Summary
Ascorbate משחק תפקידים חשובים רבים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם מגיע רק לאור בשנים האחרונות. כאן אנו מתארים בינוני תפוקה, assay microplate הספציפי וזול לקביעת שני ascorbate התוך וחוץ תאי בתרבית תאים.
Abstract
ויטמין C (ascorbate) ממלאת תפקידים רבים חשובים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם יצאו לאור רק בשנים האחרונות. לדוגמא, בתוך המוח, ascorbate פועל באופן הגנה עצבי וneuromodulatory שכרוך רכיבה על אופניים ascorbate בין הנוירונים והאסטרוציטים vicinal - מערכת יחסים שנראה כחיוני להומאוסטזיס ascorbate המוח. בנוסף, יש ראיות המתעוררות מראות כי יש ascorbate תפקיד התרחב מאוד בויסות חילוף חומרים של ברזל תאי ומערכתיים יותר מוכר בסגנון קלאסי. ההכרה הגוברת בתפקיד נפרד של ascorbate בפיזיולוגיה תאית והאורגניזם נורמלי וחוסר פיקוח ממשלתי דורשת מגוון של טכניקות אנליטיות בינונית תפוקה ורגישות גבוהה שיכולות להתבצע ללא הצורך בציוד מומחה יקר מאוד. כאן אנו מספקים הוראות מפורשות למדיום תפוקה, assay microplate הספציפי וזול יחסית לקביעת בוascorbate התוך תאי וה בתרבית תאים.
Introduction
גילוי האופי הכימי של חומצה אסקורבית (ויטמין C), וזיהוי שלה בתור "הגורם אנטי scorbutic" המיוחל, על ידי אלברט Szent-ג'ורג'י ואחרים במאמרים שפורסמו 1928-1934 1 היה אירועי ציון דרך בהיסטוריה לביוכימיה. ואכן, תגליות אלה תרמו לSzent-ג'ורג'י שזכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 1937. החבילה המתרחבת של תפקידים לascorbate בפיזיולוגיה של בעלי חיים וצמחים, כמו גם על בריאות אדם, תמשיך להיות הנושאים מדעיים פעילים חקירה ומחלוקת.
L-Ascorbate הוא reductant פיסיולוגי בשפע ואנזים cofactor במערכות יונקים, ותורם לתגובות אנזימטיות מוגדרות היטב רבות מעורבים הידרוקסילציה קולגן, קרניטין וביוסינתזה נוראפינפרין, חילוף חומרים טירוזין והורמון פפטיד amidation 2. מסקרן, evide הרכבהNCE עולה כי ascorbate משחק תפקיד בגירוי dioxygenases ברזל תלוי אחר, כגון hydroxylases prolyl וasparaginyl המעורב בהידרוקסילציה ומיקוד של גורמי היפוקסיה מושרה 1α (HIFs) ו2α 3. דו"ח שפורסם לאחרונה מצביע על כך שascorbate משחק תפקיד בהבשלת תאי T המשפיע על דרך demethylation הכרומטין באמצעות פעילותו במגרת hydroxylases הגרעיני, Jumonji C חלבוני תחום (JmjC); האחרון שבם מופיעים לדרוש ascorbate לפעילות מלאה 4. ואכן, הגירוי של אנזימים כגון על ידי ascorbate נראה להתרחש על ידי מנגנון דומה לגירוי על ידי ascorbate של hydroxylases HIF וקולגן. בין השפעות קלאסיות אחרות, ascorbate תורם באופן משמעותי לantioxidation הסלולרי כמחסל 5 רדיקלי מסיסים במים שבירת שרשרת ולמחזור של קרום הפלזמה α-טוקופרול (ויטמין E) באמצעות ההפחתה של α-tocopheroxyl 6 רדיקלי, Which חשוב בהגנה מפני חמצון של שומנים בממברנה 7. חשוב מכך, למרות שרוב היונקים מסוגלים סינתזה כבדית דה נובו של ascorbate מD-גלוקוז, פרימטים גבוהים יותר, שרקנים ועוד כמה עטלפים תלויים במקורות תזונתיים של הוויטמין 8. זאת בשל איון של גן GULO, orthologues אשר ביונקים מושפעים לקודד האנזים, γ-gulono-lactone מונואמין 9-13. אנזים זה נדרש לתגובה האחרונה בביוסינתזה ascorbate מ13 גלוקוז.
בעקבות קליטה בתיווך טרנספורטר מלומן מעיים בבני אדם, ascorbate מופץ בכל הגוף על ידי מערכת הדם. הוויטמין נמצא בדרך כלל בצורה המצומצמת שלה בmillimolar ריכוזים intracellularly (עם החריג הבולט של אריתרוציטים שבריכוזים הם בדרך כלל דומים לריכוז הפלזמה הרווח), ובקונצרט כלשהו מייקרוentrations (למשל 50-200 מיקרומטר) ברוב הנוזלים תאיים 14,15.
