Summary
हम reproducibility बढ़ाने के लिए छोड़ दिया पूर्वकाल अवरोही धमनी (लाड) पर बंधाव की स्थिति में अधिक स्पष्टता के लिए अनुमति देता है कि माउस मॉडल में रोधगलन (एमआई) अनुकरण करने के लिए प्रयोगात्मक ischemia / reperfusion (आई / आर) चोट प्रेरित करने के लिए एक शल्य चिकित्सा पद्धति का परिचय चूहों में एमआई प्रयोगों की.
Abstract
तीव्र या पुराना रोधगलन (एमआई) उच्च रुग्णता और मृत्यु दर में जिसके परिणामस्वरूप हृदय की घटनाओं रहे हैं. एमआई के दौरान काम पर रोग तंत्र की स्थापना और प्रभावी चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने reproducibly नैदानिक घटना अनुकरण और एमआई के साथ जुड़े pathophysiological परिवर्तन को प्रतिबिंबित करने के कार्यप्रणाली की आवश्यकता है. यहाँ, हम अल्पकालिक ischemia-reperfusion (आई / आर) चोट के साथ ही स्थायी बंधाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि माउस मॉडल में एमआई प्रेरित करने के लिए एक शल्य चिकित्सा पद्धति का वर्णन. इस विधि का बड़ा लाभ यह माउस दिल के बाएं वेंट्रिकल में ischemia प्रेरित करने के लिए इस धमनी की सटीक बंधाव के लिए अनुमति देने के लिए बाईं पूर्वकाल अवरोही धमनी (लाड) के स्थान की सुविधा के लिए है. लाड पर संयुक्ताक्षर की सही स्थिति रोधगलितांश आकार के reproducibility बढ़ जाती है और इस प्रकार अधिक विश्वसनीय परिणाम लाता है. संयुक्ताक्षर की नियुक्ति में अधिक से अधिक सटीक टी, चूहों में एमआई अनुकरण करने के लिए मानक शल्य दृष्टिकोण में सुधार होगापति सांख्यिकीय प्रासंगिक अध्ययन के लिए आवश्यक प्रायोगिक पशुओं की संख्या कम करने और एमआई निम्नलिखित हृदय रोग उत्पादन तंत्र की हमारी समझ में सुधार. एमआई के इस माउस मॉडल भी एमआई निम्न दौरे क्षति को लक्षित उपचार के preclinical परीक्षण के लिए उपयोगी है.
Introduction
रोधगलन (एमआई) के पशु मॉडल इस्कीमिक हृदय रोग 1 की जटिल pathophysiology के अनुसंधान में महत्वपूर्ण हैं. Ischemia-reperfusion (आई / आर) चोट एमआई दौरान उत्पन्न दौरे क्षति एक प्रमुख योगदान है. कोरोनरी परिसंचरण का रोड़ा द्वारा उत्पादित प्रारंभिक ischemia चोट एक समय पर फैशन में छिड़काव बहाल करने के लिए एंजियोप्लास्टी के उपयोग से एमआई रोगियों में कम से कम किया जा सकता है. इस हस्तक्षेप के बहुत कारण तीव्र एमआई, cardiomyocytes की मौत हो जाती है कि मैं / आर चोट में इस्कीमिक क्षेत्र परिणामों में रक्त के प्रवाह की बहाली के लिए होने वाली मौतों की संख्या में कमी आई है जबकि. दौरे जन का यह नुकसान कार्डियक आउटपुट और दिल की विफलता की ओर प्रगति की कमी हुई योगदान देता है. इस प्रकार, मैं / आर चोट से cardiomyocyte मौत में परिणाम है कि तंत्र के अध्ययन हृदय अनुसंधान में जांच का एक महत्वपूर्ण लाइन है. सर्जिकल कोरोनरी बंधाव विभिन्न जानवर प्रकार में एमआई के मॉडल के लिए प्रेरित करने के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक तकनीक, includi हैचूहे, कुत्ते और सुअर एनजी. विभिन्न प्रयोगशालाओं में प्रकाशन मैं / आर चोट 2,3 के चूहों दिल मॉडल की स्थापना पर विभिन्न तरीकों को पेश किया है. इन तंत्रों में जानकारी हासिल करने के लिए हमें एमआई विकृति विज्ञान के कई पहलुओं को पुन: पेश कर सकते हैं कि विश्वसनीय पशु मॉडल के लिए उपयोग होगा. इस तरह के मॉडल का विकास भी एमआई के उपचार और संबद्ध मैं / आर चोट के लिए चिकित्सकीय दृष्टिकोण के परीक्षण के लिए आवश्यक है.
