Summary
Askorbat spelar flera viktiga roller i cellernas ämnesomsättning, av vilka många har bara kommit i dagen under de senaste åren. Här beskriver vi ett medel genomströmning, specifik och billig mikroanalys för bestämning av både intra-och extracellulära askorbat i cellkultur.
Abstract
C-vitamin (askorbat) spelar flera viktiga roller i cellulär metabolism, varav många har bara framkommit under de senaste åren. Till exempel, i hjärnan, verkar askorbat i en nervskyddande och neuromodulatory sätt som innebär askorbat cykling mellan nervceller och vicinala astrocyter - ett förhållande som tycks vara avgörande för hjärnans askorbat homeostas. Dessutom tyder nya uppgifter tyder starkt på att askorbat har en kraftigt utökad roll i regleringen av cellulära och systemisk järn metabolism än är klassiskt erkänt. Den ökande erkännande av väsentlig roll för askorbat i normal och avreglerad cell-och organismfysiologi kräver en rad medel genomströmning och högkänsliga analytiska tekniker som kan utföras utan behov av mycket dyr specialutrustning. Här ger vi tydliga instruktioner för en medel genomströmning, specifik och relativt billig mikroanalys för bestämning av both intra-och extracellulära askorbat i cellkultur.
Introduction
Upptäckten av den kemiska karaktären av askorbinsyra (vitamin C), och dess identifiering som den långsökta "anti-scorbutic faktorn", av Albert Szent-Györgyi och andra i artiklar publicerade 1928-1934 1 var banbrytande händelser i historien i biokemi. Faktum är att dessa upptäckter har bidragit till Szent-Györgyi tilldelas Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1937. Den ständigt växande svit av roller för askorbat i djur-och växtfysiologi, samt människors hälsa, fortsätter att vara föremål för aktiv vetenskaplig utredning och kontroverser.
-L-askorbat är en riklig fysiologisk reduktant och enzym kofaktor i däggdjurssystem, och bidrar till att ett stort antal väl definierade enzymatiska reaktioner innefattande kollagen hydroxylering, karnitin och norepinefrin biosyntes, tyrosin metabolism och peptidhormon amidering 2. Intriguingly montering evidence föreslår att askorbat spelar en roll för att stimulera andra järnberoende dioxygenases, såsom prolyl och asparaginyl hydroxylaser inblandade i hydroxylering och inriktning av hypoxi-inducerbara faktorer (HIFS) 1α och 2α 3. En färsk rapport visar att askorbat spelar en roll i T-cellsmognad genom att påverka kromatin demetylering via sin verksamhet för att stimulera de nukleära hydroxylaser, Jumonji C (JmjC) domän proteiner; den senare som verkar kräva askorbat för full aktivitet 4. I själva verket verkar det stimulering av sådana enzymer genom askorbat att ske genom en liknande mekanism för stimulering av askorbat av HIF och kollagen hydroxylaser. Bland andra klassiska effekter bidrar askorbat avsevärt till cellulär antioxidationsmedel såsom en vattenlöslig kedja brytande radikaler 5 och till återvinningen av plasmamembranet α-tokoferol (vitamin E) via reduktion av α-tocopheroxyl radikal 6, vhich är viktigt i skydd mot membranet lipidperoxidation 7. Viktigt är att även om de flesta däggdjur är i stånd att de novo hepatisk syntes av askorbat från D-glukos, högre primater, marsvin och vissa fladdermöss bero på kostkällor av vitamin 8. Detta på grund av inaktivering av gulo genen, ortologer varav i opåverkade däggdjur kodar enzymet, γ-gulono-lakton oxidas 9-13. Detta enzym som erfordras för den slutliga reaktions i askorbat biosyntes från glukos 13.
Efter transportör-medierad absorption från tarmlumen hos människor, är askorbat distribueras i hela kroppen genom cirkulationssystemet. Vitaminet är normalt återfinns i sin reducerade form vid millimolära koncentrationer intracellulärt (med det anmärkningsvärda undantaget av erytrocyter där koncentrationerna är oftast liknar den rådande plasmakoncentration), och vid mikromolära koncentrations (t.ex. 50-200 ^ M) i de flesta extracellulära vätskor 14,15.
