Summary
Askorbat spiller mange viktige roller i cellenes stoffskifte, og mange av disse har bare kommet frem i lyset de siste årene. Her beskriver vi en medium-throughput, spesifikk og billig mikroplate-analysen for bestemmelse av både intra-og ekstracellulært askorbat i cellekultur.
Abstract
Vitamin C (askorbat) spiller mange viktige roller i cellenes stoffskifte, mange av dem har bare kommet frem i lyset de siste årene. For eksempel, i hjernen, fungerer askorbat i en nervecellene og neuromodulatory måte som innebærer askorbat sykling mellom nevroner og vicinale astrocytter - et forhold som ser ut til å være avgjørende for hjernens askorbat homeostase. I tillegg tyder nye bevis på at askorbat har et sterkt utvidet rolle i å regulere mobilnettet og systemisk jern metabolisme enn er klassisk gjenkjent. Den økende erkjennelse av vesentlig rolle for askorbat i normal og deregulert cellulære og organisme fysiologi krever en rekke mellom gjennomstrømning og høy følsomhet analytiske teknikker som kan utføres uten behov for svært kostbart spesialutstyr. Her gir klare instrukser for en medium-gjennomstrømming, spesifikk og relativt billig mikro assay for bestemmelse av bo vith intra-og ekstracellulært askorbat i cellekultur.
Introduction
Oppdagelsen av den kjemiske natur av askorbinsyre (vitamin C), og sin identifikasjon som den etterlengtede "anti-scorbutic faktor", av Albert Szent-Györgyi og andre i artikler publisert 1928-1934 1 var landemerke hendelser i historien i biokjemi. Faktisk disse funnene bidro til Szent-Györgyi blir tildelt Nobelprisen i fysiologi eller medisin i 1937. Den stadig voksende rekke roller for askorbat i dyre-og plantefysiologi, samt helse, fortsetter å være undersåtter av aktiv vitenskapelig etterforskning og kontrovers.
L-askorbat er en rikelig fysiologisk Reduksjon og enzymkofaktor i pattedyr systemer, og bidrar til en rekke veldefinerte enzymatiske reaksjoner som involverer kollagen hydroksylering, karnitin og noradrenalin biosyntese, tyrosin metabolisme og peptid hormon amidering to. Forbløffende nok montering evidence antyder at askorbat spiller en rolle i å stimulere andre jern-avhengige dioxygenases, slik som prolyl-og asparaginyl hydroksylasene som er involvert i hydroksylering og målretting av den hypoksi-induserbar faktorer (HIFs) 1α og 2α 3.. En fersk rapport antyder at askorbat spiller en rolle i T-celle modning gjennom å påvirke kromatin demetylering via sin aktivitet i stimulere atom hydroksylaser, Jumonji C (JmjC) domene proteiner; sistnevnte som ser ut til å kreve askorbat for full aktivitet 4.. Faktisk, stimulering av slike enzymer ved askorbat synes å forekomme ved en tilsvarende mekanisme for den stimulering av askorbat av HIF-og kollagen-hydroksylasene. Blant andre klassiske virkninger bidrar askorbat vesentlig til cellulær antioxidation som et vannoppløselig kjedebrytende radikal scavenger 5 og til gjenvinning av plasma membran α-tokoferol (vitamin E) via reduksjon av α-tocopheroxyl radikal 6, which er viktig for å beskytte mot membranen lipidperoksidasjon 7.. Viktigere, selv om de fleste pattedyr er i stand til å de novo hepatisk syntese av askorbat fra D-glukose, høyere primater, marsvin og noen flaggermus er avhengig av diettkilder vitamin 8.. Dette er på grunn av inaktivering av Gulo-genet, de orthologues av hvilke i upåvirket pattedyr koder enzymet, γ-gulono-lakton-oksydase 9-13. Dette enzymet er nødvendig for den endelige reaksjon i askorbat biosyntese fra glukose 13.
Etter transporter-mediert absorpsjon fra tarm lumen hos mennesker, er askorbat fordelt over hele kroppen av sirkulasjonssystemet. Vitaminet er vanligvis funnet i sin reduserte form ved millimolar konsentrasjoner intracellulært (med unntak av erytrocytter i hvilke konsentrasjoner er typisk lik den rådende plasmakonsentrasjon), og ved mikromolar konsentrations (f.eks 50-200 mm) i de fleste ekstracellulære væsker 14,15.