בתנאים פיסיולוגיים, ascorbate בדרך כלל עובר חמצון אחד אלקטרונים הפיכים לרדיקלי ascorbyl בחינם (AFR; הידוע גם בmonodehydroascorbate או semidehydroascorbate). בעוד AFR הוא 16 רדיקליים יציבים יחסית, בהיעדר הירידה המהירה שלה מאלקטרון אחד האנזימטית חזרה לascorbate, שתי AFRs יכול לקדם dismutate לascorbate אחד וdehydroascorbate אחד (DHA) 9,13,17. בתוך הפנים של התא, מוצר חמצון שני אלקטרונים של ascorbate, DHA, ניתן להפחית במהירות בחזרה לascorbate ידי גלוטתיון וNAD (P) H האנזימטית תלויות ותגובות אינן אנזימטית 13.
בזמן שהוא קיבל באופן קלאסי שהתפקיד המשמעותי היחיד של ascorbate במטבוליזם של ברזל הוא כדי לעורר ספיגה תזונתית של ברזל מהמקור צמחי 18, אנחנו ואחרים סיפקנו ראיות שלtrongly מצביע ascorbate שמשחק תפקיד התרחב מאוד בחילוף החומרים של מתכת זו. ראשית, ascorbate כי הוא שוחרר על ידי תאי ascorbate-גדוש מופיע לשחק תפקיד חשוב בויסות הספיגה של ברזל שאינו מאוגד transferrin על ידי תאים 19,20, וראיות מאוד לאחרונה עולה כי ascorbate גם מודולציה את הספיגה של ברזל בכריכת transferrin על ידי תאים 21, האחרון שבם מתאים למסלול פיסיולוגי עיקרי ברזל ספיגת 22.
Ascorbate הוא חיוני לתפקוד תקין של מערכת עצבים מרכזי ביונקי 23,24. יחד עם luteum קליפת המוח, בלוטת יותרת המוח, בלוטת התימוס, הרשתית וקורפוס יותרת הכליה, המוח מכיל ריכוזים גבוהים של ascorbate יחסית לרקמות אחרות בגוף 23,25-27. בנוסף, החשיפה של שני האסטרוציטים 28,29 ותאים כמו נוירון 30 לגלוטמט ידוע כדי לעורר את שחרורו של ascorbate לתוך חלל החוץ תאי, שם ascorbatהוא חשב דואר כדי לעזור להגן על נוירונים נגד תפקוד עצבי הנגרם גלוטמט ביום 31. בעוד המנגנון של שחרור ascorbate-Induced גלוטמט מהאסטרוציטים המדויק אינו ידוע, יש לנו לאחרונה סיפקנו ראיות המצביעות על מעורבותם של תאי נפיחות נגרמת על ידי ספיגת גלוטמט על ידי גלוטמט astrocyte וטרנספורטר aspartate (GLAST; איזופורם הידוע גם חומצת אמינו מעוררת טרנספורטר 1 [EAAT1 ] בבני אדם) והפעלה הסוגר של osmolyte ואניון ערוצי נפח רגיש (VSOACs) שהם חדירים לאניונים אורגניים קטנים כגון ascorbate 32. הזהויות מולקולריות של תעלות קרום הפלזמה מעורבות בהיווצרות VSOAC להישאר להיות מזוהות 33,34.
למרות מבחני רבים פותחו לקביעת ascorbate בדגימות ביולוגיות, הכוללות מבחני spectrophotometric, fluorometric וchromatographic 35,36, יש הרבה גיוון בסגולי, רגישות, interferencדואר על ידי מזהמים כימיים, טווח ליניארי אפקטיבי ויציבות של אנליטי נקודת הקצה. בנוסף, גורמים משמעותיים נוספים המשפיעים על הבחירה של assay הם מהירות, קל שימוש וגישה לציוד יחסית מיוחד כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מנגנון (HPLC).
כאן אנו מציגים assay microplate colorimetric פשוט ומאוד ספציפי לקביעת ascorbate תאית בתאים בתרבית, כמו גם assay נפרד לקביעת ascorbate-זרימה מהתאים בתרבית. Assay האחרון נועד לעקוף את הבעיה של הערכה נמוכה מדי של שחרור ascorbate מהתאים עקב ספיגה מחדש מהירה של ascorbate שפורסם על ידי מובילי נתרן תלוי ascorbate (SVCTs). למרות ששתי השיטות האלה הופיעו בחלק מהפרסומים הקודמים שלנו 19,20,32,37,38, כתב היד הזה מספק סט מפורש של הוראות והנחיות לביצוע היעיל שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. קבע Ascorbate תאיים בתאים בתרבית
- תרבית תאים וקציר
- לגדול השעיה (למשל erythroleukemia האנושי, K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים ראשוניים) באמצעות נהלי תרבות סטנדרטיים 19-21,32,38. הערה: כדי להבטיח תאים מכילים ascorbate, טענו תאים בתרבית עם ascorbate או כascorbate או DHA 33,39.