Under fysiologiska betingelser, askorbat undergår typiskt en reversibel en-elektron oxidation till askorbyl friradikal (AFR, även känd som monodehydroascorbate eller semidehydroascorbate). Medan AFR är en relativt stabil radikal 16, i avsaknad av dess snabba en-elektron enzymatisk reduktion tillbaka till askorbat, kan två AFRs ytterligare dismutate till ett askorbat och en dehydroascorbate (DHA) 9,13,17. Inom det inre av cellen, den två-elektron oxidationsprodukten av askorbat, DHA, kan minskas snabbt tillbaka till askorbat genom glutation-och NAD (P) H beroende enzymatiska och icke-enzymatiska reaktioner 13.
Även om det är klassiskt accepterat att askorbat enda betydande roll i omsättningen av järn är att stimulera kosten absorptionen av icke-heme järn 18, har vi och andra fram bevis för strongly antyder att askorbat spelar en kraftigt utökad roll i metabolismen av denna metall. Först, askorbat som frigörs genom att askorbat-fylld celler verkar spela en viktig roll i att modulera upptaget av icke-transferrin-bundet järn av celler 19,20, och mycket färska uppgifter visar att askorbat modulerar också upptaget av transferrin-bundet järn av celler 21, den senare som motsvarar en stor fysiologisk järnupptag väg 22.
Askorbat är viktigt för normal centrala nervsystemet hos däggdjur 23,24. Tillsammans med binjurebarken, hypofysen, bräss, näthinnan och gula kroppen, innehåller hjärnan höga koncentrationer av askorbat i förhållande till andra kroppsvävnader 23,25-27. Dessutom är exponering av både astrocyter 28,29 och neuron-liknande celler 30 till glutamat kända för att utlösa frisättningen av askorbat i det extracellulära utrymmet där askorbate är tänkt att hjälpa till att skydda nervceller mot glutamat-inducerad neuronal dysfunktion 31. Även om den exakta mekanismen för glutamat-inducerad askorbat frisättning från astrocyter är okänd, har vi nyligen lagt fram bevis som indikerar inblandning av cell svullnad orsakad av glutamat upptag av astrocyternas glutamat-och aspartat transportör (GLAST, även känd excitatoriska aminosyratransportör isoform 1 [EAAT1 ] hos människor) och därmed aktivering av volymkänsliga osmolytiska och anjon-kanaler (VSOACs) som är genomsläppliga för mindre organiska anjoner såsom askorbat 32. De molekylära identiteter av plasmamembranet ledningarna involverade i VSOAC bildning återstår att identifieras 33,34.
Även om många analyser har utvecklats för bestämning av askorbat i biologiska prover, som omfattar spektrofotometriska, fluorometriska och kromatografiska analyser 35,36, det finns mycket variation i specificitet, sensitivitet, interference av kemiska föroreningar, effektiva linjära området och stabiliteten i endpoint analyt. Dessutom kan andra viktiga faktorer som påverkar valet av analys är snabbhet, enkel användning och tillgång till relativt specialiserad utrustning, såsom en högpresterande vätskekromatografi-apparat (HPLC).
Här presenterar vi en enkel och starkt specifik kolorimetrisk mikroplattanalys för bestämning av intracellulär askorbat i odlade celler, såväl som en separat analys för bestämning av askorbat-efflux från odlade celler. Den senare analysen syftar till att kringgå problemet med underskattning av askorbat frisättning från celler på grund av snabb återupptagning av frisatt askorbat av natriumberoende askorbat transportörer (SVCTs). Även om båda dessa metoder har dykt upp i några av våra tidigare publikationer 19,20,32,37,38, ger detta manuskript en tydlig uppsättning av instruktioner och riktlinjer för ett effektivt genomförande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bestäm Intracellulär Askorbat i odlade celler
- Cellodling och skörd
- Väx suspension (t.ex. mänsklig erytroleukemi, K562) eller vidhäftande celler (t.ex. primära astrocyter) med standardodlingsförfaranden 19-21,32,38. Observera: att se till celler innehåller askorbat, ladda odlade celler med askorbat antingen som askorbat eller DHA 33,39.