Under fysiologiske forhold, askorbat vanligvis gjennomgår en reversibel ett-elektron oksidasjon til ascorbyl frie radikaler (AFR, også kjent som monodehydroascorbate eller semidehydroascorbate). Mens AFR er et relativt stabilt radikal 16, i fravær av sin raske ett-elektron enzymatisk reduksjon tilbake til askorbat, kan to AFRs ytterligere dismutate til en askorbat og en dehydroascorbate (DHA) 9,13,17. Innenfor det indre av cellen, to-elektron oksydasjonsprodukt av askorbat, DHA, hurtig kan reduseres tilbake til askorbat ved glutation-og NAD (P) H-avhengige enzymatiske og ikke-enzymatiske reaksjoner 13.
Mens det er klassisk akseptert at askorbat eneste betydelig rolle i jern metabolisme er å stimulere kosten absorpsjon av ikke-heme jern 18, har vi og andre gitt bevis strongly som tyder på at askorbat spiller en betydelig utvidet rolle i metabolismen av dette metallet. Først, askorbat som er utgitt av askorbat-fylt cellene ser ut til å spille en viktig rolle ved modulering av opptaket av ikke-transferrin-bundet jern av cellene 19,20 og aller siste bevis indikerer at askorbat modulerer også opptaket av transferrin-bundet jern av celler 21, tilsvarer den sistnevnte til en stor fysiologisk jern-opptak rute 22..
Askorbat er viktig for normal sentralnervesystemets funksjon hos pattedyr 23,24. Sammen med binyrebarken, hypofysen, thymus, retina og corpus luteum, inneholder hjernen høye konsentrasjoner av askorbat i forhold til andre kroppsvev 23,25-27. I tillegg er eksponeringen av begge astrocytter 28,29 og neuron-lignende celler 30 til glutamat kjent for å utløse frigjøring av askorbat i det ekstracellulære rom, hvor ascorbate er tenkt å bidra til å beskytte nerveceller mot glutamat-indusert neuronal dysfunksjon 31. Mens den eksakte mekanismen for glutamat-indusert askorbat utgivelse fra astrocytter er ukjent, har vi nylig gitt bevis som indikerer involvering av celle hevelse forårsaket av glutamat opptak av astrocyte glutamat og aspartat transporter (GLAST, også kjent eksitatorisk aminosyre transporter isoformen en [EAAT1 ] hos mennesker), og påfølgende aktivering av volum-sensitive osmolyte-og anion-kanaler (VSOACs) som er gjennomtrengelig for små organiske anioner slik som askorbat 32.. De molekylære identiteter av plasma membran rør involvert i VSOAC formasjon gjenstår å bli identifisert 33,34.
Selv om mange analyser har blitt utviklet for bestemmelse av askorbat i biologiske prøver, inkludert spektrofotometriske, fluorometriske og kromatografiske analyser 35,36, er det mye variasjon i spesifisitet, sensitivitet, interference av kjemiske forurensninger, effektiv lineære område og stabilitet av endepunkt analytten. I tillegg andre viktige faktorer som påvirker valg av analysen er hurtighet, brukervennlighet og tilgang til relativt spesialisert utstyr som en høy-ytelse væskekromatografi (HPLC) apparat.
Her presenterer vi en enkel og meget spesifikk kolorimetrisk mikro assay for bestemmelse av intracellulær askorbat i dyrkede celler, så vel som en separat analyse for bestemmelse av askorbat-utstrømning fra dyrkede celler. Den sistnevnte analysen tar sikte på å omgå problemet med undervurdering av askorbat utgivelse fra celler på grunn av rask re-opptak av utgitt askorbat av natrium-avhengige askorbat transportører (SVCTs). Selv om begge disse metodene har dukket opp i noen av våre tidligere publikasjoner 19,20,32,37,38, gir dette manuskriptet en eksplisitt instruks og retningslinjer for deres effektiv gjennomføring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Bestem Intracellulær Askorbat i dyrkede celler
- Cellekultur og høsting
- Grow suspensjon (f.eks menneskelig erythroleukemia, K562) eller heftende celler (f.eks primærastrocytes) ved hjelp av standard kultur prosedyrer 19-21,32,38. Merk: For å sikre at celler inneholder askorbat, legger dyrkede celler med askorbat enten som askorbat eller DHA 33,39.