- יצירת תמצית סלולרית המכיל ascorbate
- דגירה מספר מתאים של פוספט שנאגרו מלוח השעיה (PBS) דהוי או תאים חסיד עם 450 μl של תא קר כקרח permeabilization הצפת [CPB; 0.1% saponin (w / v) ב-PBS; 4 ° C]. הערה: קבע את מספרם של התאים הנדרשים להשגת ערך הספיגה בטווח ליניארי של assay (ראה להלן) באופן אמפירי על ידי משתמש הקצה. הערה: ניתן להשתמש גם בתמציות רקמה (ראה דיון לפרטים נוספים).
- Agitaתאי te על קרח דק 10 כדי להבטיח תמוגה הסלולרית יסודית.
- יצירת תמצית תאית המכיל ascorbate הובהרה על ידי הסרת פסולת תאית על ידי צנטריפוגה של lysate הגולמי בגרם × 16,000 במשך 5 דקות בmicrocentrifuge בקירור (4 מעלות צלזיוס).
- מוציא בזהירות 4 x 100 aliquots μl מכל מדגם ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה גם 25 μl / טוב של PBS ("-AO") בלבד או 25 μl / טוב של 45.5 U / מיליליטר פתרון מניות של L-ascorbate-מונואמין (AO) ב-PBS ("+ AO"). הערה: זה צריך להיעשות במקביל להכנת התקנים (ראה להלן).
- הבנייה סטנדרטית עקומת ascorbate (חייבת להיות בנויה מחדש לכל assay)
- הכן פתרון מניות של חומצה אסקורבית 10 מ"מ קר כקרח PBS. הערה: בדוק את הריכוז של ascorbate spectrophotometrically באמצעות קובט קוורץ עם 1סנטימטר נתיב באורך ב265 ננומטר (מקדם הכחדה = 14.5 מ"מ -1 סנטימטר -1) 40.
- להכין בקפידה סדרה של סטנדרטים ascorbate בין 0 ל 20 מיקרומטר.
- במקביל לצעד 1.2.4, להסיר בזהירות 4 × aliquots 100 μl מכל תקן ולהוסיף רצף אופקי של בארות בצלחת תחתונה 96 היטב שטוחה המכילה 25 μl / טוב של PBS ("-AO") או 45.5 פתרון מניות U / מיליליטר של AO ב PBS ("+ AO"). הערה: בסטנדרטים ascorbate מעל 100 μl יכיל 0-2 nmole של ascorbate. שים לב, המטרה של AO היא לשלוט על התרומה של reductants הלא ascorbate לferricyanide הפחתה.
- לקבוע ascorbate תאיים - שלב 1: להסיר באופן סלקטיבי ascorbate וכמותית לחמצן ascorbate עם ferricyanide
- Orbitally לערבב את צלחת 96 היטב ב550 סל"ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות בחושך על ידי כיסוי את הצלחת בנייר כסף. הערה: Tהצעד שלו צריך לחמצן כל ascorbate בבארות "+ AO" לDHA. בארות "-AO" אינן צריכות להיות מושפעות.
- הוסף 50 μl של 3.5 ferricyanide אשלגן מ"מ (המכונה במסמך בשם "ferricyanide") ב-PBS לכל הבארות. מ"מ הסופי [ferricyanide] = 1. שים לב: השתמש multipipettor.
- Orbitally לערבב את הצלחת ב550 סל"ד בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות נוספות בחושך. הערה: צעד זה אמור לגרום להפחתת ferricyanide לשל ברזל על ידי ascorbate ביחס stoichiometric של 2 מולקולות של ferricyanide מופחתות לכל מולקולה 1 של ascorbate חמצון.
- מייד להוסיף 25 μl של פתרון זה עתה נבנה מכיל 50% (v / v) חומצה אצטית ו30% (w / v) חומצת Trichloroacetic (TCA). שים לב: השתמש multipipettor.
