrasyon) aşağıdaki askorbat düzeylerini tespit etmek için kullanılabilir.
K562 hücreleri hızla dışı DHA'ya içi askorbat birikir, ancak askorbat (bkz. Şekil 3, Lane ve Lawen 19, 2008 izni ile yeniden). Bu deneyde, Örnek, PBS ile yıkandı, K562 hücreleri (4 x 10 6 hücre / ml) askorbat (Asc) ya da 500 uM ile PBS içinde inkübe edildi, DHA, DHA + 50 | iM sitokalasin B (DHA + CB), Asc + 5 mM ferisiyanür (Asc / FIC) veya Asc + 50 U / ml, 30 dakika boyunca AO (Asc / AO) 37 ° C'de "Protokol" de açıklandığı gibi hücre içi askorbat belirlendi.
K562 hücreleri tarafından DHA alımını kolaylaştırıcı glukoz transporter (GLUT)-aracılı taşıma ile oluşur (bkz. Şekil 4, Lane ve Lawen 2009 42 izniyle basılmıştır). Bu temsili deneyde DHA alımındaki gluts katılımını değerlendirmek için, K562 hücreleri, artan sitokalasin B konsantrasyonlarında (CB) veya 37 ° C'de 15 dakika boyunca,% 0.5 etanol ihtiva eden MBS içinde çözüldü dihydrocytochalasin B (2 H CB) ile önceden inkübe edildi aynı ortam içinde 37 ° C'de 30 dakika süreyle 400 uM DHA (Şek. 4A) ile kuluçkaya bırakılmaya karşı. Hücreler daha sonra buz soğukluğunda MBS 100 hacim içinde üç kez yıkanmış ve "Protokolü" de tarif edildiği gibi hücre içi askorbat belirlenmiştir. CB ve H 2 CB hem mikromolardan en hareketli süreçler inhibe ederken dikkat etmek önemlidirkonsantrasyonları (1-100 uM), bir çift bağın varlığı ile 2 H CB farklıdır ancak CB, düşük mikromolar konsantrasyonlarda (1-10 uM) 43 at GLUT-bağımlı taşıma inhibe eder. DHA alımı IC 50 <2,5 mikron ile CB tarafından engellenebilir, ama H 2 CB tarafından baskılanabilmektedir değildi nedenle, DHA alımı muhtemelen GLUT-aracılı taşıma 38 ile gerçekleşir. O-metil-D-glükoz (3-OMG) veya non-GLUT-taşınabilir glikoz stereoizomer L - - Alternatif olarak, Şekil 4B'de, hücreler yıkandı, GLUT-taşınabilir fakat non-metabolize glikoz analog 3 artan konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır Yine, sonuçlar sadece GLUT-taşınabilir glikoz benzeri mevcudiyetinde meydana hücre askorbat birikiminin inhibisyonu olarak DHA ithalat GLUT rolüne işaret etmektedir önce Panel A'daki gibi DHA ile kuluçkaya bırakılmaya karşı glikoz.
DeterminaYapışık Hücreler Askorbat-akış bölgesinin tion
İkinci deneyde, kültürlenmiş hücrelerden askorbat-efflux oranı tespit edilebilir. Hücrelerinden askorbat serbest hücreleri 19,20 ile transferrine bağlanan demir askorbat-düzenlenmiş bir hücresel alımı için çok önemli olduğu görünen Bu özel deney önemlidir. Transferrine bağlanan demir alımı gibi hemochromatoses 22, hem de memeli beyninde 22'de nöron astrosit demir değişimi ve homestasa gibi aşırı demir yüklenmesi hastalıklarının patofizyolojisi ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Gerçekten, son zamanlarda en önemli uyarıcı nörotransmiter, L-glutamat, Glast ve varsayılan VSOACs 32 ile askorbat salınmasını tetikler sonraki hücre şişme ile L-glutamat alımına bağlı bir şekilde astrositlerden askorbat salınmasını tetikler göstermiştir. Benzetme, askorbat raskorbat yüklenmiş astrositlerden bıraktırma uyarıcı amino asit, L-aspartat, fakat non-uyarıcı amino asit L-glutamin ile teşvik edilebilir. Bu etki, askorbat uyarılması (AA) aspartat (kapalı daireler) ile serbest bırakılması ve glutamin primer kültürlerden (açık daireler) için doz-yanıt eğrilerini göstermektedir, (Lane ve Lawen 2012 32 izni ile yeniden) Şekil 5 'de gösterilmiştir askorbat yüklenmiş fare astrositler.