- Lag en askorbat holdige celleekstrakt
- Inkuber et passende antall av fosfat-bufret saltvann (PBS), vasket suspensjon eller adherente celler med 450 ul iskald Cell Permeabilization Buffer [CPB; 0,1% (w / v) saponin i PBS; 4 ° C]. Merk: Bestem antall celler som kreves for å oppnå en absorbans verdi innenfor det lineære området av analysen (se nedenfor) empirisk av sluttbrukeren. Merk: vevsekstrakter kan også benyttes (se diskusjon for ytterligere detaljer).
- Agitate celler på is i 10 min for å sikre grundig cellulær lyse.
- Opprett en klaret askorbat holdig intracellulær ekstrakt ved å fjerne cellerester ved sentrifugering av det urene lysat ved 16.000 x g i 5 min i en mikrosentrifuge i kjøleskap (4 ° C).
- Fjern forsiktig 4 x 100 mL alikvoter av hver prøve, og legge til en horisontal sekvens av brønner i en 96-brønners flatbunnplate som inneholder enten 25 ul / brønn av PBS ("-ao") eller bare 25 ul / brønn av 45,5 U / ml stamoppløsning av L-askorbat-oksydase (AO) i PBS ("+ AO"). Merk: Dette bør gjøres parallelt med utarbeidelse av standarder (se nedenfor).
- Askorbat standard-kurve konstruksjon (må bygges på ny for hver analyse)
- Tilbered en stamløsning av 10 mM askorbinsyre i iskald PBS. Merk: Kontroller konsentrasjonen av askorbat spektrofotometrisk ved hjelp av en kvartskuvette med encm banelengde på 265 nm (ekstinksjonskoeffisient = 14,5 mM -1 cm -1) 40.
- Klargjør et serie av askorbat-standarder mellom 0 og 20 uM.
- Parallelt med trinn 1.2.4, fjern forsiktig 4 x 100 mL alikvoter av hver standard og tilsett til en horisontal sekvens av brønner i en 96-brønners flatbunnplate som inneholder 25 ul / brønn av PBS ("AO-") eller en 45,5 U / ml stamløsning av AO i PBS ("+ AO"). Merk: 100 ul av de ovenfor askorbat standarder vil inneholde 0-2 nmol av askorbat. Vær oppmerksom på at formålet med AO er å kontrollere for bidraget av ikke-askorbat reduksjons å ferricyanide reduksjon.
- Bestem intracellulær askorbat - Trinn 1: selektivt fjerne askorbat og kvantitativt oksidere askorbat med ferricyanide
- Transorbitalt blande den 96-brønns plate ved 550 rpm ved romtemperatur i 5 min i mørke ved å dekke platen i folie. Merk: Thans skritt bør oksidere alle askorbat i "+ AO" brønner til DHA. De "-AO" brønner bør være upåvirket.
- Tilsett 50 pl av 3,5 mM kalium-ferricyanid (heri referert til som "ferricyanide") i PBS til alle brønnene. Den endelige [ferricyanide] = 1 mM. Merk: Bruk en multipipettor.
- Transorbitalt blande plate ved 550 rpm ved romtemperatur i ytterligere 5 min i mørke. Merk: Dette trinnet bør resultere i reduksjon av ferricyanid til ferrocyanid med askorbat i et støkiometrisk forhold mellom to molekyler av ferricyanide redusert per ett molekyl av askorbat oksydert.
- Tilsett umiddelbart 25 pl av en nylig konstruert oppløsning inneholdende 50% (v / v) eddiksyre og 30% (vekt / volum) trikloreddiksyre (TCA). Merk: Bruk en multipipettor.