- לקבוע ascorbate תאיים - שלב 2: לכמת את כמות של הברזל נוצרה 37
- הוספה של פתרון נחישות של ברזל 37 100 μl לדוארACH כן. הערה: פתרון עבודה צריך להיעשות מייד לפני שימוש: 2 מיליליטר של 3 M Na-אצטט (pH 6.0); 0.5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית (~ 17.4 M חומצה אצטית); 2 מיליליטר של 0.2 M חומצת לימון; 2 מיליליטר של 3.3 מ"מ FeCl 3 ב0.1 חומצה אצטית M; 1 מיליליטר של 30 מ"מ ferene-S. הנפח הסופי של פתרון עובד זה צריך להיות 7.5 מיליליטר.
- Orbitally לערבב את הצלחת בחושך ב550 סל"ד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
- קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר (כלומר המקסימום ספיגת של Fe (II) (ferene-S) 3 המורכבים).
- לחשב את כמות ascorbate תאית כascorbate nmoles למיליון תאים בתחילה על ידי הפחתת 593 ערכי ננומטר לבארות '+ AO' ממקבילים - הבארות "AO" עבור כל דגימה ולאחר מכן ביון מעקומת סטנדרט ascorbate (ראה שלב 1.3 ). בעת בניית עקומת הסטנדרט, עלילה "ערך הבדל" זה עבור כל תקן כנגד הסכום של ascorbאכלתי בכל טוב.
2. קביעת Ascorbate-זרימה מתאים בתרבית
- תרבית תאים וקציר
- לגדול השעיה או תאים חסיד כאמור לעיל (ראה שלב 1.1). הערה: לבצע את assay להלן בפורמט פלאט 24 גם עם השעיה ותאים חסיד לתוצאות הטובות ביותר.
- תאי השעיה resuspend, או כיסוי תאים חסיד, עם 400 μl של מראש חיממתי פתרון שנאגר מלוח HEPES, עם או בלי סידן ומגנזיום, ומכילים 5 מ"מ D-גלוקוז (HBS / D; pH 7.3, 37 מעלות צלזיוס) בבארות של 24 גם צלחת. מוסיף את אותו הנפח של HBS / D לבארות ללא תא שצוינו על כל צלחת 24 גם להיבדק. הערה: יהיה זה האחרון משמש כשולט ללא תא לתגובה הבסיסית (ראה להלן).
3. לקבוע את סכום Ascorbate פורסם
- צריכים להיות מוכנים פתרונות המניות הבאים מראש: 120U / AO מיליליטר בHBS / D (להכין טרי); 2.4 מ"מ Ferene-S בHBS / D; 120 מיקרומטר FeCl 3 ו600 מיקרומטר Na-ציטראט בHBS / D (להכין באופן מיידי מפתרונות מניות מרוכזים יותר).
- כדי להתחיל את תגובת ferrireduction (נפח סופי לכל גם צריך להיות 600 μl), להוסיף הכמויות של חומרים כימיים לבארות בודדות כבר מכילות 400 μl של HBS / D הבאים:
- הוסף 50 μl של AO (120 U / ml) או HBS / D כדי לזווג בארות בשלושה עותקים. ריכוז AO הסופי צריך להיות 10 U / ml. הערה: לייבל לזווג בארות כ" - AO "ו" + AO ".
- מערבבים את הצלחות עם ערבוב מסלולית עדין במשך 5 דקות ב37 ° C.
- הוסף 50 μl של 2.4 מ"מ ferene-S לכל הבארות. ריכוז ferene-S הסופי צריך להיות 200 מיקרומטר. מערבבים את הצלחות כאמור במשך 5 דקות ב37 ° C.
- הוסף 50 μl של ציטרט וברזל 120 מיקרומטר מוכן טרי. הברזל הסופי וריכוזי ציטראט צריך להיות 10 ברזל מיקרומטר ו50 ציטראט מיקרומטר. מערבבים היטב.
- בשלוש בארות שליטה בשלושה עותקים, לשאוב את המדיום שמעליה ולהוסיף 600 HBS / D μl מכיל saponin .0.1%. הערה: אלה ישמשו פקדי "100% תא תמוגה" לקטט דהידרוגנז LDH () assay שחרור שנערך במקביל (ראה בהמשך).
- דגירה של 60 דקות בחושך על 37 ° C.
- בסופו של assay ascorbate-בזרימת, במהירות לשאוב 500 μl מכל טוב ולהוסיף לכותרתו כראוי בארות בצלחת 24 גם. הערה: לתאי השעיה, בתחילה להסיר את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C.
- הוסף 300 aliquots μl של supernatant לצלחת 96 היטב ולאחר מכן קרא ב593 ננומטר.
4. קביעת Ascorbate התאי
- קראו את ערכי הספיגה של הבארות ב593 ננומטר.
- לחשב את כמות ascorbate תאי כascorbate nmoles לחלבון מ"ג (או למיליון תאים) כפי שתואר לקביעת ascorbate תאיתבשלב 1.5.4. הערה: למשתמש הקצה צריך לייעל את תנאים, כך ששחרור ascorbate אינו מוגבל על ידי ascorbate תאיים.