- Skapa ett askorbat innehållande cellextrakt
- Inkubera ett lämpligt antal av fosfat saltlösning (PBS)-tvättad suspension eller vidhäftande celler med 450 l av iskall cell Permeabilization Buffer [CPB; 0,1% (vikt / vol) saponin i PBS; 4 ° C]. Anm: Bestäm antalet celler som krävs för att erhålla ett absorptionsvärde inom det linjära intervallet av analysen (se nedan) empiriskt av slutanvändaren. OBS: vävnadsextrakt kan också användas (se Diskussion för ytterligare information).
- Agitate cellerna på is under 10 min för att säkerställa grundlig cellulär lys.
- Skapa en klarnad askorbat-innehållande intracellulära extrakt genom avlägsnande av cellrester genom centrifugering av det råa lysatet vid 16.000 x g under 5 min i en kyld mikrocentrifug (4 ° C).
- Avlägsna försiktigt 4 x 100 l alikvoter från varje prov och lägga till en horisontell sekvens av brunnar i en 96-brunnars flatbottnad platta som innehåller antingen 25 | il / brunn av PBS ("-AO") enbart eller 25 ^ il / brunn av 45,5 U / ml stamlösning av L-askorbat-oxidas (AO) i PBS ("+ AO"). OBS: Detta bör göras parallellt med utarbetandet av standarderna (se nedan).
- Askorbat standardkurva konstruktion (måste byggas på nytt för varje analys)
- Bered en förrådslösning av 10 mM askorbinsyra i iskall PBS. Notera: Kontrollera koncentrationen av askorbat spektrofotometriskt med hjälp av en kvartskuvett med en 1cm väg-längd på 265 nm (extinktionskoefficient = 14,5 mM -1 cm -1) 40.
- Noggrant förbereda en serie av askorbat standard mellan 0 och 20 mikroM.
- Parallellt med steg 1.2.4, avlägsna försiktigt 4 × 100 | il alikvoter av varje standard och lägga till en horisontell sekvens av brunnar i en 96-brunnars flatbottnad platta som innehåller 25 | il / brunn av PBS ("-AO") eller en 45,5 U / ml stamlösning av AO i PBS ("+ AO"). OBS: 100 pl av ovanstående askorbat standarderna kommer att innehålla 0-2 nmol av askorbat. Observera, är syftet med AO att styra för bidraget från icke-askorbat reduktions att ferricyanid minskning.
- Bestäm intracellulär askorbat - Steg 1: selektivt avlägsna askorbat och kvantitativt oxidera askorbat med ferricyanid
- Orbitalt blanda 96-brunnsplatta vid 550 rpm vid rumstemperatur under 5 minuter i mörker, genom att täcka plattan i folie. Obs: Thans steg ska oxidera alla askorbat i "+ AO" brunnar till DHA. De "-AO" brunnar bör vara opåverkade.
- Lägg 50 pl 3,5 mM kaliumferricyanid (nedan kallade "ferricyanid") i PBS till alla brunnar. Den slutliga [ferricyanid] = 1 mM. OBS: Använd en multipipettor.
- Orbitalt blanda plattan vid 550 rpm vid rumstemperatur i ytterligare 5 minuter i mörker. OBS: Detta steg bör resultera i minskad ferricyanid till ferrocyanid av askorbat i ett stökiometriskt förhållande av 2 molekyler ferricyanid minskade per 1 molekyl av askorbat oxiderat.
- Tillsätt omedelbart 25 | il av en nyligen konstruerad lösning innehållande 50% (volym / volym) ättiksyra och 30% (vikt / volym) triklorättiksyra (TCA). OBS: Använd en multipipettor.
- Bestäm intracellulär askorbat - Steg 2: kvantifiera mängden ferrocyanid som bildas 37
- Tillsätt 100 l av ferrocyanid beslutsamhet lösning 37 till eACH väl. Anm: En fungerande lösning bör göras omedelbart före användning: 2 ml 3 M Na-acetat (pH 6,0); 0,5 ml isättika (~ 17,4 M ättiksyra); 2 ml av 0,2 M citronsyra; 2 ml av 3,3 mM FeCl 3 i 0,1 M ättiksyra; 1 ml av 30 mM ferene-S. Den slutliga volymen av denna arbetslösning bör vara 7,5 ml.
- Orbitalt blanda plattan i mörker vid 550 rpm under 30 min vid rumstemperatur.
- Läs absorbansvärdena för brunnarna vid 593 nm (dvs. maximal absorbans av Fe (II) (ferene-S)-3-komplex).