- Bestem intracellulær askorbat - Trinn 2: kvantifisere mengden av ferrocyanid dannes 37
- Legg 100 mL av ferrocyanid besluttsomhet løsning 37 til eACH godt. Merk: En arbeidsoppløsning bør gjøres umiddelbart før bruk: 2 ml av 3 M Na-acetat (pH 6,0); 0,5 ml iseddik (~ 17,4 M eddiksyre); 2 ml av 0,2 M sitronsyre; 2 ml av 3,3 mM FeCl 3 i 0,1 M eddiksyre; 1 ml 30 mM ferene-S. Det endelige volum på denne arbeidsoppløsning bør være 7,5 ml.
- Transorbitalt bland platen i mørke ved 550 rpm i 30 min ved romtemperatur.
- Les absorbansen verdier av brønnene ved 593 nm (dvs. den maksimale absorbans av Fe (II) (ferene-S) 3-kompleks).
- Beregne mengden av intracellulær askorbat som nmole askorbat per million celler ved først å trekke en 593 nm verdier for '+ AO' brønner fra de tilsvarende '- AO' brønner for hver prøve, og deretter interpolere fra askorbat standardkurve (se trinn 1.3 ). Ved bygging av de standardkurven, plottet på "differanseverdi" for hver standard mot mengden ascorbspiste per brønn.
2. Fastsettelse av askorbat-utstrømming fra dyrkede celler
- Cellekultur og høsting
- Grow suspensjon eller heftende celler som ovenfor (se trinn 1.1). Merk: utføre under analysen i en 24-brønns plat format med suspensjon og heftende celler for best resultat.
- Resuspender suspensjonsceller, eller overlappe adherente celler, med 400 pl av forvarmet HEPES-bufret saltoppløsning, med eller uten kalsium og magnesium, og inneholdende 5 mM D-glukose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) i brønner av en 24-brønns plate. Til det samme volum av HBS / D til angitte cellefrie brønner på hver 24-brønns plate for å undersøkes. Merk: de sistnevnte vil tjene som celle-frie kontroller for den opprinnelige reaksjon (se nedenfor).
Tre. Bestem Mengde Askorbat Utgitt
- Følgende stamløsninger bør være forberedt på forhånd: 120U / ml AO i HBS / D (forberede frisk); 2,4 mM Ferene-S i HBS / D; 120 mikrometer FeCl 3 og 600 mikrometer Na-citrat i HBS / D (forberede umiddelbart fra mer konsentrerte stamløsninger).
- For å starte ferrireduction reaksjon (sluttvolum per brønn bør være 600 mL), legger du til følgende volumer av reagenser til individuelle brønner som allerede inneholder 400 mL av HBS / D:
- Tilsett 50 pl av AO (120 U / ml) eller HBS / D for å sammenkoblet brønner i triplikat. Den endelige AO nivået bør være 10 U / ml. Merk: Etikett paret brønner som "- AO" og "+ AO".
- Bland platene med forsiktig orbital miksing i 5 min ved 37 ° C.
- Tilsett 50 pl av 2,4 mM ferene-S til alle brønnene. Den endelige ferene-S konsentrasjon bør være 200 mikrometer. Bland platene som ovenfor i 5 min ved 37 ° C.
- Tilsett 50 mL av nylaget 120 mikrometer Ferric citrate. Den endelige jern og citrat konsentrasjoner bør være 10 uM jern og 50 mM sitrat. Bland godt.
- I tre tredoble kontrollbrønner, aspirer liggende medium og tilsett 600 mL HBS / D som inneholder 0,1% saponin. Merk: De skal tjene som "100% celle-lysis" kontroller for en laktat dehydrogenase (LDH) slipper assay bli utført i parallell (se nedenfor).
- Inkuber i 60 minutter i mørke ved 37 ° C.
- Ved slutten av askorbat-effluks-assay, raskt suge 500 ul fra hver brønn, og legg til hensiktsmessig merket brønner i en 24-brønns plate. NB: For oppheng celler, først fjernes cellene ved sentrifugering ved 4 ° C.
- Tilsett 300 ul alikvoter av supernatanten til en 96-brønn plate og leses ved 593 nm.
4. Fastsettelse av Ekstracellulær Askorbat
- Les absorbansen verdier av brønnene ved 593 nm.
- Beregn mengden av ekstracellulært askorbat som nmole askorbat per mg protein (eller per million celler) som beskrevet for bestemmelse av intracellulær askorbati trinn 1.5.4. Merk: sluttbrukeren skal optimalisere forholdene slik at askorbat utgivelsen ikke er begrenset av intracellulær askorbat.
