Summary
Ascorbat spiller mange vigtige roller i cellulære stofskifte, hvoraf mange har kun kommet frem i de seneste år. Her beskriver vi en medium-throughput, specifik og billig mikroplade assay til bestemmelse af både intra-og ekstracellulære ascorbat i cellekultur.
Abstract
C-vitamin (ascorbat) spiller mange vigtige roller i cellulære stofskifte, hvoraf mange kun har kommet for dagens lys i de seneste år. For eksempel i hjernen, ascorbat handler på en neuroprotektiv og neuromodulatory måde, der involverer ascorbate cykling mellem neuroner og vicinale astrocytter - et forhold, der synes at være afgørende for hjernens ascorbate homeostase. Derudover nye beviser tyder stærkt på, at ascorbat har en stærkt udvidet rolle i reguleringen af cellulære og systemiske jern stofskifte end er klassisk anerkendt. Den stigende erkendelse af den integrerende rolle i ascorbat i normal og dereguleret cellulære og organismal fysiologi kræver en vifte af medium-throughput og højfølsomme analytiske teknikker, der kan udføres uden behov for meget dyrt specialudstyr. Her giver vi eksplicitte instruktioner til en medium-throughput, specifikke og relativt billig mikroplade assay til bestemmelse af both intra-og ekstracellulære ascorbat i cellekultur.
Introduction
Opdagelsen af den kemiske natur af ascorbinsyre (vitamin C) og dens identifikation som længe søgte "anti-scorbutic faktor" af Albert Szent-Györgyi og andre i papirer offentliggjort 1928-1934 1 var skelsættende begivenheder i historien i biokemi. Faktisk disse opdagelser har bidraget til Szent-Györgyi blive tildelt Nobelprisen i fysiologi eller medicin i 1937. Den stadig voksende suite af roller for ascorbat i dyre-og plantefysiologi, såvel som menneskers sundhed fortsat være emnerne for aktiv videnskabelig undersøgelse og kontroverser.
-L-ascorbat er en rigelig fysiologisk reduktionsmiddel og enzym cofaktor i mammale systemer, og bidrager til en lang række veldefinerede enzymatiske reaktioner, der involverer kollagen hydroxylering, carnitin og noradrenalin biosyntese, tyrosin metabolisme og peptidhormon amidering 2. Interessant montage EVIDEnce foreslår, at ascorbat spiller en rolle i at stimulere andre jern-afhængige dioxygenases, såsom prolyl-og asparaginylrester hydroxylaser involveret i hydroxylering og målretning af hypoxi-inducerbare faktorer (HIFs) 1α og 2α 3. En nylig rapport viser, at ascorbat spiller en rolle i T-celle modning gennem påvirker kromatin demethylering via sin aktivitet i stimulere nukleare hydroxylaser, Jumonji C (JmjC) domæne proteiner; hvor sidstnævnte synes at kræve ascorbat for fuld aktivitet 4. Faktisk, stimulering af sådanne enzymer af ascorbat synes at forekomme ved en lignende mekanisme til stimulering af ascorbat af HIF og collagensygdomme hydroxylaser. Blandt andre klassiske virkninger, ascorbat bidrager væsentligt til cellulære antioxidation som et vandopløseligt kædebrydende radikalrensemiddel 5, og for genvinding af plasmamembranen α-tocopherol (vitamin E) via reduktion af α-tocopheroxyl radikal 6, which er vigtigt at beskytte mod membran lipidperoxidering 7. Vigtigere er det, selv om de fleste pattedyr er i stand til de novo hepatiske syntese af ascorbat fra D-glucose, højere primater, marsvin og nogle flagermus afhænger kostkilder af vitaminet 8. Dette skyldes, at inaktivering af Gulo genet, orthologues hvoraf i upåvirkede pattedyr koder for enzymet, γ-gulono-lacton oxidase 9-13. Dette enzym er nødvendigt for den endelige reaktion i ascorbat biosyntese fra glucose 13.
Efter transportør-medieret absorption fra tarmen hos mennesker er ascorbat fordelt i hele kroppen ved kredsløbssygdomme. Vitaminet er typisk findes i sin reducerede form ved millimolære koncentrationer intracellulært (med undtagelse af erythrocytter i hvilke koncentrationer typisk er lig den fremherskende plasma koncentration), og ved mikromolær concentrations (f.eks 50-200 uM) i de fleste ekstracellulære væsker 14,15.