5. קביעת שחרור LDH
- עם 200 μl הנותר של פתרון תאי מכל מדגם לנהל assay שחרור LDH 32,41 כדי לקבוע את מידת תמוגה הסלולרית. הערה: לחשב כ% מLDH releasable המוחלט. לקבוע LDH releasable מהדגימות שטופלו בsaponin .0.1%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קביעת Ascorbate תאית בתאי השעיה מתורבתים
ב assay הראשון (איור 1), ascorbate תאיים נקבע, בעקבות ascorbate ספציפי הפחתה (AO רגיש כלומר) של ferricyanide לשל ברזל, תוך שימוש בנחישות רגישה מאוד של של ברזל על ידי הליך שפורסם בעבר 37. זיהוי של ascorbate מבוסס על קלאציה colorimetric של ברזל ברזל שנוצר על ידי הפחתת ascorbate תלוי של ferricyanide לשל ברזל, ואחריו הירידה של ברזל ברזל ברזל על ידי של ברזל. כריכוזי supraphysiological של כמה יונים דו ערכית מתכת (לדוגמא: 2 + CO 2 + Cu, ו Zn 2 +) יכולים להפריע, ככל הנראה על ידי מתחרה עם ברזל ברזלי לקלאציה ידי ferene-S, יש לנקוט אמצעי זהירות מתאימה בתנאים כאלה 37.
דמות2 מראה עקום סטנדרטי אופיינית למערכת של הסטנדרטים ascorbate 0-20 מיקרומטר (או 0-2 ascorbate nmole לכל טוב של הצלחת 96 היטב; ראה שלב 6.5 ב" הפרוטוקול ".). למרות שלא ניתן לראות בנתון זה, ליניאריות נשמרת עד 8 ascorbate nmole בכל טוב (כלומר בניכוי ננומטר 593 של ~ 1.6), אשר תואם את ריכוז ascorbate מדגם של ~ 80 מיקרומטר. Assay יכול לשמש כדי לזהות בהצלחה רמות ascorbate מתחת 0.25 ascorbate nmole בכל טוב (מדגם ריכוז ascorbate 2.5 מיקרומטר).
תאי K562 במהירות לצבור ascorbate תאיים מDHA תאי, אבל לא ascorbate (ראה איור 3; לשכפל באישור מהליין וLawen 2008 19). בניסוי נציג זה, תאים נשטפו-PBS K562 (4 × 10 6 תאים / מיליליטר) הודגרו ב-PBS עם 500 מיקרומטר של או ascorbate (ASC), DHA, DHA + 50 cytochalasin מיקרומטר B (DHA + CB), עולה + 5 ferricyanide מ"מ (sc / FIC) או עולה + 50 U AO מיליליטר / (עולה / AO) למשך 30 דקות ב37 ° C. ascorbate תאיים נקבע כמתואר ב" הפרוטוקול ".
DHA ספיגה על ידי תאי K562 מתרחש על ידי טרנספורטר המקדם גלוקוז (עודף) בתיווך תחבורה (ראה איור 4; לשכפל באישור מהליין וLawen 2009 42). כדי להעריך את מעורבותם של עודפים בספיגת DHA בניסוי נציג זה, תאי K562 הודגרו עם ריכוזים הולך וגדל של cytochalasin B (CB) או dihydrocytochalasin B (H 2 CB) מומס בMBS המכיל אתנול 0.5% ל15 דקות ב 37 מעלות לפני דגירה עם 400 מיקרומטר DHA ל30 דקות על 37 מעלות צלזיוס באותו המדיום (איור 4). תאים אז נשטפו שלוש פעמים בשל MBS קר כקרח 100 כרכים וascorbate תאיים שלהם נקבעו כמתואר ב" הפרוטוקול ". חשוב לציין, בזמן ששניהם CB ו-H CB 2 לעכב תהליכי ניעתי במייקרוריכוזים (1-100 מיקרומטר), רק CB, שונה מH 2 CB על ידי הנוכחות של קשר כפול אחד, מעכב תחבורת שפע תלוי בריכוזים נמוכים מייקרו (1-10 מיקרומטר) 43. לכן, כמו ספיגת DHA הייתה inhibitable ידי CB עם IC 50 <2.5 מיקרומטר, אך לא הייתה inhibitable ידי H 2 CB, ספיגת DHA כנראה מתרחשת בתחבורה בתיווך שפע 38. לחלופין, באיור 4 ב ', תאים נשטפו נחשפו לריכוזים הולך וגדל של שפע-יביל, אבל אנלוגי גלוקוז שאינו מטבולית 3 - O-methyl-D-גלוקוז (3-OMG) או L stereoisomer גלוקוז שאינו שפע-יביל - גלוקוז לפני דגירה עם DHA כמו בא פנל שוב התוצאות מצביעות על מעורבות שפע ביבוא DHA כעיכוב של הצטברות ascorbate תאית מתרחשת רק בנוכחות גלוקוז האנלוגית שפע-יביל.