- Beräkna mängden intracellulär askorbat som nmol askorbat per miljon celler genom att först subtrahera A 593 nm värden för '+ AO-brunnar från motsvarande' - AO-brunnar för varje prov och sedan interpolera från askorbat standardkurvan (se steg 1.3 ). Vid konstruktion av standardkurvan, rita denna "skillnad värde" för varje standard mot mängden ascorbåt per brunn.
2. Fastställande av askorbat-utflöde från odlade celler
- Cellodling och skörd
- Väx suspension eller vidhäftande celler som ovan (se steg 1.1). Obs: utföra nedan analysen i ett 24-bra plat-format med fjädring och vidhäftande celler för bästa resultat.
- Resuspendera suspensionsceller och överlagra adherenta celler, med 400 | il förvärmd HEPES-buffrad saltlösning, med eller utan kalcium och magnesium, och som innehåller 5 mM D-glukos (HUT / D; pH 7,3, 37 ° C) i brunnarna av en 24-brunnsplatta. Tillsätt samma volym av HBS / D för att angivna cellfria brunnar på varje platta med 24 brunnar som skall undersökas. Notera: det senare kommer att tjäna som cellfria kontroller för baslinjen reaktionen (se nedan).
3. Bestäm mängden Askorbat Släpp
- Följande stamlösningar bör förberedas i förväg: 120U / ml AO i HBS / D (förbereda färska); 2,4 mM Ferene-S, i HBS / D; 120 ^ M FeCl3 och 600 ^ M Na-citrat i HBS / D (förbereda omedelbart från mer koncentrerade stamlösningar).
- För att starta ferrireduction reaktion (slutlig volym per brunn bör vara 600 l), lägg till följande volymer av reagenser till enskilda brunnar som redan innehåller 400 l av HBS / D:
- Lägg 50 pl AO (120 U / ml) eller HBS / D för att paras brunnar i tre exemplar. Den slutliga AO koncentrationen bör vara 10 U / ml. OBS: Etikett parade brunnar som "- AO" och "+ AO".
- Blanda plattorna med mild orbital blandning under 5 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 50 | il av 2,4 mM ferene-S till alla brunnar. Den slutliga ferene-S-koncentrationen bör vara 200 pM. Blanda plattorna som ovan under 5 minuter vid 37 ° C.
- Lägg 50 pl nygjord 120 mikroM järncitrat. Den slutliga järn och citrat koncentrationer bör vara 10 ^ M järn och 50 ^ M citrat. Blanda väl.
- I tre tredubbla kontrollbrunnar, aspirera liggande mediet och till 600 pl HBS / D innehållande 0,1% saponin. OBS: Dessa kommer att fungera som "100% cell-lys" kontroller för en laktatdehydrogenas (LDH) frisättningsanalys skall genomföras parallellt (se nedan).
- Inkubera i 60 minuter i mörker vid 37 ° C.
- I slutet av askorbat-utflödesanalys, snabbt aspirera 500 l från varje brunn och lägg till lämpligt märkta brunnar i en 24-brunnar. Notera: för suspensionsceller, inledningsvis avlägsna cellerna genom centrifugering vid 4 ° C.
- Addera 300 pl alikvoter av supernatanten till en 96-brunnsplatta och därefter avlästes vid 593 nm.
4. Bestämning av Extracellulär Askorbat
- Läs absorbansvärdena för brunnarna vid 593 nm.
- Beräkna mängden extracellulär askorbat som nmol askorbat per mg protein (eller per miljon celler) såsom beskrivs för bestämning av intracellulär askorbati steg 1.5.4. OBS: slutanvändaren bör optimera förhållandena så att askorbat frigör inte begränsas av intracellulär askorbat.
5. Bestämning av LDH-frisättning
- Med de återstående 200 | il av den extracellulära lösningen från varje prov genomföra en LDH-frisättningsanalys 32,41 för att bestämma omfattningen av cellulär lys. Obs: räkna i% av total agbar LDH. Bestäm frigörbar LDH från proverna som behandlades med 0,1% saponin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestämning av intracellulära askorbat i odlade suspensionsceller
I den första analysen (figur 1), är intracellulär askorbat bestäms, efter askorbat specifika (dvs. AO känsliga) reduktion av ferricyanid till ferrocyanid, med hjälp av mycket känsliga bestämning av ferrocyanid från en tidigare publicerad procedur 37. Detekteringen av askorbat är baserat på den kolorimetriska kelatering av tvåvärt järn som genereras av askorbat beroende reduktion av ferricyanid till ferrocyanid, följt av reduktion av ferri-till ferrojärn av ferrocyanid. Som suprafysiologiska koncentrationer av vissa tvåvärda metalljoner (t.ex. Cu 2 +, Co 2 + och Zn 2 +) kan störa, förmodligen genom att konkurrera med järn järn för chela genom ferene-S bör lämpliga försiktighetsåtgärder skall vidtas under sådana förhållanden 37.