Under fysiologiske betingelser ascorbat typisk undergår en reversibel en-elektron-oxidation til ascorbyl frie radikaler (AFR, også kendt som monodehydroascorbate eller semidehydroascorbate). Mens AFR er et relativt stabilt radikal 16, i mangel af sin hurtige one-elektron enzymatisk reduktion tilbage til ascorbat kan to AFRs yderligere dismutate til en ascorbat og én dehydroascorbate (DHA) 9,13,17. Inden i det indre af cellen, to-elektron-oxidation produkt af ascorbat, DHA, kan reduceres hurtigt tilbage til ascorbat ved glutathion-og NAD (P) H-afhængige enzymatiske og ikke-enzymatiske reaktioner 13.
Selv om det klassisk er accepteret, at ascorbat eneste væsentlig rolle i jern stofskifte er at stimulere absorptionen af non-hæm jern 18 kosten, har vi og andre fremlagt beviser strongly tyder på, at ascorbat spiller en stærkt udvidet rolle i metabolismen af dette metal. Først ascorbat der er udgivet af askorbatniveauer-propfuld celler synes at spille en vigtig rolle i at modulere optagelsen af non-transferrin-bundet jern af celler 19,20, og meget nyere undersøgelser viser, at ascorbat modulerer også optagelsen af transferrin-bundet jern af celler 21, hvoraf sidstnævnte svarer til en større fysiologisk jern-uptake rute 22.
Ascorbat er afgørende for den normale funktion af centralnervesystemet i pattedyr 23,24. Sammen med den adrenale cortex, hypofyse, thymus, retina og corpus luteum, hjernen indeholder høje koncentrationer af ascorbat i forhold til andre kropsvæv 23,25-27. Derudover er eksponering af både astrocytter 28,29 og neuron-lignende celler 30 glutamat kendt for at udløse frigivelse af ascorbat i det ekstracellulære rum, hvor ascorbate menes at hjælpe med at beskytte neuroner mod glutamat-induceret neuronal dysfunktion 31. Mens de nøjagtige mekanisme af glutamat-induceret ascorbate frigivelse fra astrocytter er ukendt, har vi for nylig fremlagt beviser indikerer inddragelse af celle hævelse forårsaget af glutamatoptagelse ved astrocyte glutamat og aspartat transporter (GLAST, også kendt stimulerende aminosyretransporter isoform 1 [EAAT1 ] i mennesker) og deraf følgende aktivering af volumen-følsomme osmolyt og anion-kanaler (VSOACs), der er gennemtrængelig for små organiske anioner såsom ascorbate 32. Den molekylære identitet af plasmamembranen ledningerne involveret i VSOAC dannelse mangler at blive identificeret 33,34.
Selv om der er udviklet mange analyser til bestemmelse af ascorbat i biologiske prøver, som omfatter spektrofotometriske, fluorometriske og kromatografiske analyser 35,36, der er meget variation i specificitet, sensitivitet, interference af kemiske forureninger, effektiv lineær rækkevidde og stabilitet endpoint analyt. Derudover andre vigtige faktorer, der påvirker valget af assayet er hurtighed, brugervenlighed og adgang til de relativt specialiseret udstyr, såsom en høj-performance væskekromatografi (HPLC)-apparat.
Her præsenterer vi en enkel og meget specifik kolorimetrisk mikroplade-assay til bestemmelse af intracellulære ascorbat i dyrkede celler, såvel som en særskilt analyse til bestemmelse af ascorbat-efflux fra dyrkede celler. Sidstnævnte analyse har til formål at omgå problemet med undervurdering af ascorbat fra celler på grund af hurtig genoptagelse af frigivet askorbat ved natrium-afhængige askorbatniveauer transportører (SVCTs). Selv om begge af disse metoder har optrådt i nogle af vores tidligere udgivelser 19,20,32,37,38, dette manuskript giver en eksplicit sæt af instruktioner og retningslinjer for en effektiv udførelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Bestem Intracellulær Ascorbat i dyrkede celler
- Celledyrkning og høst
- Grow suspension (f.eks menneskelig erythroleukemia, K562) eller omliggende celler (fx primære astrocytter), ved hjælp af standard kultur procedurer 19-21,32,38. Bemærk: For at sikre celler indeholder ascorbat, indlæse dyrkede celler med ascorbat enten som ascorbat eller DHA 33,39.