प्रायोगिक पशुओं में एमआई अनुकरण करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध तकनीक शल्य चिकित्सा के अधिकांश तो इस्कीमिक घटना का निर्माण करने के समय में निर्धारित अवधि के लिए एक संयुक्ताक्षर द्वारा occluded है कि धमनी (लाड) उतरते बाएँ पूर्वकाल बेनकाब करने के लिए छाती गुहा में शल्य विच्छेदन शामिल है. तब उस संयुक्ताक्षर मैं / आर चोट के इस्कीमिक क्षेत्र और पीढ़ी के reperfusion के लिए अनुमति देने के लिए हटाया जा सकता है. लाड पर साहित्य की स्थिति हमेशा सही reproduced नहीं है कि, जिसमें इन तरीकों में से एक प्रमुख सीमाइस दृष्टिकोण से प्रेरित एमआई की गंभीरता में भिन्नता हो सकती है. अधिकांश उपलब्ध तकनीकों केवल आम तौर पर दिल के पूर्वकाल दीवार में बालक की अनुमानित स्थान का वर्णन किया. बालक की शाखाओं में बंटी और दिशा स्थान हमेशा ठीक नहीं हुई है और शल्य चिकित्सा के दौरान 6 संभावित जटिलताओं के लिए अग्रणी, 4,5 आसानी से भ्रमित हो सकता है व्यक्ति पशुओं में भिन्न हो सकते हैं. संयुक्ताक्षर के अनुचित स्थान के परिणामों को पूरी तरह से मॉडल की विशिष्टता कोई समझौता करने के लिए बाएं वेंट्रिकल में प्रेरित रोधगलितांश के आकार में परिवर्तनशीलता से चला सकते हैं. यहाँ हम दौरे मैं / आर और बालक पर संयुक्ताक्षर की नियुक्ति के बेहतर सटीकता के लिए अनुमति देता है कि चूहों में स्थायी बंधाव के लिए एक संशोधित विधि प्रस्तुत करते हैं. प्रारंभिक चीरा और आंतरिक विच्छेदन, साथ ही यह महाधमनी से उभर जहां लाड और साइट की बेहतर सराहना की अनुमति देने के अटरिया उठाने के लिए जोड़तोड़ का उपयोग के लिए विशिष्ट दृष्टिकोण को लागू करके. की स्थापनालाड और इसकी उत्पत्ति पर स्थिति एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन में लाड ligate करने का अवसर प्रदान करता है. दौरे मैं / आर और स्थायी बंधाव का यह मॉडल सर्जरी के बाद रोधगलितांश आकार में भिन्नता कम हो जाती है, न केवल यह भी ऑपरेशन के दौरान अत्यधिक रक्तस्राव की घटनाओं में कमी कर सकते हैं.
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Protocol
यह जानवर प्रोटोकॉल द्वारा अनुमोदित और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था. स्थानीय IACUC द्वारा विकसित की सभी नीतियों राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान में प्रयोगशाला पशु कल्याण के कार्यालय द्वारा विकसित पशु प्रयोग गाइड के अनुपालन में हैं.
1. संज्ञाहरण और अंतःश्वासनलीय इंटुबैषेण
- उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों और शल्य चिकित्सा की आपूर्ति आटोक्लेव. प्रक्रिया के दौरान बाँझ, एकल उपयोग सर्जिकल दस्ताने पहनें. प्रक्रिया के दौरान एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखें. एक बाँझ कपड़ा के इस्तेमाल का सुझाव दिया लेकिन माउस पर संरचनात्मक स्थलों की बेहतर दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए वीडियो में नहीं दिखाया गया है.