Bu askorbat-akış deneyi, hücre içi askorbat belirlenmesi için verilen deneyde farklı görüşmek için önemlidir. En önemli fark, çözelti içinde kalan askorbat seviyesinin, hücre içi askorbat belirleme yöntemi için olduğu gibi, belirli bir zaman noktasında sonunda yapılan bir kimyasal reaksiyon ile belirlenmez gerçeğinde yatmaktadır. Bunun yerine, "indirgeyici imza" birikmişdönem boyunca askorbat hücrelerinden salınır. Bu indirgeyici imza büyük bir hücre dışı ve zar geçirgenliği olmayan olarak demir demirin hızla şelasyon ve ardından hücre dışı demir sitrat, askorbat bağımlı azalma şeklinde yakalanır [Fe (II) (ferene-S) 3] 4 - şelat . Ferene-S deneyinin kısa bir zaman boyunca zar geçirgenliği olmayan benzer olarak kabul edilebilir. Bu kompleksin kromojenik seviyeleri daha sonra bir son nokta ölçümü olarak belirlenebilir. Bu çelatın sadece AO duyarlı düzeyleri belirlenir olarak, deney dışı L-askorbat belirlenmesi için özgüllük yüksek derecede sağlar.
Şekil 1. Için protokolünde önemli adımları gösteren akış diyagramıhücre içi askorbat belirlenmesi.
Şekil 2, askorbat standartları 0-20 uM bir grubu için tipik bir standart eğri.. (Ya da 96 oyuklu plaka içinde çukur başına 0-2 nmol askorbat,. "Protokol" in adım 6.5) hata çubukları olarak gösterilmemiştir Bu semboller tarafından işgal aralığı içindedir.
Şekil 3,. K562 hücreleri hızla hücre içi DHA'ya askorbat birikir, ama askorbat. PBS ile yıkandı, K562 hücreleri (4 x 10 6 hücre / ml) 500 uM o ile PBS içinde kuluçkalanmıştırf ya askorbat (Asc), DHA, DHA + 50 iM sitokalasin B (DHA + CB), Asc + 5 mM ferricyanide (Yükselen / FIC) veya Asc + 50 U / ml AO (Yükselen / AO), 37 ° C'de 30 dakika boyunca C. "Protokol" de açıklandığı gibi hücre içi askorbat belirlendi. Gösterilen sonuçlar, üç ayrı deneyde (+ SD) araçlarıdır. * Hücre içi askorbat konsantrasyonu K562 hücreleri (örneğin, ~ 1.6 μl/106 hücreleri) 19,20 için daha önceden belirlenmiş bir hücre içi su alanı kullanarak tahmin edilmiştir. Bu rakam Lane ve Lawen 19, 2008 izni ile yeniden olmuştur.
K562 hücreleri tarafından Şekil 4.. DHA alımını kolaylaştırıcı glukoz transporter (GLUT) ile gerçekleşir taşıma-aracılı. +% 10 RPMI 6-8 × 10 6 hücre / ml (büyüdü olmuştu K562 hücreleri37 ° C'de v / v) fetal bovin serumu,% 5 CO2 ve% 95 hava MBS ile üç kez yıkanmıştır, ilk edildi. Ya da B dihydrocytochalasin Mops tamponlu tuzlu su içinde eritilmiş (H 2 CB) (MBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 15 mM MOPS-Na +, pH 7.3; Hücreler daha sonra yıkanmış sitokalasin B konsantrasyonları (Sigma CB) artan maruz bırakıldı gibi) önceden 37 ° C'de 30 dakika süreyle 400 uM DHA ile kuluçkaya bırakılmaya karşı% 0.5 etanol ihtiva eden (A). Hücreler daha sonra soğuk MBS, 100 hacim içinde üç kez yıkanmış ve "Protokolü" de tarif edildiği gibi hücre içi askorbat belirlenmiştir. DHA alımı CB tarafından engellenebilir, fakat H 2 CB olduğu gibi, DHA alımı GLUT-aracılı taşıma ile gerçekleşir. Seçenek olarak ise, (B) 'de, yıkandı, hücreler artan konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır GLUT-taşınabilir fakat non-metabolize glikoz analog 3 - O-metil-D-glükoz (3-OMG) veya non-GLUT-taşınabilir glikoz stereoizomer (A) 'da DHA ile inkübasyon sırasında L-glukoz. Yine, sonuçlar DHA alımının GLUT gerekliliğini göstermektedir. Bu rakam Lane ve Lawen 2008 42 izni ile yeniden olmuştur.