- Opret en ascorbat indeholdende cellulær ekstrakt
- Inkuber et passende antal phosphatpufret saltvand (PBS) vasket suspension eller omliggende celler med 450 pi iskold Cell Permeabilisering Buffer [CPB; 0,1% (w / v) saponin i PBS; 4 ° C]. Bemærk: Bestem antallet af celler, der kræves for at opnå en absorbans værdi inden for det lineære område af assayet (se nedenfor) empirisk af slutbrugeren. Bemærk: kan også anvendes vævsekstrakter (se Diskussion for yderligere detaljer).
- Agitate celler på is i 10 min for at sikre grundig cellelyse.
- Opret en klaret ascorbat indeholdende intracellulær ekstrakt ved fjernelse af cellerester ved centrifugering af det rå lysat ved 16.000 x g i 5 minutter i en mikrocentrifuge nedkølet (4 ° C).
- Fjern forsigtigt 4 x 100 ul aliquoter fra hver prøve og tilføje til en horisontal sekvens af brønde i en 96-brønds fladbundet plade, der indeholder enten 25 ul / brønd PBS ("-AO") kun eller 25 gl / brønd på 45,5 U / ml stamopløsning af L-ascorbat-oxidase (AO) i PBS ("+ AO"). Bemærk: dette bør ske sideløbende med udarbejdelsen af standarderne (se nedenfor).
- Ascorbat standard-kurve konstruktion (skal være konstrueret på ny for hver analyse)
- Der fremstilles en stamopløsning af 10 mM ascorbinsyre i iskold PBS. Bemærk: Kontroller koncentrationen af ascorbat spektrofotometrisk ved hjælp af en kvartscuvette med en 1cm vejlængde på 265 nm (ekstinktionskoefficient = 14,5 mM -1 cm -1) 40..
- Forbereder sig omhyggeligt en række askorbatniveauer standarder mellem 0 og 20 uM.
- Parallelt med trin 1.2.4, fjernes forsigtigt 4 × 100 pi alikvoter fra hver standard og tilføje til en horisontal sekvens af brønde i en 96-brønds fladbundet plade, der indeholder 25 gl / brønd af PBS ("-AO") eller en 45,5 U / ml stamopløsning af AO i PBS ("+ AO"). Bemærk: 100 pi af ovenstående ascorbat standarder vil indeholde 0-2 nmol ascorbat. Bemærk venligst, at formålet med AO er at kontrollere for bidrag fra ikke-askorbatniveauer reduktanter til ferricyanid reduktion.
- Bestem intracellulær ascorbat - Trin 1: Fjern selektivt ascorbat og kvantitativt oxidere askorbat med ferricyanid
- Orbitalt blande 96-brønds plade ved 550 rpm ved stuetemperatur i 5 minutter i mørke ved at dække pladen i folie. Bemærk: Thans skridt bør oxidere alle ascorbat i "+ AO" boringer til DHA. De "-AO" brønde bør være upåvirket.
- Tilsæt 50 ul 3,5 mM kaliumferricyanid (heri benævnt "ferricyanid") i PBS til alle brønde. Den endelige [ferricyanid] = 1 mM. Bemærk: Brug en multipipettor.
- Orbitalt blandes pladen ved 550 rpm ved stuetemperatur i yderligere 5 minutter i mørke. Bemærk: Dette trin bør resultere i en reduktion af ferricyanid til ferrocyanid ved ascorbat i et støkiometrisk forhold på 2 molekyler af ferricyanid reduceret pr 1 molekyle ascorbat oxideret.
- Straks tilføje 25 pi af en frisk fremstillet opløsning indeholdende 50% (v / v) eddikesyre og 30% (w / v) trichloreddikesyre (TCA). Bemærk: Brug en multipipettor.