5. Fastsettelse av LDH Utgivelses
- Med de gjenværende 200 pl av ekstracellulær løsning fra hver prøve gjennomføre en LDH frigjøring assay 32,41 for å bestemme graden av cellelysering. Merk: regne som en% av total frigjør LDH. Bestem frigjør LDH fra prøvene som ble behandlet med 0,1% saponin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fastsettelse av intracellulær Askorbat i dyrkede Suspension Cells
I den første analyse (fig. 1), er intracellulær askorbat bestemt, følgende askorbat-spesifikk (dvs. AO-sensitive) reduksjon av ferricyanid til ferrocyanid, ved hjelp av meget følsom bestemmelse av ferrocyanid med et tidligere publiserte prosedyre 37.. Påvisning av askorbat er basert på den kolorimetriske chelatering av jern jern som er generert av askorbat-avhengige reduksjon av ferricyanid til ferrocyanid, etterfulgt av reduksjon av treverdig jern til jern ved ferrocyanid. Som suprafysiologiske konsentrasjoner av enkelte toverdige metallioner (f.eks Cu 2 +, Co 2 + og Zn 2 +) kan forstyrre, formodentlig ved å konkurrere med jern jern for chelation av ferene-S, bør passende forholdsregler tas under slike forhold 37.
Figur2 viser en typisk standardkurve for et sett av askorbat-standarder 0-20 uM (eller 0-2 nmol askorbat per brønn av 96-brønns plate, se trinn 6.5 i "Protocol".). Selv om det ikke er vist på denne figur, er lineariteten opprettholdes opp til 8 nmol askorbat per brønn (det vil si et nett A 593 nm på ~ 1.6), som tilsvarer en prøve askorbat konsentrasjon på ~ 80 uM. Analysen kan bli brukt for å kunne detektere askorbat nivåer under 0,25 nmol askorbat per brønn (2,5 pM prøven askorbat konsentrasjon).
K562 celler raskt akkumuleres intracellulært askorbat fra ekstracellulært DHA, men ikke askorbat (se figur 3, gjengitt med tillatelse fra Lane og Lawen 2008 19). I denne representativt eksperiment ble PBS-vaskede K562-celler (4 x 10 6 celler / ml) inkubert i PBS med 500 pM av enten askorbat (Asc), DHA, DHA + 50 uM cytokalasin B (DHA + CB), Asc + 5 mM ferricyanide (Asc / FIC) eller Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) i 30 min ved 37 ° C. Intracellulær askorbat ble bestemt som beskrevet i "Protocol".
DHA opptak av K562 celler skjer ved facilitative glukose transportør (GLUT)-mediert transport (se figur 4, gjengitt med tillatelse fra Lane og Lawen 2009 42). For å vurdere involvering av gluts i DHA opptak i denne representativt eksperiment ble K562-celler ble inkubert med økende konsentrasjoner av cytokalasin B (TB) eller dihydrocytochalasin B (H 2-CB) oppløst i MBS inneholdende 0,5% etanol i 15 min ved 37 ° C før inkubasjon med 400 uM DHA i 30 min ved 37 ° C i det samme medium (Fig. 4A). Cellene ble så vasket tre ganger i 100 volumer av iskald MBS og deres intracellulære askorbat bestemt som beskrevet i "Protocol". Det er viktig å merke seg mens både CB og H 2 CB hemme bevegelige prosesser på mikromolarkonsentrasjoner (1-100 uM), kun CB, som er forskjellig fra H 2 CB ved nærvær av én dobbeltbinding, hemmer GLUT-avhengige transport ved lave mikromolare konsentrasjoner (1-10 uM) 43.. Derfor, som DHA opptaket var inhiberbare av CB med en IC 50 <2,5 mikrometer, men var ikke inhiberbare av H 2 CB, DHA opptak skjer sannsynligvis ved GLUT-mediert transport 38. Alternativt, i figur 4B, ble det vaskede celler eksponert for økende konsentrasjoner av glut-transportable, men ikke-metaboliserbare glukose analoge 3 - O-metyl-D-glukose (3-OMG) eller den ikke-GLUT-transportable glukose stereoisomer L - glukose før inkubasjon med DHA som i panel A. Igjen indikerer resultatene GLUT engasjement i DHA import som inhibering av intracellulære askorbat akkumulering skjer bare i nærvær av glut-transportable glukose analog.