Determination של Ascorbate-זרימה מתאים חסידים
ב assay השני, שיעור ascorbate-זרימה מהתאים בתרבית ניתן לקבוע. assay הספציפי זה חשוב כמו שחרורו של ascorbate מהתאים נראה חיוני לספיגת הסלולר מוסדר ascorbate של ברזל שאינו מאוגד transferrin על ידי תאי 19,20. הספיגה של ברזל שאינו מאוגד transferrin נחשבת רלוונטי להפתופיזיולוגיה של הפרעות ברזל עומס יתר כגון hemochromatoses 22, כמו גם לחילופי astrocyte נוירון ברזל והומאוסטזיס במוח של היונקים 22. ואכן, יש לנו לראות לאחרונה כי הנוירוטרנסמיטר העיקרי מעורר, L-גלוטמט, גורם לשחרור של ascorbate מהאסטרוציטים באופן שתלוי בספיגת L-גלוטמט על ידי GLAST ונפיחות סלולריות הבאות שגורמות לשחרור של ascorbate ידי VSOACs המשוער 32. באנלוגיה, r ascorbateelease מהאסטרוציטים טעון ascorbate יכול להיות מגורה על ידי חומצת אמינו מעוררת, L-aspartate, אבל לא L-גלוטמין חומצת אמינו לא מעורר. השפעה זו מתוארת באיור 5 (לשכפל באישור מהליין וLawen 2012 32), אשר מציג מנת תגובה עקומות לגירוי של ascorbate (AA) על ידי שחרור aspartate (מעגלים סגורים) וגלוטמין (עיגולים פתוחים) מתרבויות העיקריות של האסטרוציטים עכבר טעון ascorbate.
חשוב לדון כיצד assay ascorbate-זרימה זו שונה מassay הניתן לקביעת ascorbate תאית. ההבדל העיקרי טמון בעובדה כי רמת ascorbate שנותר בפתרון לא נקבעת על ידי תגובה כימית שנערכה בסוף נקודת זמן נתונה, כפי שקורה לשיטת קביעת ascorbate תאית. במקום זאת, "חתימת רדוקטיבי" היא צברהבמהלך התקופה שבה ascorbate משתחרר מהתאים. חתימת הצמצום הזה, הוא נתפס בצורה של הפחתת ascorbate תלוי של ציטרט וברזל תאי ואחריו קלאציה המהירה של ברזל ברזליות כ- impermeant הממברנה תאי וגדול [Fe (II) (ferene-S) 3] 4 - chelate . Ferene-S יכול להיחשב דומה קרום impermeant במהלך assay זמן הקצר. הרמות מורכבות chromogenic זה אז יכולה להיות נקבעו כמדידת נקודת סיום. כרמות AO רגישות רק של chelate זה נקבעות, assay מספק גבוהות מעלות של ייחוד לנחישות של L-ascorbate תאי.
איור 1. תרשים זרימה המציגה את השלבים העיקריים בפרוטוקולקביעת ascorbate תאית.
איור 2 עקומה סטנדרטית אופיינית למערכת של הסטנדרטים ascorbate 0-20 מיקרומטר.. (או 0-2 ascorbate nmole לכל טוב של הצלחת 96 היטב;. ראה שלב 6.5 ב" הפרוטוקול ") ברים שגיאה אינם מוצגים כ הם נמצאים בטווח שנכבש על ידי סימנים.
איור 3. K562 תאים במהירות לצבור ascorbate תאיים מDHA תאי, אבל תאי K562 דהויים PBS לא ascorbate. (4 × 10 6 תאים / מיליליטר) הודגרו ב-PBS עם 500 o מיקרומטרf או ascorbate (ASC), DHA, DHA + 50 cytochalasin מיקרומטר B (DHA + CB), עולה + 5 ferricyanide מ"מ (עולה / FIC) או עולה + 50 U / ml AO (עולה / AO) ל30 דקות ב 37 מעלות ג ascorbate תאיים נקבע כמתואר ב" הפרוטוקול ". התוצאות המוצגות הן באמצעות שלושה ניסויים נפרדים (+ SD). * ריכוז ascorbate תאיים נאמד באמצעות מרחב מים תאיים שנקבע מראש לK562 תאים (כלומר ~ 1.6 μl/106 תאים) 19,20. נתון זה שוחזר באישור ליין וLawen 2008 19.