- Bestem intracellulær ascorbat - Trin 2: kvantificere mængden af ferrocyanid dannede 37
- Tilsæt 100 ml af opløsningen ferrocyanid beslutsomhed 37 til eACH godt. Bemærk: En brugsopløsning skal ske umiddelbart før brug: 2 ml 3 M Na-acetat (pH 6,0); 0,5 ml iseddikesyre (~ 17,4 M eddikesyre); 2 ml 0,2 M citronsyre; 2 ml 3,3 mM FeCl3 i 0,1 M eddikesyre; 1 ml 30 mM ferene-S. Det endelige volumen af dette arbejde opløsning skal være 7,5 ml.
- Orbitalt blandes pladen i mørke ved 550 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Læs absorbansværdier af brøndene ved 593 nm (dvs. maksimum af Fe (II) (ferene-S) 3-kompleks absorbans).
- Beregn mængden af intracellulære ascorbat som nmol ascorbat per million celler ved først at fratrække A 593 nm værdier for '+ AO «brønde fra de tilsvarende" - AO' brønde for hver prøve, og derefter interpolere fra ascorbat standard kurve (se trin 1.3 ). Ved etablering af standardkurven, plotte denne "forskel value" for hver standard imod mængden af ascorbspiste per brønd.
2.. Bestemmelse af Ascorbat-udstrømning fra dyrkede celler
- Celledyrkning og høst
- Grow suspension eller adhærente celler som ovenfor (se trin 1.1). Bemærk: udføre nedenstående analyse i en 24-brønds plat format med suspension og adhærente celler for de bedste resultater.
- Resuspender suspensionsceller eller overlejre adhærente celler med 400 pi forvarmet HEPES-bufret saltopløsning, med eller uden calcium og magnesium og indeholdende 5 mM D-glucose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) i brønde af en 24-brønds plade. Tilsæt samme mængde HBS / D til bestemte cellefrie brønde på hver plade med 24 brønde, der skal undersøges. Bemærk: disse vil tjene som cellefrie styringer til baseline reaktion (se nedenfor).
3.. Bestemme mængden af Ascorbat Udgivet
- Følgende stamopløsninger skal være forberedt på forhånd: 120U / ml AO i HBS / D (forberede friske); 2,4 mM Ferene-S i HBS / D; 120 uM FeCl 3 og 600 uM Na-citrat i HBS / D (forberede straks fra mere koncentrerede stamopløsninger).
- For at starte ferrireduction reaktion (endelig volumen pr vel burde være 600 ul), tilføje følgende mængder reagenser til de enkelte brønde allerede indeholder 400 pi HBS / D:
- Tilsæt 50 ul af AO (120 U / ml) eller HBS / D til parret brønde i tre eksemplarer. Den endelige AO koncentration bør være 10 U / ml. Bemærk: Label parret brønde som "- AO" og "+ AO".
- Bland pladerne med blid orbital blanding i 5 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 50 ul 2,4 mM ferene-S til alle brønde. Den endelige ferene-S koncentration bør være 200 uM. Bland pladerne som ovenfor i 5 minutter ved 37 ° C.
- Tilsæt 50 ul af frisk fremstillet 120 pM ferricitrat. Den endelige jern og citrat koncentrationer bør være 10 uM jern og 50 uM citrat. Bland godt.
- I tre tredobbelte kontrolbrønde, opsug overliggende medium og tilsæt 600 ul HBS / D indeholdende 0,1% saponin. Bemærk: Disse vil fungere som "100% celle-lysis" kontroller for en lactatdehydrogenase (LDH) release assay skal gennemføres parallelt (se nedenfor).
- Inkuberes i 60 minutter i mørke ved 37 ° C.
- Ved udgangen af ascorbat-efflux assay hurtigt aspireres 500 pi fra hver brønd og tilsæt til passende mærkede brønde i en 24-brønds plade. Bemærk: For suspensionsceller, først fjerne cellerne ved centrifugering ved 4 ° C.
- Der tilsættes 300 pi alikvoter af supernatanten til en 96-brønds plade, og derefter aflæst ved 593 nm.
4.. Bestemmelse af ekstracellulære Ascorbat
- Læs absorbansværdier af brøndene ved 593 nm.
- Beregn mængden af ekstracellulær ascorbat som nmol ascorbat per mg protein (eller per million celler) som beskrevet for bestemmelse af intracellulære ascorbati trin 1.5.4. Bemærk: slutbrugeren skal optimere betingelser, så ascorbat frigivelse ikke er begrænset af intracellulær ascorbat.