Detersjon av askorbat-utstrømning fra heftende celler
I den andre analysen, kan hastigheten av askorbat-utstrømning fra dyrkede celler bestemmes. Denne spesifikke analysen er viktig som utgivelsen av askorbat fra cellene ser ut til å være avgjørende for askorbat regulerte cellulære opptaket av ikke-transferrin-bundet jern av celler 19,20. Opptaket av ikke-transferrin-bundet jern er ansett å være relevant til patofysiologien av jern-overbelastningssykdommer slik som hemochromatoses 22, så vel som å astrocyte-neuron jern utveksling og homeostase i pattedyrhjernen 22.. Faktisk har vi nylig vist at de store eksitatoriske nevrotransmitter, L-glutamat, utløser frigjøring av askorbat fra astrocytter på en måte som er avhengig av L-glutamat opptak av GLAST og påfølgende cellulær hevelse som utløser frigjøring av askorbat av antatte VSOACs 32. I analogi, askorbat release fra askorbat-lastet astrocytter kan stimuleres ved eksitatoriske aminosyre, L-aspartat, men ikke den ikke-eksitatorisk aminosyre-L-glutamin. Denne effekten er vist i figur 5 (gjengitt med tillatelse fra Lane og Lawen 2012 32), som viser dose-responskurvene for stimulering av askorbat (AA) frigjøring av aspartat (fylte sirkler) og glutamin (åpne sirkler) fra primærkulturer askorbat belastede muse astrocytter.
Det er viktig å diskutere hvordan dette askorbat-effluks assay er forskjellig fra analysen tilgjengelig for bestemmelse av intracellulær askorbat. Hovedforskjellen ligger i det faktum at nivået av askorbat som er igjen i løsningen ikke bestemmes av en kjemisk reaksjon utført ved slutten av et gitt tidspunkt, slik tilfellet er for den intracellulære askorbat bestemmelsesmetode. I stedet er en "reduktiv signatur" akkumulerti løpet av perioden hvor askorbat frigjøres fra celler. Denne reduktive signaturen registreres i form av en askorbat-avhengige reduksjon av ekstracellulære ferri-citrat, etterfulgt av en rask chelatering av jern jern som et stort ekstracellulært og membran-impermeant [Fe (II) (ferene-S) 3] 4 - chelat . Ferene-S kan betraktes som tilsvarende membran-impermeant løpet av den korte tid løpet av analysen. Nivåene av denne kromogent komplekset kan deretter bli bestemt som et endepunkt måling. Ettersom kun de AO-sensitive nivåer av dette chelat er bestemt, gir analysen en høy grad av spesifisitet for bestemmelse av ekstracellulære L-askorbat.
Figur 1. Flytdiagram som viser de viktigste trinnene i protokollen forbestemmelse av intracellulær askorbat.
Figur 2 En typisk standardkurve for et sett av askorbat standarder 0-20 mikrometer.. (Eller 0-2 nmol askorbat per brønn av 96-brønns plate;. Se trinn 6.5 i "Protocol") Feilfelt er ikke vist som de er innenfor området som opptas av symboler.
Fig. 3. K562 celler raskt akkumuleres intracellulært askorbat fra ekstracellulære DHA, men ikke askorbat. PBS-vaskede K562-celler (4 x 10 6 celler / ml) ble inkubert i PBS med 500 uM of enten askorbat (Asc), DHA, DHA + 50 uM cytokalasin B (DHA + CB), Asc + 5 mM ferricyanide (Asc / FIC) eller Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) i 30 min ved 37 ° C. Intracellulær askorbat ble bestemt som beskrevet i "Protocol". De viste resultater hjelp av tre individuelle eksperimenter (+ SD). * Den intracellulære askorbat konsentrasjonen ble beregnet ved hjelp av en forhåndsbestemt intracellulært vann plass til K562 celler (dvs. ~ 1,6 μl/106 celler) 19,20. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Lane og Lawen 2008 19.