Figur2 visar en typisk standardkurva för en uppsättning av askorbat standarder 0-20 ^ M (eller 0-2 nmol askorbat per brunn i 96-brunnar, se steg 6.5 i "protokollet".). Fastän det inte visas i denna figur är linjäriteten bibehålls upp till 8 nmol askorbat per brunn (dvs. ett nät A 593 nm av ~ 1,6), vilket motsvarar ett prov askorbat koncentration av ~ 80 pM. Analysen kan användas för att framgångsrikt detektera askorbat-nivåer under 0,25 nmol askorbat per brunn (2,5 | iM prov askorbat koncentration).
K562 celler ansamlas snabbt intracellulär askorbat från extracellulärt DHA, men inte askorbat (se figur 3, återges med tillstånd från Lane och Lawen 2008 19). I detta representativa experiment PBS-tvättade K562-celler (fyra × 10 6 celler / ml) inkuberades i PBS med 500 | iM av antingen askorbat (Asc), DHA, DHA + 50 | iM cytokalasin B (DHA + CB), Asc + 5 mM ferricyanid (Afm / FIC) eller Asc + 50 E / ml AO (Asc / AO) i 30 min vid 37 ° C. Intracellulär askorbat bestämdes enligt beskrivningen i "protokollet".
DHA upptag av K562-celler sker genom underlättande glukostransportör (GLUT)-medierad transport (se figur 4, återges med tillstånd från Lane och Lawen 2009 42). För att bedöma den inblandning av gluts i DHA upptag i detta representativa experiment K562-celler inkuberades med ökande koncentrationer av cytokalasin B (CB) eller dihydrocytochalasin B (H 2 CB) upplöst i MBS innehållande 0,5% etanol under 15 min vid 37 ° C före inkubering med 400 ^ iM DHA i 30 min vid 37 ° C i samma medium (fig 4A). Cellerna tvättades sedan tre gånger i 100 liter av iskalla MBS och deras intracellulära askorbat bestäms enligt beskrivningen i "protokollet". Det är viktigt att notera medan både CB-och H-2 CB inhibera motila processerna vid mikromolärakoncentrationer (1-100 | iM), endast CB, som skiljer sig från H 2 CB genom närvaron av en enda dubbelbindning, inhiberar GLUT-beroende transport i låga mikromolära koncentrationer (1-10 | iM) 43. Därför, såsom DHA upptag var inhiberbara av CB med en IC 50 <2,5 | iM, men var inte inhiberas av H 2 CB, DHA upptag sker troligen genom GLUT-medierad transport 38. Alternativt kan, i figur 4B, tvättades cellerna exponeras för ökande koncentrationer av GLUT-transportabel, men icke-metaboliserbar glukos analoga 3 - O-metyl-D-glukos (3-OMG) eller den icke-GLUT-trans glukos stereoisomer L - glukos före inkubation med DHA som i panelen A. Återigen tyder resultaten GLUT engagemang i DHA import som hämning av intracellulär askorbat ackumulation förekommer endast i närvaro av GLUT-transglukos analog.