5.. Bestemmelse af LDH Udgivelsesdato
- Med de resterende 200 pi ekstracellulære opløsning fra hver prøve foretage en LDH-frigivelse-assay 32,41 for at bestemme omfanget af cellelyse. Bemærk: beregne som% af den samlede udløselig LDH. Bestem løsbare LDH fra prøver, der blev behandlet med 0,1% saponin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemmelse af Intracellulær askorbat Dyrkede suspensionsceller
I det første assay (figur 1), er intracellulær ascorbat bestemmes efter ascorbat-specifikke (dvs. AO-følsomme) reduktion af ferricyanid til ferrocyanid ved hjælp af den meget følsom bestemmelse af ferrocyanid ved en tidligere offentliggjort procedure 37. Påvisningen af ascorbat er baseret på kolorimetriske chelatering af ferrojern, der genereres af ascorbat-afhængig reduktion af ferricyanid til ferrocyanid, efterfulgt af reduktion af ferri til ferro-jern ved ferrocyanid. Som suprafysiologiske koncentrationer af nogle divalente metalioner (f.eks Cu 2 +, Co 2 + og Zn 2 +) kan forstyrre, formentlig ved at konkurrere med ferro jern til kelation ved ferene-S, der bør træffes passende forholdsregler under sådanne betingelser 37.
Figur2 viser en typisk standardkurve for et sæt af ascorbat standarder 0-20 uM (eller 0-2 nmol ascorbat per brønd af 96-brønds plade, se trin 6.5 i "protokollen".). Selvom det ikke er vist i denne figur, er linearitet opretholdt op til 8 nmol ascorbat per brønd (dvs. et net A 593 nm ~ 1.6), hvilket svarer til en prøve ascorbat koncentration på ~ 80 uM. Assayet kan anvendes til at afsløre askorbatniveauer under 0,25 nmol ascorbat per brønd (2,5 uM prøve ascorbat koncentration).
K562-celler hurtigt ophobes intracellulært ascorbat fra ekstracellulære DHA, men ikke ascorbat (se figur 3; gengivet med tilladelse fra Lane og Lawen 2008 19). I dette repræsentative eksperiment blev PBS-vaskede K562-celler (4 × 10 6 celler / ml) inkuberet i PBS med 500 pM af enten ascorbat (ASC), DHA, DHA + 50 uM cytochalasin B (DHA + CB), ASC + 5 mM ferricyanid (Afm / FIC) eller ASC + 50 U / ml AO (ASC / AO) i 30 min ved 37 ° C. Intracellulær ascorbat blev bestemt som beskrevet i "Protokol".
DHA optagelse af K562 celler sker ved befordrende glukose transportør (GLUT)-medieret transport (se figur 4; gengivet med tilladelse fra Lane og Lawen 2009 42). For at vurdere inddragelsen af gluts i DHA optagelsen i dette repræsentative eksperiment blev K562-celler inkuberet med stigende koncentrationer af cytochalasin B (CB) eller dihydrocytochalasin B (H 2 CB) opløst i MBS indeholdende 0,5% ethanol i 15 minutter ved 37 ° C før inkubering med 400 pM DHA i 30 minutter ved 37 ° C i det samme medium (Fig. 4A). Cellerne blev derefter vasket tre gange i 100 liter af iskolde MBS og deres intracellulære ascorbat bestemmes som beskrevet i "Protokol". Det er vigtigt at bemærke, mens både CB og H 2 CB inhibere bevægelige processer på mikromolærkoncentrationer (1-100 uM), kun CB, som er forskellig fra H 2 CB ved tilstedeværelsen af en enkelt dobbeltbinding, inhiberer GLUT-afhængig transport ved lave mikromolære koncentrationer (1-10 uM) 43. Derfor, som DHA optagelsen var inhiberbare af CB med en IC50 <2,5 uM, men var ikke inhiberbare af H 2 CB DHA optagelsen sker sandsynligvis ved GLUT-medieret transport 38. Alternativt i figur 4B blev vaskede celler udsat for stigende koncentrationer af GLUT-transportable, men ikke-metaboliserbare glucoseanalog 3 - O-methyl-D-glucose (3-OMG) eller ikke-GLUT-transportable glucose stereoisomer L - glukose før inkubering med DHA som i panel A. Igen indikerer resultaterne GLUT engagement i DHA import som hæmning af intracellulær ascorbat akkumulering forekommer kun i nærværelse af GLUT-transportable glukose analog.