Askorbat yüklenmiş astrositlerden Şekil 5,. Askorbat serbest uyarıcı amino asit L-aspartat ile uyarılan değil, non-uyarıcı amino asit L-glutamindir. Bu rakam askorbat uyarılması (AA) ile serbest bırakma için doz-yanıt eğrilerini göstermektedir aspartat askorbat yüklenmiş Fare astrositlerinin primer kültürlerinde (kapalı daireler) ve glutamin (açık daireler). Gösterilen veriler üç deneylerin (± SD) araçlardır. P <0.001 vs'bazal' durumdur. Bu rakam Lane ve Lawen 2012 32 izni ile yeniden olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, kültürlenmiş hücrelerde hücre içi ve hücre dışı bölmelerden türetilen askorbat tayini için iki hızlı, spesifik ve nispeten hassas mikro kolorimetrik tahlilleri mevcut. Tahliller, standart laboratuar ekipmanları ve reaktifler erişim tamamlanabilir. Deney için gerekli olan sadece orta derecede pahalı reaktif L-askorbat doğru analit özgüllük yüksek derecede kazandırmaktadır olarak önemlidir AO vardır. Tahliller, ya da süspansiyon hücreleri (örneğin, K562) ya da yapışık hücreler (örn. HepG2 veya primer kemirgen astrositler) için uygun olan ve başarılı bir şekilde, bu gibi hücrelere 19,20,32,37,38 kullanan daha önceki yayınlarda kullanılmıştır. Bu L-askorbat için yeterince spesifik değildir gibi AO yerine başka askorbat oksitleyici maddelerin (örneğin, TEMPOL) kullanılması kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, örneğin, bileşiklerin kullanımıAskorbat salım deneyinde TEMPOL hücre zarlarını geçme ve hücre içi askorbat 44 oksitlemek için TEMPOL yeteneği ile karmakarışık olacaktır. AO aslında zar-laktobionat kullanılan zamanlı kurslar bitti.
Yukarıda tarif edilen kolorimetrik tahlil askorbat ve Vislisel ve arkadaşları 36 fluorometrik olarak tayini askorbat ile elde edilen sonuçların doğrudan karşılaştırma gerçekleştirdik. Bu deneyler, hem hücre-içi askorbat belirleme deneyinde (veriler gösterilmemiştir) için benzer sonuçlar verdiği bulunmuştur. İlginç bir şekilde, yukarıda tarif edilen askorbat salım deneyi fluorometrik uç nokta deneyi ile daha askorbat efflux belirgin oranı için önemli ölçüde daha yüksek değerleri vermiştir. Bu, burada tarif edilen askorbat-akış deneyi gibi kolayca askorbat hücreler tarafından yeniden alım olasılığında karmakarışık değildir belirgin bir "askorbat-efflux" belirlenmesine olanak olduğunu göstermektedir; muhtemelen pl içeren bir yöntemasma membran SVCTs. Bu tür yeniden alım bir son nokta askorbat ölçüm alındı takdirde, belirli bir süre içinde serbest bırakıldı askorbat gerçek düzeylerinin tahmin edilmesine neden olma eğiliminde olacaktır. Bu doku örnekleri (örneğin kas, akciğer veya beyin) kullanılarak hücre içi askorbat belirleme deneyi için kültürlenmiş hücrelerin kullanılacak ise, o zaman, bir doku homojenatı (buz soğukluğunda CPB ve mekanik bozulma bazı formunu kullanarak inşa edilmesi gerektiği not edilmelidir örneğin dounce homojenizasyon, prob ucu sonikasyonu, vb Fransız basın.). Hücresel debri santrifugasyon ile çıkarılabilir ve kullanıcı adım 1.2.4 devam etmeden önce, numune deproteinizasyon ve / veya proteaz inhibitörlerinin eklenmesi için olası ihtiyacını göz önünde bulundurmalıdır.