- एक प्रेरण कक्ष में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक माउस रखें और पलटा ठीक के नुकसान तक 0.4 एल / मिनट की एक प्रवाह दर के साथ 5% isoflurane और ऑक्सीजन का उपयोग संज्ञाहरण उपलब्ध कराने और तो वें बनाए रखने केसांस की नली ट्यूब जगह में है जब तक संज्ञाहरण तंत्र से जुड़े एक nosecone ट्यूब के माध्यम से 0.4 एल / मिनट की एक प्रवाह के साथ 100% ऑक्सीजन में 2% isoflurane के साथ ई जानवर. इस्तेमाल किया isoflurane संज्ञाहरण मशीन उचित दिए और प्रक्रिया के दौरान isoflurane धुएं को सर्जन के जोखिम को कम करने के लिए लकड़ी का कोयला फिल्टर के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए. nosecone विख्यात लेकिन माउस नली लगाना करने के लिए जोड़तोड़ के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए वीडियो में नहीं दिखाया गया है.
- सर्जरी स्थान के संक्रमण से बचने के लिए शल्य चिकित्सा मंच से एक अलग स्थान में एक पशु बाल क्लिपर के साथ पशु की छाती दाढ़ी.
- बाद में इंटुबैषेण के लिए शल्य चिकित्सा मंच पर एक लापरवाह स्थिति में माउस रखें. एक साधारण छोटे polystyrene फोम मंच एक ऑपरेटिंग मंच के रूप में काम कर सकते हैं. एक बाँझ सतह प्रदान करने के लिए एक पूर्व निष्फल टांगना के साथ मंच को कवर किया. Surgica में चूहों के शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए मंच और टांगना के बीच एक हीटिंग पैड रखेंएल प्रक्रियाओं.
- टेप के साथ मंच करने के लिए कम से कम 10 सेमी की 2-0 रेशम सीवन की लंबाई देते हैं और फिर सामने ऊपरी incisors के आसपास पाश सिवनी. माउस की नाक पर मंच के किनारे के करीब निकटता (2-3 सेमी) में कोन स्थिति. माउस तना हुआ खींचो और टेप का एक टुकड़ा के साथ पूंछ से मंच करने के लिए यह सुरक्षित.
- टेप की किस्में के साथ शरीर के पक्षों के लिए पैरों को सुरक्षित करो. यह इस श्वसन समझौता कर सकते हैं के रूप में सामने हाथ पैर के ऊपर से बढ़ाकर नहीं कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है.
- गर्दन और छाती चीरों बना रहे हैं पहले Betadine और शराब के साथ मुंडा शल्य साइटों तैयार करें.
- माउस सिर ऑपरेटर की दिशा में इशारा कर के साथ मंच रखें. एक 0.5 सेमी मंझला ग्रीवा त्वचा चीरा काटा. ट्रेकिआ मांसपेशियों के नीचे देखा जा सकता है जहां sternohyoideus मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए उनके isthmus में थायरॉयड ग्रंथि की पालियों अलग करें.
- यह एक intub के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है तो एक 18 गेज trocar के भीतर की सुई निकालेंसमझना ट्यूब. सुई बिंदु एक धारक के रूप में काम कर सकते हैं और बाहरी ट्यूब का 1 सेमी सांस की नली ट्यूब के रूप में काम कर सकते हैं.
- एक हाथ में घुमावदार संदंश के साथ माउस की जीभ पकड़ और थोड़ा ऊपर की ओर ले जाएँ. ग्रीवा त्वचा चीरा के माध्यम से ट्रेकिआ देखें. ट्यूब ट्रेकिआ के अंदर देखा जाता है जब तक धीरे इंटुबैषेण ट्यूब डालने के लिए दूसरे हाथ का प्रयोग करें.
- जैसे ही ट्यूब सांस की नली में है, के रूप में ट्यूब की ओर दूसरे हाथ में घुमावदार संदंश कदम है और जल्दी से भीतर की सुई को हटा दें. ट्यूब सांस की नली में सम्मिलित नहीं किया जा सकता है, तो ट्यूब सांस की समस्याओं के उत्पादन से बचने के लिए बाहर निकाला जाना चाहिए. यह बजाय श्वासनली की घेघा में ट्यूब डालने से बचने के लिए गले करे जब ट्यूब की नोक बात करने के लिए महत्वपूर्ण है.