Beslutsomhedtion af Ascorbat-efflux fra vedhæftende celler
I det andet assay kan hastigheden af ascorbat-efflux fra dyrkede celler bestemmes. Denne specifikke analyse er vigtig, da frigivelsen af ascorbat fra celler synes at være afgørende for ascorbat-regulerede cellulære optagelse af ikke-transferrin-bundet jern af celler 19,20. Indtaget af ikke-transferrin-bundet jern anses for at være relevante for patofysiologien af jern-overload lidelser såsom hemochromatoses 22, samt til astrocyt-neuron jern udveksling og homeostase i pattedyrs hjerne 22. Faktisk har vi for nylig vist, at den store excitatoriske neurotransmitter, L-glutamat, udløser frigivelsen af ascorbat fra astrocytter på en måde, der afhænger af L-glutamat optagelse af GLAST og efterfølgende cellulær hævelse, der udløser frigivelsen af askorbat af formodede VSOACs 32. I analogi, ascorbat rUDLØSNING fra ascorbat-loaded astrocytter kan stimuleres ved excitatorisk aminosyre, L-aspartat, men ikke ikke-excitatorisk aminosyre L-glutamin. Denne virkning er vist i figur 5 (gengivet med tilladelse fra Lane og Lawen 2012 32), der viser dosis-respons-kurver for stimulering af ascorbat (AA) frigivelse af aspartat (lukkede cirkler) og glutamin (åbne cirkler) fra primære kulturer af ascorbat-loaded mus astrocytter.
Det er vigtigt at diskutere, hvordan denne ascorbat-efflux analysen adskiller sig fra analysen fremlægges metoder til bestemmelse af intracellulære ascorbat. Den største forskel ligger i det faktum, at niveauet af ascorbat forbliver i opløsning ikke bestemmes ved en kemisk reaktion udført ved afslutningen af et givet tidspunkt, som det er tilfældet for den intracellulære ascorbat bestemmelsesmetode. I stedet er en "reduktiv signatur" akkumulereti løbet af den periode, hvor ascorbat frigives fra cellerne. Denne reduktive signatur er fanget i form af ascorbat-afhængig reduktion af ekstracellulær ferricitrat efterfulgt af hurtig chelatering af ferro-jern som et stort ekstracellulært og membran-impermeabel [Fe (II) (ferene-S) 3] 4 - chelat . Ferene-S kan betragtes tilsvarende membran-impermeabel over korte tidsforløbet af assayet. Niveauerne af denne kromogene kompleks kan derefter bestemmes som et slutpunkt måling. Da kun de AO-følsomme niveauer af dette chelat bestemmes assayet giver en høj grad af specificitet til bestemmelse af ekstracellulær L-ascorbat.
Figur 1.. Flow diagram, der viser de vigtigste skridt i protokollen forbestemmelse af intracellulære ascorbat.
Figur 2 En typisk standardkurve for et sæt askorbatniveauer standarder 0-20 mM.. (Eller 0-2 nmol askorbatniveauer brønd af 96-brønds plade. Se trin 6.5 i "Protokol") Fejllinjer vises ikke som de er inden for det område besat af symbolerne.
Figur 3. K562-celler hurtigt akkumulerer intracellulært ascorbat fra ekstracellulære DHA, men ikke ascorbat. PBS-vaskede K562-celler (4 x 10 6 celler / ml) blev inkuberet i PBS med 500 pM of enten ascorbat (ASC), DHA, DHA + 50 uM cytochalasin B (DHA + CB), ASC + 5 mM ferricyanid (ASC / FIC) eller ASC + 50 U / ml AO (ASC / AO) i 30 min ved 37 ° C. Intracellulær ascorbat blev bestemt som beskrevet i "Protokol". De viste resultater er gennemsnit af tre individuelle forsøg (+ SD). * Den intracellulære ascorbat koncentrationen blev estimeret ved hjælp af en forudbestemt intracellulær vand plads til K562-celler (dvs. ~ 1,6 μl/106 celler) 19,20. Dette tal er gengivet med tilladelse fra Lane og Lawen 2008 19.