איור 4. ספיגת DHA על ידי תאי K562 מתרחשת על ידי טרנספורטר המקדם גלוקוז (עודף) בתיווך הובלה. K562 תאים שגדלו 6-8 × 10 6 תאים / מיליליטר בRPMI +10% (V / V) בסרום שור העובר על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באוויר ו95% היו בתחילה נשטף שלוש פעמים עם MBS. תאים נשטפו לאחר מכן נחשפו להגדלת ריכוזים של cytochalasin B (CB; סיגמא) או dihydrocytochalasin B (H 2 CB) מומס בתמיסת מלח מגבים שנאגרו (MBS; 137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 15 מ"מ מגבים-Na +, pH 7.3 ) מכיל 0.5% אתנול לפני דגירה עם 400 מיקרומטר DHA ל30 דקות ב 37 ° C (A). תאים אז נשטפו שלוש פעמים בשל MBS הקר 100 כרכים וascorbate תאיים שלהם נקבעו כמתואר ב" הפרוטוקול ". כספיגת DHA הייתה inhibitable ידי CB, אבל לא H 2 CB, ספיגת DHA מתרחשת בתחבורה בתיווך שפע. לחלופין, ב( ב '), תאים נשטפו נחשפו לריכוזים הולך וגדל של שפע-יביל, אבל אנלוגי שאינו מטבולית גלוקוז 3 - O-methyl-D-גלוקוז (3-OMG) או stereoisomer גלוקוז שאינו שפע-יביל
איור 5. שחרור Ascorbate מהאסטרוציטים טעון ascorbate הוא מגורה על ידי L-aspartate חומצת אמינו מעורר, אבל לא L-גלוטמין חומצת אמינו לא מעורר. נתון זה מראה מנת תגובה עקומות לגירוי של ascorbate שחרור (AA) על ידי aspartate (מעגלים סגורים) וגלוטמין (עיגולים פתוחים) מתרבויות העיקריות של האסטרוציטים עכבר טעון ascorbate. הנתונים המוצגים הם אמצעי (± SD) של שלושה ניסויים. P <לעומת 0.001מצבו הבסיסי ". נתון זה שוחזר באישור ליין וLawen 2012 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה אנו מציגים שני מבחני microplate colorimetric מהירים, ספציפיים ורגישים יחסית לקביעת ascorbate נגזר מתאי התוך וחוץ תאיים בתאים בתרבית. ניתן להשלים מבחני עם גישה לציוד מעבדה סטנדרטית וחומרים כימיים. מגיב רק יקר באופן מתון הנדרש לassay הוא AO, שהוא חיוני כפי שהוא מקנה גבוהה מידת הספציפיות אנליטי כלפי L-ascorbate. מבחני הם גם מתאימים לשני תאי השעיה (למשל K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים מכרסמים עיקריים HepG2 או), וכבר מועסקים בהצלחה בפרסומים קודמים באמצעות תאים כאלה 19,20,32,37,38. יש להימנע מהשימוש בתכשירים אחר חמצון ascorbate (למשל Tempol) במקום של AO כפי שהם לא מספיק ספציפיים לL-ascorbate. בנוסף, השימוש בתרכובות כגוןTempol בassay ascorbate השחרור יהיה מבולבל על ידי היכולת של Tempol לחצות קרומים תאיים וחמצן ascorbate תאיים 44. AO הוא בעצם קרום impermeant על קורסי הזמן בשימוש.
יש לנו לבצע השוואה ישירה של התוצאות שהושגו עם assay colorimetric ascorbate שתואר לעיל ונחישות ascorbate fluorometric של Vislisel ועמיתים 36. מצאנו כי שני מבחני נתנו תוצאות זהות עבור assay תאיים נחישות ascorbate (מידע לא מוצג). מעניין לציין, כי assay ascorbate השחרור תואר לעיל נתן ערכים גבוהים יותר באופן משמעותי לשיעור זרימת ascorbate לכאורה מאשר עם assay נקודת סיום fluorometric. הדבר מצביע על כך assay ascorbate-זרימה המתוארת כאן מאפשר להגדרה של "ascorbate-זרימה" ברורה שהוא לא מבולבל כמו בקלות על ידי הסבירות של ascorbate ספיגה מחדש על ידי תאים; תהליך זה צפוי כרוך plSVCTs קרום אסמא. ספיגה מחדש כזה נוטה לגרום להערכה נמוכה מדי של הרמות בפועל של ascorbate שפורסמו בתקופה נתונה, אם מדידת ascorbate נקודת הסיום נלקחה. יש לציין שאם דגימות רקמה (למשל שרירים, ריאות או מוח) הן לשמש במקום תאים בתרבית עבור assay נחישות ascorbate תאיים, אז homogenate רקמה צריך להיות בנוי באמצעות CPB קר כקרח וצורה כלשהי של הפרעה מכאנית ( למשל dounce הומוגניזציה, sonication חללית-טיפ, עיתונות צרפתית וכו '.). פסולת הסלולר יש להסיר על ידי צנטריפוגה והמשתמש צריך לשקול את הצורך האפשרי עבור deproteinization מדגם ו / או תוספת של מעכבי פרוטאז לפני שתמשיך עם שלב 1.2.4.