2. वेंटिलेशन और फिक्सेशन
- एक जानवर श्वासयंत्र 0.4 एल / मिनट की एक प्रवाह दर के साथ ऑक्सीजन में 2% isoflurane निकाल साथ कृत्रिम वेंटिलेशन प्रदान करें. एक संशोधित वाई शा का प्रयोग करेंवेंटीलेटर के साथ इंटुबैषेण ट्यूब कनेक्ट करने के लिए पीई कनेक्टर. सांस की नली ट्यूब की सही स्थिति सममित सीने में विस्तार पहचानने से इसकी पुष्टि की जा सकती है.
- 260 μl / स्ट्रोक और वेंटिलेशन दर पर ज्वार की मात्रा सेट एक विशेष माउस यदि आवश्यक के शरीर के वजन को समायोजित किया जा सकता है, जो प्रति मिनट 130 स्ट्रोक, है.
- पूंछ पर टेप निकालें और बाद सर्जरी के लिए एक सही पार्श्व decubitus स्थिति में जगह धीरे माउस बारी. फिर मंच को पूंछ और पैरों को सुरक्षित करने के लिए टेप का प्रयोग करें.
- शरीर के तापमान पर नजर रखने के लिए गुदा जांच डालें और 37 डिग्री सेल्सियस के आसपास तापमान बनाए रखने के लिए वार्मिंग पैड समायोजित
- टेप का उपयोग कर मंच को जांच सुरक्षित. चीरा करने से पहले क्षेत्र को सुन्न करने चीरा स्थल पर bupivacaine subcutaneously इंजेक्षन.
3. Thoracotomy
- दूर छोड़ दिया से एक साइट 2 मिमी में लगभग 1 सेमी लंबा है कि एक परोक्ष चीरावाम मोर्चे पैर शरीर (पैर और शरीर में शामिल होने के नीचे, जहां लगभग 1-2 मिमी) से मिलता है, जहां की दिशा में sternal सीमा. सतही वक्ष नस इस स्थल के निकट है और चीरा के पार्श्व अंत तक जाता है, ताकि चीरा बनाया जाना चाहिए, लेकिन नस में कटौती नहीं करता है.
- वक्ष पेशी के नीचे की पसलियों को बेनकाब करने के लिए हालांकि काटें. इस चरण के दौरान पोत के आकस्मिक चोट से बचें. खून बह रहा होती है, तो अगले चरण 7 के लिए आगे बढ़ने से पहले किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए कपास applicators का उपयोग करें.
- पसलियों कल्पना और पतली और अर्द्धपारदर्शी छाती दीवार के माध्यम से फेफड़ों inflating. तीसरे पसलियों के बीच अंतरिक्ष में एक 6-8 मिमी चीरा बनाने के लिए शल्य कैंची का उपयोग छाती गुहा खोलें. इस चीरा आंतरिक वक्ष धमनी जहां स्थित है sternal सीमा से 2 मिमी की एक न्यूनतम होना चाहिए. धमनी को क्षति को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है कि भारी रक्तस्राव का उत्पादन होगा.
- पूर्व निष्फल घर का बना सीने retractors int डालेंफेफड़ों से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, जबकि यह व्यापक बारे में 8-10 मिमी है कि इतनी ओ धीरे चीरा और चीरा खोलने के लिए वापस खींच. retractors पिन के साथ शल्य चिकित्सा मंच से जुड़ी होनी चाहिए.
- इस बिंदु पर दिल हालांकि, फेफड़ों अभी भी दिल के एक हिस्से को कवर किया जाएगा, दिखाई जानी चाहिए. घुमावदार संदंश के साथ धीरे पेरीकार्डियम उठाओ, यह अलग खींच, और retractors पीछे ऊतक स्लाइड. इस हेरफेर के दौरान फेफड़ों के ऊपर और दूर दिल से उठा लेंगे.
4. पोजिशनिंग लाड
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से दिल की सतह पर लाड जानें. लाड बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से नीचे दिल के शीर्ष के पास से दिल की दीवार के बीच नीचे चलता है. लाड लाल उज्ज्वल दिखाई देता है और दृढ़ता से स्पंदन हो जाएगा. यहाँ नस कभी कभी हालांकि समुचित प्रकाश व्यवस्था के दो जहाजों भेद करने में मदद कर सकते हैं, बालक के लिए गलत है. प्रकाश भी उज्ज्वल है, तो यह रंग सराहना करने के लिए मुश्किल हो सकता हैजहाजों के बीच मतभेद.