Figur 4. DHA opptak av K562 celler skjer ved facilitative glukose transportør (GLUT)-mediert transport. K562 celler som hadde blitt dyrket til 6-8 × 10 6 celler / ml i RPMI + 10% (v / v) føtalt bovint serum ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luft ble først vasket tre ganger med MBS. Vaskede celler ble deretter eksponert for økende konsentrasjoner av cytokalasin B (TB, Sigma) eller dihydrocytochalasin B (H 2-CB) oppløst i Mops-bufret saltvann (MBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na +, pH 7.3 ) inneholdende 0,5% etanol før inkubasjon med 400 uM DHA i 30 min ved 37 ° C (A). Cellene ble så vasket tre ganger i 100 volumer av kald MBS og deres intracellulære askorbat bestemt som beskrevet i "Protocol". Som DHA-opptaket var inhiberbare av CB, men ikke H 2-CB, oppstår DHA opptak av GLUT-mediert transport. Alternativt, i (B), ble det vaskede celler eksponert for økende konsentrasjoner av glut-transportable, men ikke-metaboliserbare glukose analoge 3 - O-metyl-D-glukose (3-OMG) eller den ikke-GLUT-transportable glukose stereoisomer (A). Igjen tyder resultatene på GLUT engasjement i DHA opptak. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Lane og Lawen 2008 42.
Figur 5. Askorbat frigjøring fra askorbat belastede astrocytter stimuleres av eksitatorisk aminosyre-L-aspartat, men ikke den ikke-eksitatorisk aminosyre-L-glutamin. Denne figuren viser dose-responskurvene for stimulering av askorbat (AA) frigjøring av aspartat (lukkede sirkler) og glutamin (åpne sirkler) fra primærkulturer av askorbat belastede muse astrocytter. De viste data er middel (± SD) av tre eksperimenter. P <0,001 vsden "basal" tilstand. Dette tallet har blitt gjengitt med tillatelse fra Lane og Lawen 2012 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi to raske, konkrete og relativt sensitive kolorimetriske mikro analyser for bestemmelse av askorbat avledet fra intra-og ekstracellulære avdelinger i dyrkede celler. Analysene kan gjennomføres med tilgang til standard laboratorieutstyr og reagenser. Den bare moderat kostbart reagens som kreves for analysen er AO, noe som er viktig fordi det gir en høy grad av analytt spesifisitet mot L-askorbat. Prøvene er godt egnet til enten suspensjon celler (f.eks K562) eller heftende celler (f.eks HepG2 eller primær gnager astrocytes), og har blitt ansatt i tidligere publikasjoner ved hjelp av slike celler 19,20,32,37,38. Bruk av andre askorbat oksidasjonsmidler (f.eks Tempol) i stedet for AO bør unngås fordi de ikke er tilstrekkelig spesifikke for L-askorbat. I tillegg er anvendelse av forbindelser som for eksempelTempol i askorbat-release-analysen vil bli forvirret av evnen til Tempol å krysse cellemembraner og oksidere intracellulær askorbat 44. AO er egentlig membran-impermeant over tid kurs som brukes.
Vi har utført en direkte sammenligning av resultatene som oppnås med den kolorimetriske askorbat-analysen beskrevet ovenfor, og fluorometrisk bestemmelse av askorbat Vislisel og kolleger 36. Vi har funnet at begge analysene ga identiske resultater for den intracellulære askorbat bestemmelse analyse (data ikke vist). Det er interessant at askorbat-release-analysen beskrevet ovenfor ga vesentlig høyere verdier for den tilsynelatende hastighet på askorbat dyseutstrømningen enn ved den fluorometriske analysen endepunkt. Dette tyder på at askorbat-effluks-assay som er beskrevet her gjør det mulig for bestemmelse av tilsynelatende "askorbat-utstrømning" som ikke er så lett vist av sannsynligheten for askorbat re-opptak i cellene; en prosess som trolig innebærer plAsma membran SVCTs. Slike reopptak ville tendens til å forårsake undervurdering av de faktiske nivåene av askorbat som ble utgitt i løpet av en gitt periode hvis et endepunkt askorbat målingen ble tatt. Det bør bemerkes at hvis vevsprøver (for eksempel muskel-, lunge eller hjerne) skal brukes i stedet for dyrkede celler for den intracellulære askorbat bestemmelse assay, deretter en vev homogenat bør være konstruert ved hjelp av iskald CPB og noen form for mekanisk forstyrrelse ( f.eks Douce-homogenisering, probe-tip lydbehandling, fransk presse etc.). Cellular rusk bør fjernes ved sentrifugering og brukeren skal vurdere eventuelle behov for prøve deproteinisering og / eller tillegg av proteasehemmere før du fortsetter med trinn 1.2.4.