אנחנו גם דיווחו ריכוזי מייקרו בעבר כי נמוכים של cytochalasin B (<10 מיקרומטר) לא לעכב את קצב, לכאורה, של ascorbate-זרימה שנקבעו על ידי assay 32 19, 20,38.
ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקולים אלה. ראשית, המבחנים המתוארים במסמך זה תלויים באופן קריטי על היכולת של AO באופן סלקטיבי ובמהירות כדי להסיר ascorbate בדגימות לזווג. אם הפעילות מסוימת של הכנת AO היא במידה ניכרת פחות מהפעילות הנומינלית והניחה, זה אפשרי, כי לא כל ascorbate בים AO-המכילamples יוסר. זה עשוי להוביל להערכה נמוכה מדי של כמות ascorbate בדגימות ידועות אם באמצעות "השיטה הישירה" כדי לחשב את הסכום של הווה ascorbate. עם זאת, אם אחד לא משתמש "השיטה סטנדרטית העקומה", שבו מומלצת, הכנות נמוכה פעילות של AO רק יובילו לאובדן של assay-רגישות. מצאנו כי תוצאות טובות מתקבלות באופן עקבי באמצעות תכשירים של AO נבנו על ידי המסת 1,000 U של AO ב 1 מיליליטר של או PBS או MBS, אשר מחולק לאחר מכן ל100 aliquots μl המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ חודש אחד. יתר על כן, כAO הוא חלבון שיכול להיות מושפל על ידי proteolytically lysates תא, ניתן להוסיף לתא lysates מעכבי פרוטאז לפני תוספת של lysates לבארות AO-המכילות. זה עשוי להיות שימושי לשינוי בחשבון בעת השימוש בlysates תא או רקמה שעשירות בפעילות פרוטאז.
יתר על כן, הרגישות של מבחני שתוארהבוב במידה רבה תלוי בשימוש של bidentate chromogenic Fe (II)-chelator, Ferene-S. chelator זה יכול להיות מוחלף על ידי chelators כימי דומה כגון ferrozine וdisulfonate bathophenanthroline, אך עם ירידה ברגישות המתאימה למקדם הכחדה שלהם פה (השני) chelates 37. יתר על כן, יש לנקוט זהירות בעת שימוש disulfonate bathophenanthroline, כפי שהוא מופיע כדי להוביל לשיעורים גבוהים יותר של ferrireduction זירוז ניכר בנוכחות של קומפלקסי ציטרט ברזל מאשר Ferene-S או Ferrozine 37,45. זוהי דאגה הרלוונטית במקרה של assay ascorbate השחרור כמראה שאינו ascorbate תלוי של Fe (II)-chelate יקטין את הרגישות של assay.
בעוד assay ascorbate-הנחישות תאית תואם תאים חסיד, ניתוק של תאים כאלה לפני תמוגה הסלולרית צריכה להתבצע על ידי גירוד מכאני ולא טריפסין / EDTA. כטריפסין הוא פרוטאזסביר להניח שיפריע שלילי עם צעד ascorbate-דלדול עם AO, האחרון שבם הוא חלבון. בנוסף, EDTA צפוי להפריע לצעד נחישות FOC ידי chelating ברזל בתחרות עם ferene-S 37. יש להימנע סוכנים כאלה. לבסוף, assay שחרור ascorbate ניתן היה בקלות להיות מותאם לתאי השעיה. במקום aspirating את שמעליה Fe (II) (ferene-S) 3 המכילים chelate בסוף assay, התאים צריכים להיות משקעים במהירות על ידי צנטריפוגה כעבור assay ascorbate-הנחישות תאית. הספיגה ב 593 ננומטר של supernatant אז צריכה להיות נחושה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לד"ר סטיבן רובינסון והגב 'הניה צ'רבינסקה (אוניברסיטת מונאש) לאספקה הנדיבה של תרבויות astrocyte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
References
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
- Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
- Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
- Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
- Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
- Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
- Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
- Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
- Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
- Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
- Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
- Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
- May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
- Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
- Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
- Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
- Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
- Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
- Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
- Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
- Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
- Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
- Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
- Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
- Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
- Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
- Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
- Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
- Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
- Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
- May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
- Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).