Bestämningtion av askorbat-Efflux från Vidhäftande Cells
I den andra analysen, kan hastigheten för askorbat-efflux från odlade celler bestämmas. Denna specifika analys är viktig eftersom frisättningen av askorbat från celler verkar vara avgörande för askorbat reglerade cellulärt upptag av icke-transferrin-bundet järn av celler 19,20. Upptaget av icke-transferrin-bundet järn anses vara relevant för patofysiologin vid järnöverbelastningssjukdomar såsom hemochromatoses 22, samt att astrocyternas-neuron järnutbyte och homeostas i däggdjurshjärnan 22. I själva verket har vi nyligen visat att den huvudsakliga excitatoriska neurotransmittorn, L-glutamat, utlöser frisättning av askorbat från astrocyter på ett sätt som beror på L-glutamat upptag av GLAST och efterföljande cellulär svullnad som utlöser frisättning av askorbat av förmodade VSOACs 32. I analogi, askorbat rFRISÄTTNING från askorbat belastade astrocyter kan stimuleras av den excitatoriska aminosyra, L-aspartat, men inte den icke-excitatoriska aminosyran L-glutamin. Denna effekt visas i fig. 5 (återges med tillstånd från Lane och Lawen 2012 32), som visar dos-responskurvor för stimulering av askorbat (AA)-frisättning genom aspartat (fyllda cirklar) och glutamin (öppna cirklar) från primära kulturer av askorbat belastade mus astrocyter.
Det är viktigt att diskutera hur denna askorbat-utflödesanalysen skiljer sig från analysen anges för bestämning av intracellulär askorbat. Den stora skillnaden ligger i det faktum att nivån av askorbat kvar i lösning inte bestäms genom en kemisk reaktion genomfördes vid slutet av en given tidpunkt, vilket är fallet för den intracellulära askorbat bestämningsmetoden. I stället är en "reduktiv signatur" ackumuleratunder den period då askorbat frisätts från cellerna. Denna reduktiva signaturen fångas i form av askorbat-beroende minskning av extracellulär ferricitrat följt av den snabba kelatering av tvåvärt järn som ett stort extracellulärt och membran-ogenomtränglig [Fe (II) (ferene-S) 3] 4 - kelat . Ferene-S kan betraktas på liknande membran-ogenomtränglig över kort tidsförlopp av analysen. Nivåerna av detta kromogena komplex kan därefter bestämmas som slutpunkt mätning. Eftersom endast de AO-känsliga nivåer av detta kelat bestäms, ger analysen en hög grad av specificitet för bestämning av extracellulär L-askorbat.
Figur 1. Flödesschema som visar de viktigaste stegen i protokollet förbestämning av intracellulär askorbat.
Figur 2 En typisk standardkurva för en uppsättning av askorbat standarder 0-20 um.. (Eller 0-2 nmol askorbat per brunn i 96-brunnar,. Se steg 6.5 i "protokollet") felstaplar visas inte som de är inom det intervall som upptas av symbolerna.
Figur 3. K562 celler ansamlas snabbt intracellulärt askorbat från extracellulär DHA, men inte askorbat. PBS tvättade K562-celler (4 x 10 6 celler / ml) inkuberades i PBS med 500 | iM of antingen askorbat (Asc), DHA, DHA + 50 | iM cytokalasin B (DHA + CB), Asc + 5 mM ferricyanid (Asc / FIC) eller Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) i 30 min vid 37 ° C. Intracellulär askorbat bestämdes enligt beskrivningen i "protokollet". De resultat som visas är medelvärden av tre individuella experiment (+ SD). * Den intracellulära askorbat koncentration uppskattades med hjälp av en förutbestämd intracellulära vattenutrymme för K562-celler (dvs ~ 1.6 μl/106 celler) 19,20. Denna siffra har återgivits med tillstånd från Lane och Lawen 2008 19.
Figur 4. DHA upptag av K562-celler sker genom underlättande glukostransportörer (GLUT)-medierad transport. K562-celler som hade odlats till 6-8 x 10 sex celler / ml i RPMI + 10% (vol / vol) fetalt bovint serum vid 37 ° C, var 5% CO2 och 95% luft initialt tvättas tre gånger med MBS. Tvättade celler exponerades sedan för ökande koncentrationer av cytokalasin B (CB, Sigma) eller dihydrocytochalasin B (H 2 CB) upplöst i Mops-salin (MBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na +, pH 7,3 ) innehållande 0,5% etanol före inkubering med 400 ^ iM DHA i 30 min vid 37 ° C (A). Cellerna tvättades sedan tre gånger i 100 liter av kall MBS och deras intracellulära askorbat bestäms enligt beskrivningen i "protokollet". Eftersom DHA upptag var inhiberas av CB, men inte H 2 CB, sker DHA upptag av GLUT-medierad transport. Alternativt kan, i (B), tvättades cellerna exponeras för ökande koncentrationer av GLUT-transportabel, men icke-metaboliserbar glukos analoga 3 - O-metyl-D-glukos (3-OMG) eller den icke-GLUT-trans glukos stereoisomer (A). Återigen tyder resultaten GLUT engagemang i DHA upptag. Denna siffra har återgivits med tillstånd från Lane och Lawen 2008 42.