Vi har også rapportert at tidligere lave mikromolare konsentrasjoner av cytokalasin B (<10 pM) hemmet ikke den tilsynelatende hastighet på askorbat-effluks som ble bestemt ved analyse 32 19, 20,38.
Det er flere viktige skritt i disse protokollene. Først analysene som er beskrevet heri er kritisk på evnen til AO til selektivt og raskt fjerne askorbat i parede prøver. Hvis den spesifikke aktivitet for fremstilling av AO er vesentlig mindre enn den nominelle og antatt aktivitet, er det mulig at ikke alle av askorbat i AO-inneholdende samples vil bli fjernet. Dette kan føre til en undervurdering av den mengden askorbat i de ukjente prøvene hvis du bruker "direkte metoden" for å beregne mengden askorbat stede. Men hvis man bruker "standard-kurve metoden", som er anbefalt, lav aktivitet preparater av AO vil bare føre til et tap av assay-følsomhet. Vi har funnet at gode resultater er konsekvent oppnådd ved hjelp av preparater av AO konstruert ved å oppløse 1000 U av AO i 1 ml av enten PBS eller MBS, som så blir delt opp i 100 mL alikvoter som er lagret ved -80 ° C for ikke mer enn en måned. Videre, som AO er et protein som kan proteolytisk nedbrutt av cellelysater, protease-inhibitorer kan tilsettes til cellelysater før tilsetning av lysatene til AO-inneholdende brønner. Dette kan være en nyttig modifikasjon å vurdere når du bruker celle eller vev lysates som er rike på protease aktivitet.
Videre er følsomheten av analysene beskrevet enbove stor grad er avhengig av bruk av det kromogene bidentat Fe (II)-chelator, Ferene-S. Denne chelator kan erstattes av kjemisk lignende chelatorer slik som Ferrozine og bathophenanthroline disulfonat, men med en reduksjon i følsomhet tilsvarende den ekstinksjonskoeffisient av deres Fe (II) chelates 37.. Videre bør det utvises forsiktighet ved bruk bathophenanthroline disulfonat, som det ser ut til å føre til høyere priser for tilsynelatende autokatalytisk ferrireduction i nærvær av jern citrate komplekser enn Ferene-S eller Ferrozine 37,45. Dette er et aktuelt problem i tilfelle av askorbat-release-analysen som ikke-askorbat-avhengige utseende av Fe (II)-chelat vil redusere sensitiviteten til analysen.
Mens den intracellulære askorbat-bestemmelse assay er kompatibel med adherente celler, bør løsgjøring av slike celler før cellelysering utføres ved mekanisk skraping i stedet for trypsin / EDTA. Som trypsin er en proteasedet trolig vil påvirke negativt med askorbat-uttømming takt med AO, sistnevnte som er et protein. I tillegg vil EDTA sannsynligvis påvirke FOC bestemmelsestrinnet ved å chelatere jern i konkurranse med ferene-S 37. Slike midler bør unngås. Til slutt, askorbat utløser assay kan lett tilpasses for opphengningsceller. I stedet for å aspirere av det overliggende Fe (II) (ferene-S) 3-holdige chelat ved slutten av forsøket, cellene skal være raskt sedimenteres ved sentrifugering som for det intracellulære askorbat-bestemmelse assay. Absorbansen ved 593 nm av den overliggende væske bør deretter bli bestemt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Dr Stephen Robinson og Ms Hania Czerwinska (Monash University) for den generøse tilbudet av astrocyte kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
References
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
- Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
- Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
- Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
- Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
- Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
- Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
- Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
- Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
- Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
- Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
- Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
- May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
- Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
- Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
- Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
- Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
- Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
- Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
- Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
- Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
- Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
- Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
- Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
- Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
- Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
- Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
- Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
- Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
- Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
- May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
- Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).