- बंधाव के लिए लाड तैयार करने के लिए लगभग 1-2 मिमी की एक व्यास के साथ एक बाँझ कपास की गेंद टुकड़ा का प्रयोग करें. बाएं आलिंद उठा और बालक को बेनकाब करने और अपनी स्थिति को स्पष्ट करने में मदद करेगा, जो बाएं आलिंद और बाएं निलय के बीच कपास रखें. लाड स्थित नहीं किया जा सकता है, तो टुकड़ा तो बाएं आलिंद लाड निकलती है जहां महाधमनी प्रकट करने के लिए भी उच्च उठाया है में आगे गिरावट जा सकता है.
5. लाड Ligation
- संयुक्ताक्षर के लिए आदर्श स्थिति बाईं अलिंद की नोक से लगभग 2 मिमी कम है. फेफड़े के ट्रंक बाईं अलिंद की पहचान में मदद करने के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, बंधाव स्थिति दूर छोड़ दिया सिकमफ़्लक्स की शाखाओं में से एक बिंदु 1-2 मिमी के रूप में देखे जा सकते हैं. धीरे तुरंत इरादा बंधाव बिंदु से नीचे एक स्थल पर दबाव लागू करने के लिए घुमावदार संदंश का प्रयोग करें. यह आसान धमनी को देखने के लिए कर देगा और यह भी जगह में दिल पकड़ में मदद मिलेगीऔर संयुक्ताक्षर बांधने को आसान बनाने में. एक समय में अधिक से अधिक 5 सेकंड के लिए संदंश के साथ दबाव लागू करते हैं और पम्पिंग बदल सकता है कि दिल के संपीड़न से बचने मत करो.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ अवलोकन करते हुए लाड के नीचे एक 6-0 रेशम सीवन पारित करने के लिए एक पतली सुई का प्रयोग करें. सुई भी गहरा रखा अगर बाएं वेंट्रिकल कक्ष में प्रवेश या सुई भी उथले है अगर लाड नुकसान होगा के रूप में परिशुद्धता के साथ धमनी के तहत सुई डालें. लाड घायल है, तो खून बह रहा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है लेकिन अगर यह जानवर euthanize के लिए बेहतर है, सुई को हटाने और रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लाड सीवन.
- पीई 10 ट्यूबिंग का एक 2-3 मिमी लंबा टुकड़ा 8 रखा गया है जिसके माध्यम से एक 2-3 मिमी व्यास पाश छोड़ने, सीवन के साथ एक ढीला डबल गाँठ बनाओ.
- फिर निलय दीवार को नुकसान नहीं ख्याल रख रही है, एक अतिरिक्त Slipknot बांधने से पाश सुरक्षित धमनी और ट्यूबिंग चारों ओर पाश कस. स्थायी बंधाव के लिए, सीधे एक साथ लाड टाई9 गाँठ. बंधाव के बाद एक कुछ सेकंड के भीतर दिखाई देनी चाहिए कि एल.वी. के पूर्वकाल दीवार में एक पीला रंग की उपस्थिति के लिए जाँच करके बालक की आड़ पुष्टि करें.
- प्रतिकर्षक निकालें और एक बुलडॉग क्लैंप के साथ एक साथ त्वचा pinching द्वारा अस्थायी रूप से घाव को बंद करें. ischemia बनाए रखा है कि समय की लंबाई प्रयोग डिजाइन पर निर्भर करता है, लेकिन अक्सर 20, 30, 45 या 60 मिनट है. माउस लाड धमनी रोड़ा की अवधि के लिए वेंटीलेटर पर बनी हुई है.
6. Reperfusion
- Ischemia अवधि के बाद बुलडॉग क्लिप हटाने और संयुक्ताक्षर को बेनकाब करने के लिए छाती retractors डालें. गाँठ खोल और पीई 10 ट्यूबिंग हटा दें. 15-20 सेकंड के बाद एल.वी. के पूर्वकाल दीवार के गुलाबी लाल रंग का रिटर्न देख कर reperfusion की पुष्टि करें.
- 2% triphenyl tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) और नीले रंग धुंधला reperfusion के बाद किया जाएगा यदि जगह में सिवनी छोड़ दें. धुंधला हो जाना आवश्यक नहीं है, तो सिवनी ख कर सकते हैंई हटाया.