Figur 5. Askorbat frisättning från askorbat belastade astrocyter stimuleras av den excitatoriska aminosyran L-aspartat, men inte den icke-excitatoriska aminosyran L-glutamin. Denna figur visar dos-responskurvor för stimulering av askorbat (AA)-frisättning genom aspartat (fyllda cirklar) och glutamin (öppna cirklar) från primära kulturer av askorbat belastade mus astrocyter. De data som visas är medelvärden (± SD) av tre experiment. P <0,001 vsden "basala" skick. Denna siffra har återgivits med tillstånd från Lane och Lawen 2012 32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta papper presenterar vi två snabba, konkreta och relativt känsliga kolorimetriska mikroanalyser för bestämning av askorbat härrör från intra-och extracellulära fack i odlade celler. Analyserna kan kompletteras med tillgång till standard laboratorieutrustning och reagens. Den endast måttligt dyra reagens som krävs för analysen är AO, vilket är viktigt eftersom det ger en hög grad av analyt specificitet mot L-askorbat. Analyserna är väl lämpade för antingen suspensionsceller (t.ex. K562) eller vidhäftande celler (t ex HepG2 eller primära gnagare astrocyter), och har framgångsrikt använts i tidigare publikationer med hjälp av sådana celler 19,20,32,37,38. Användning av andra askorbat oxidationsmedel (t.ex. TEMPOL) i stället för AO bör undvikas eftersom de inte är tillräckligt specifik för L-askorbat. Dessutom har användningen av föreningar, såsomTempol i askorbat-frisättningsanalysen ska förväxlas med förmåga Tempol att passera cellmembran och oxidera intracellulär askorbat 44. AO är i huvudsak membran impermeant över tidsförloppet används.
Vi har utfört direkta jämförelser av de resultat som erhållits med den kolorimetriska askorbat analys som beskrivs ovan och den fluorometriska askorbat bestämning av Vislisel och kollegor 36. Vi fann att båda analyserna gav identiska resultat för den intracellulära askorbat beslutsamhet analys (data visas ej). Intressant, askorbat-frisättningsanalysen som beskrivits ovan gav signifikant högre värden för den skenbara hastigheten för askorbat efflux än med den fluorometriska slutpunktsanalys. Detta tyder på att askorbat-utflödesanalys som beskrivs här tillåter bestämning av skenbar "askorbat-utflöde" som inte är så lätt förvirrad av sannolikheten för askorbat återupptag av celler; en process som sannolikt innebär plasma membran SVCTs. Sådan återupptag skulle tendera att orsaka underskattning av de faktiska nivåerna av askorbat som gavs ut under en viss period, om en endpoint askorbat mätningen gjordes. Det bör noteras att om vävnadsprover (t.ex. muskel, lunga eller hjärna) som skall användas i stället för odlade celler för intracellulär askorbat bestämningsanalys, sedan ett vävnadshomogenat bör konstrueras med iskall CPB och någon form av mekanisk sönderdelning ( t.ex. dounce homogenisering, mätkulans ultraljudsbehandling, fransk press osv.). Cellular skräp skall avlägsnas genom centrifugering och användaren bör överväga eventuella behov av prov deproteinisering och / eller tillägg av proteashämmare innan du fortsätter med steg 1.2.4.
Vi rapporterade tidigare också att låga mikromolära koncentrationer av cytochalasin B (<10 ^ M) hämmade inte det uppenbara takt askorbat-utflöde som bestämdes av analysen 32 19, 20,38.