Figur 4.. DHA optagelsen af K562-celler sker ved befordrende glucose transporter (GLUT)-medieret transport. K562-celler, der var blevet dyrket til 6-8 x 10 6 celler / ml i RPMI + 10% (v / v) føtalt bovint serum ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luft blev oprindeligt vasket tre gange med MBS. Vaskede celler blev derefter udsat for stigende koncentrationer af cytochalasin B (CB, Sigma) eller dihydrocytochalasin B (H 2 CB) opløst i Mops saltvand (MBS, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 15 mM MOPS-Na +, pH 7,3 ) indeholdende 0,5% ethanol før inkubering med 400 pM DHA i 30 minutter ved 37 ° C (A). Cellerne blev derefter vasket tre gange i 100 liter af kolde MBS og deres intracellulære ascorbat bestemmes som beskrevet i "Protokol". Da DHA optagelse var inhiberbare af CB, men ikke H 2 CB, forekommer DHA optagelse af GLUT-medieret transport. Alternativt, i (B) blev vaskede celler udsat for stigende koncentrationer af GLUT-transportable, men ikke-metaboliserbare glucoseanalog 3 - O-methyl-D-glucose (3-OMG) eller ikke-GLUT-transportable glucose stereoisomer (A). Igen indikerer resultaterne GLUT involvering i DHA optagelse. Dette tal er gengivet med tilladelse fra Lane og Lawen 2008 42.
Figur 5. Ascorbat frigivelse fra ascorbat-loaded astrocytter er stimuleret af excitatoriske aminosyren L-aspartat, men ikke ikke-excitatorisk aminosyre L-glutamin. Denne figur viser dosis-respons-kurver for stimulering af ascorbat (AA) frigivelse af aspartat (lukkede cirkler) og glutamin (åbne cirkler) fra primære kulturer af ascorbat-loaded mus astrocytter. De viste data er middelværdier (± SD) af tre eksperimenter. P <0,001 vsden 'basale' tilstand. Dette tal er gengivet med tilladelse fra Lane og Lawen 2012 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne afhandling præsenterer vi to hurtige, konkrete og relativt følsomme kolorimetriske mikroplatte assays til bestemmelse af ascorbat afledt af de intra-og ekstracellulære rum i dyrkede celler. Analyserne kan være afsluttet med adgang til standard laboratorieudstyr og reagenser. Kun moderat dyrt reagens nødvendig for assayet er AO, hvilket er vigtigt, da det giver en høj grad af analyt specificitet mod L-ascorbat. Analyserne er velegnet til enten suspension celler (f.eks K562) eller omliggende celler (fx HepG2 eller primære gnaver astrocytter), og med succes er blevet anvendt i tidligere udgivelser bruge sådanne celler 19,20,32,37,38. Brugen af andre ascorbat oxidationsmidler (f.eks TEMPOL) i stedet for AO bør undgås, da de ikke er tilstrækkeligt specifikke for L-ascorbat. Derudover er anvendelsen af forbindelser, såsomTEMPOL i ascorbat-release assay vil blive forvirret af evne TEMPOL at krydse cellulære membraner og oxidere intracellulær ascorbat 44. AO er hovedsagelig membran-impermeabel over tidsforløb brugt.
Vi har udført direkte sammenligninger af de opnåede resultater med den kolorimetriske ascorbat analysen beskrevet ovenfor, og den fluorometriske ascorbat bestemmelse af Vislisel og kolleger 36. Vi fandt, at begge assays gav tilsvarende resultater for den intracellulære assay ascorbat bestemmelse (data ikke vist). Interessant, ascorbat-release beskrevet ovenfor gav signifikant højere værdier for den tilsyneladende hastighed af askorbat efflux end med den fluorometriske endepunkt-assay. Dette antyder, at ascorbat-efflux-assay beskrevet heri giver mulighed for bestemmelsen af den tilsyneladende "ascorbat-udstrømning", som ikke så let forstyrret af sandsynligheden for ascorbat-re-uptake af celler; en proces, der sandsynligvis involverer plAsma membran SVCTs. En sådan genoptagelse ville have tendens til at forårsage undervurdering af de faktiske niveauer for ascorbat, der blev udgivet i løbet af en given periode, hvis en endpoint ascorbate måling blev taget. Det skal bemærkes, at hvis vævsprøver (f.eks muskel, lunge eller hjerne) skal anvendes i stedet for dyrkede celler for intracellulære ascorbat bestemmelse assay derefter en vævshomogenat skal konstrueres ved anvendelse af iskold CPB og en form for mekanisk forstyrrelse ( fx Dounce homogenisering, probe-tip lydbehandling franske presse osv.). Cellerester bør fjernes ved centrifugering, og brugeren skal overveje behovet for eventuelle prøve deproteinisering og / eller tilføjelse af proteasehæmmere, før du fortsætter med trin 1.2.4.