Ayrıca, sitokalasin B (<10 uM), daha önce, düşük mikromolar konsantrasyonlarda yok tahlilde 32 ile belirlenmiştir askorbat-efflux belirgin oranda inhibe etmedi kullanımı, ferrisiyanür askorbat bir hücre içi havuz ağırlıklı olarak azaltılır demir III sitrat hücre dışı askorbat 19 ile ağırlıklı olarak azalır (transplasma zar elektron bir taşıma işlemi ile), ferrisiyanür tercih edilmelidir 20,38.
Bu protokollerin, bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, burada tarif edilen deneyler, seçici olarak ve hızlı bir şekilde eşleştirilmiş örneklerde askorbat kaldırmak için AO yeteneği sıkı sıkıya bağlıdır. AO hazırlanmasının spesifik aktivitesi nominal ve assumed aktivite belirgin bir şekilde daha az ise, bu mümkün olduğu AO-ihtiva s askorbat tümdepas'lar kaldırılır. Bu bilinmeyen örneklerinde askorbat miktarının küçümsenmesi yol açabilir askorbat mevcut miktarını hesaplamak için "direkt yöntem" kullanarak. Bir tavsiye edilir "standart eğri yöntemi", kullanıyorsa Ancak, AO düşük etkinlik hazırlıkları yalnızca deney-bir hassasiyet kaybına yol açacaktır. Bu iyi sonuçlar daha sonra sürekli olarak daha fazla bilgi için -80 ° C'de saklanır 100 ul alikolar ayrılmıştır PBS ya da MBS, ya da 1 ml AO 1000 U eritilerek inşa AO preparatlar kullanılarak elde edilmiştir bulduk bir ay. AO proteolitik hücre lizatları ile bozulmuş bir protein gibi başka, proteaz inhibitörleri, AO-ihtiva eden oyuklara lizatlarının ilave edilmeden önce, hücre lizatlarında eklenebilir. Bu proteaz aktivitesi açısından zengin olan hücre ya da doku lizatları kullanılarak dikkate alınması için yararlı bir değişiklik olabilir.
Ayrıca, tahlillerin hassasiyeti tarif edilen birBove büyük ölçüde kromojenik bidentat Fe (II)-kenetleme maddesi, Ferene-S kullanımına bağlıdır. Bu gibi kenetleyici ferrozin ve bathophenanthroline disülfonat kimyasal olarak benzer bir kenetleme maddeleri-ile ikame, ancak Fe (II) 'nin sönüm katsayısına karşılık gelen hassasiyet azalması ile 37 kelat edilebilir. Bu Ferene-S veya ferrozin 37,45 daha demir sitrat kompleksleri varlığında belirgin Otokatalitik ferrireduction yüksek oranlarda yol göründüğü gibi, bathophenanthroline disülfonatı kullanırken Ayrıca, dikkat edilmelidir. Bu, (II)-şelat tahlilin hassasiyetini azaltır Fe olmayan askorbat bağımlı görünüş gibi askorbat salım deneyi durumunda ilgili bir sorundur.
Hücre içi askorbat belirleme deneyi yapışık hücreleri ile uyumlu iken, hücresel olarak lize önce bu tür hücrelerin ayrılması mekanik kazıma yerine tripsin / EDTA ile yapılmalıdır. Tripsin bir proteaz olduğubüyük olasılıkla AO, bir protein olduğu ikincisi ile askorbat-tükenmesi adım ile olumsuz etkileyecektir. Ayrıca, EDTA olasılıkla ferene-S 37 ile rekabette demir kenetleme ile FO belirlenmesi aşamasında müdahale edecektir. Bu maddeler kaçınılmalıdır. Son olarak, askorbat salma tahlili kolayca süspansiyon hücreleri için uyarlanabilir edilebilir. Bunun yerine örten Fe (II) (ferene-S) aspire 3-ihtiva eden tahlil sonunda şelat, hücreleri hızla hücre içi askorbat belirleme deneyi için olduğu gibi santrifüjle çöktürülmüştür olmalıdır. Süpernatan 593 nm'de absorbans sonra belirlenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz Astrosit kültürlerin cömert temini için Dr Stephen Robinson ve Ms Hanya Czerwińska (Monash Üniversitesi) müteşekkiriz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
References
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q.
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
- Manning, J., et al.
- Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
- Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
- Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
- Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
- Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
- Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
- Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
- Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC.
- May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
- Wilson, J. X.
- Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
- May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
- Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
- Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
- Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
- Grünewald, R. A.
- Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
- Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
- Hediger, M. A.
- Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
- Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
- Danbolt, N. C.
- May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
- Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
- Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
- Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
- Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
- Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
- Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
- Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
- Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
- May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
- Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).