Det finns flera viktiga steg i dessa protokoll. För det första, de här beskrivna analyserna beror kritiskt på förmågan hos AO att selektivt och snabbt avlägsna askorbat i parade prover. Om den specifika aktiviteten av beredningen av AO är betydligt mindre än den nominella och antagen aktivitet, är det möjligt att inte alla av askorbat i AO-innehållande spel kommer att tas bort. Detta kan leda till en underskattning av den mängd askorbat i de okända proven om du använder den "direkta metoden" för att beräkna den mängd askorbat närvarande. Men om man använder sig av "standardkurva metoden", som rekommenderas, låg aktivitets beredningar av AO kommer bara att leda till en förlust av analys-känslighet. Vi har funnit att goda resultat konsekventa resultat genom att använda beredningar av AO konstruerats genom att lösa 1,000 U i AO i 1 ml av antingen PBS eller MBS, som sedan delas upp i 100 l alikvoter som lagras vid -80 ° C i högst en månad. Vidare, såsom AO är ett protein som kan proteolytiskt nedbrytas av cellysat, proteashämmare kan tillsättas till cellysat före tillsatsen av lysat till AO-innehållande brunnar. Detta kan vara en användbar modifiering att tänka på när du använder cell-eller vävnads lysat som är rika på proteas aktivitet.
Dessutom är känsligheten hos de analyser som beskrivs enBove till stor del beroende av användningen av det kromogena tvåtandad Fe (II)-kelator, Ferene-S. Denna kelator kan ersättas av kemiskt liknande kelatorer såsom FerroZine och batofenantrolin disulfonat, men med en minskning i känslighet som motsvarar extinktionskoefficienten för deras Fe (II) kelaterar 37. Vidare bör försiktighet iakttas vid användning av batofenantrolin disulfonat, som det verkar leda till högre skenbar autokatalytisk ferrireduction i närvaro av järn citrat komplex än Ferene-S eller FerroZine 37,45. Detta är en relevant fråga i fallet med askorbat-frisättningsanalys såsom den icke-askorbat beroende utseendet på Fe (II)-kelatet kommer att minska känsligheten för analysen.
Medan den intracellulära askorbat bestämning analysen är kompatibel med vidhäftande celler, bör avlossning av sådana celler före cellulär lys utföras genom mekanisk skrapning istället trypsin / EDTA. Som trypsin är ett proteaskommer det sannolikt påverka negativt med askorbat-utarmning steg med AO, varav den sistnämnda är ett protein. Dessutom kommer EDTA sannolikt interfererar med FOC bestämningssteg genom kelaterande järn i konkurrens med ferene-S 37. Sådana medel bör undvikas. Slutligen askorbat frisättningsanalys kunde enkelt anpassas för suspensionsceller. Istället för att suga bort den överliggande Fe (II) (ferene-S) 3-innehållande kelatet vid slutet av analysen, cellerna bör snabbt sedimenteras genom centrifugering såsom för den intracellulära askorbat bestämning assay. Absorbansen vid 593 nm av supernatanten bör då bestämmas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Dr Stephen Robinson och Ms Hania Czerwinska (Monash University) för generöst utbud av astrocyternas kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nunc 96-well flat-bottom plates | Thermo | 269620 | Any flat-bottom 96-well plate can be used |
| Refrigerated benchtop microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used |
| Refrigerated bench-top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Swing-bucket |
| Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer | Bio-Rad | Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method. | |
| Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) | Eppendorf | This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays | |
| General-purpose buffers | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 | |||
| MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3 | |||
| MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D) | |||
| HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3) | |||
| Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS) | |||
| General chemicals | |||
| L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | Highest purity preparations should be obtained | |
| Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer | Sigma-Aldrich | 30790 | Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | Stock solutions prepared in DMSO or ethanol |
| Ascorbate oxidase (AO) | Sigma-Aldrich | A0157 | Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots |
| Potassium ferricyanide (FIC) | Sigma-Aldrich | 455989 | Trihydrate |
| Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) | Sigma-Aldrich | 92940 | |
| Sodium L-glutamate | Sigma-Aldrich | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Prepare a 0.1% stock solution |
| Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay | |||
| 3 M sodium acetate (pH 6.0) | |||
| Glacial acetic acid | |||
| 0.2 M citric acid | |||
| 3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid | |||
| 30 mM ferene-S | |||
| 50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA) | |||
| Stock solutions for ascorbate-efflux assay | |||
| AO (120 U/ml) | |||
| 2.4 mM ferene-S | |||
| 0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate |
References
- Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
- Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
- Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
- Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
- Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
- Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
- Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
- Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
- Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
- Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
- Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
- Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
- May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
- Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
- Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
- May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
- Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
- Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
- Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
- Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
- Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
- Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
- Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
- Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
- Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
- Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
- Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
- Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
- Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
- Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
- Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
- Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
- Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
- Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
- Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
- May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
- Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).