Vi også rapporteret tidligere, at lave mikromolære koncentrationer af cytochalasin B (<10 uM) ikke hæmmer tilsyneladende hastighed af askorbat-udstrømning, der blev bestemt af analysen 32 19 20,38.
Der er flere kritiske trin i disse protokoller. Først, de heri beskrevne assays afhænge kritisk på evnen af AO til selektivt og hurtigt fjerne ascorbat parrede prøver. Hvis den specifikke aktivitet af fremstillingen af AO er markant mindre end den nominelle og antaget aktivitet, er det muligt, at ikke alle af ascorbat i AO-holdige filtresempler vil blive fjernet. Dette kan føre til en undervurdering af den mængde ascorbat i de ukendte prøver, hvis du bruger den "direkte metode" til at beregne mængden af ascorbat til stede. Men hvis man bruger "standard-kurve metoden", der anbefales, lav-aktivitets-præparater af AO vil kun føre til et tab af assay-følsomhed. Vi har fundet, at gode resultater konsekvent opnås ved anvendelse af præparater af AO fremstillet ved at opløse 1,000 U AO i 1 ml af enten PBS eller MBS, som derefter opdelt i 100 gl portioner, der er lagret ved -80 ° C i ikke mere end en måned. Yderligere, da AO er et protein, der kan proteolytisk nedbrudt af cellelysater proteaseinhibitorer kan tilsættes til cellelysater før tilsætning af lysaterne til AO-holdige brønde. Dette kan være en nyttig modifikation at overveje, når du bruger celle eller væv lysates der er rige på protease-aktivitet.
Desuden beskrev følsomhed assays vil enBove høj grad afhænger af anvendelsen af det kromogene bidentat Fe (II)-chelator Ferene-S. Denne chelator kan erstattes af kemisk lignende chelatorer såsom FerroZine og bathophenanthrolin disulfonat, men med et fald i følsomhed svarende til ekstinktionskoefficienten for deres Fe (II) chelaterer 37.. Desuden bør der udvises forsigtighed ved brug af bathophenanthrolin disulfonat, som det ser ud til at føre til højere tilsyneladende autokatalytisk ferrireduction i tilstedeværelse af jern citrat komplekser end Ferene-S eller Ferrozine 37,45. Dette er en relevant problem i tilfælde af ascorbat-release assay som den ikke-ascorbat-afhængig udseendet af Fe (II)-chelat vil formindske assayets følsomhed.
Mens den intracellulære ascorbat-bestemmelse assay er kompatibel med adhærente celler bør frigørelse af sådanne celler før cellenedbrydning udføres ved mekanisk skrabning end trypsin / EDTA. Som trypsin er en proteasevil det sandsynligvis interfererer negativt med ascorbat-depletion trin med AO, hvor sidstnævnte er et protein. Derudover vil EDTA sandsynligvis forstyrre trin FOC bestemmelse ved chelaterende jern i konkurrence med ferene-S 37. Sådanne midler bør undgås. Endelig ascorbat frigivelse assay kan let tilpasses til suspensionsceller. I stedet for at aspirere fra den overliggende Fe (II) (ferene-S) 3-holdige chelat ved afslutningen af assayet cellerne bør hurtigt sedimenteret ved centrifugering som for den intracellulære ascorbat-bestemmelse assay. Absorbansen ved 593 nm af supernatanten bør derefter bestemmes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Dr. Stephen Robinson og fru Hania Czerwinska (Monash University) for generøs levering af astrocyt kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
References
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
- Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
- Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
- Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
- Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
- Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
- Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
- Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
- Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
- Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
- Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
- Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
- May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
- Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
- Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
- Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
- Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
- Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
- Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
- Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
- Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
- Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
- Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
- Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
- Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
- Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
- Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
- Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
- Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
- Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
- May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
- Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).