- reperfusion समय आमतौर पर 24 घंटे के लिए 1 घंटे से फैले प्रयोग डिजाइन पर निर्भर करेगा.
7. छाती क्लोजर और पश्चात की देखभाल
- सिलाई द्वारा छाती गुहा को बंद 4-0 रेशम सीवन के साथ 3 पसलियों के बीच अंतरिक्ष में चीरा बंद. यह फेफड़ों सीवन का स्पष्ट हैं और 3 के रूप में फँस गया और 4 वें पसलियों एक साथ sutured रहे हो नहीं है कि महत्वपूर्ण है. सिवनी गांठ बांधने जबकि यह छाती गुहा में फंसे हो सकते हैं कि किसी भी कमरे में हवा कम करने के लिए सुई धारक के साथ सीने को थोड़ा दबाव लागू करने के लिए उपयोगी है.
- 4-0 रेशम का उपयोग निरंतर sutures के साथ मांसपेशियों के सभी परतों को बंद करें. एक सतत सीवन के साथ त्वचा को बंद करने के लिए नायलॉन टांके का प्रयोग करें. वैकल्पिक रूप से, त्वचा बाधित सीवन के साथ बंद किया जा सकता है.
- ऑक्सीजन का प्रवाह जारी है suturing पूरा संघर्ष isoflurane के प्रवाह होता है. माउस अपनी मूंछ या पूंछ यह shoul चलता है एक बारअनायास साँस लेने के लिए प्रयास कर रही शुरू होगा. इंटुबैषेण ट्यूब के साथ वेंटीलेटर से माउस निकालें अभी श्वासनली में रखा.
- माउस एक सामान्य श्वास पैटर्न शुरू और फिर माउस extubate जब तक ध्यान से जानवर को ध्यान से देखें. ट्यूब मौखिक गुहा स्राव की आकांक्षा से बचने के लिए धीरे धीरे हटा दिया जाना चाहिए.
- माउस एक पिंजरे को लौटने से पहले एक और 3-5 मिनट के लिए इसे देख कर किसी भी श्वसन संकट में नहीं है की पुष्टि करें. निर्जलीकरण के लक्षण सर्जरी के बाद मनाया जाता है, intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा बाँझ खारा के 0.5 मिलीलीटर अप करने के लिए प्रदान करते हैं.
- पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए, पशु चल रहा है पहले एक opioid एनाल्जेसिक (buprenorphine, 0.1 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaneously (अनुसूचित जाति) प्रशासन और फिर एक अतिरिक्त खुराक अगले 24 घंटे के लिए हर 4-6 घंटे प्रदान करते हैं. सर्जरी के बाद 12 घंटे में संकट के पशुओं के लक्षण की जाँच करें. अस्तित्व सर्जरी का उपयोग दौरे रोधगलितांश के सिमुलेशन सु से वसूली के बाद दर्द और संकट के मूल्यांकन की आवश्यकताrgery. वर्तमान में स्वीकृत सबसे अच्छा अभ्यास के कारण वजन घटाने या दर्द के लक्षण के लिए warranted के रूप में दिया अतिरिक्त खुराक के साथ एक आक्रामक प्रक्रिया के बाद पहले 24 घंटे के लिए analgesia प्रदान करना है. स्थायी बंधाव के लिए, शरीर के वजन को जानवर की वसूली गेज करने में मदद करने के लिए दैनिक नज़र रखी जानी चाहिए.
- Ibuprofen (Motrin), विरोधी भड़काऊ, पीड़ानाश और ज्वरनाशक गतिविधि, या अन्य NSAIDs के साथ एक nonsteroidal विरोधी भड़काऊ (NSAID) दवा, सर्जरी से पहले दो दिनों के लिए एक 0.2 मिलीग्राम / एमएल समाधान के रूप में पशु के पीने के पानी में प्रदान की है और किया जा सकता है किसी भी अतिरिक्त दर्द / संकट का प्रबंधन करने के लिए buprenorphine के साथ में सर्जरी के बाद एक 7 दिनों के लिए.
दौरे रोधगलितांश आकार 8. मापन
- Anesthetize और वांछित reperfusion समय की समाप्ति पर माउस नली लगाना. Xyphoid को midline में छाती त्वचा में कटौती. रिब पिंजरे नीचे और midclavicular रेखा के दोनों ओर से पेट और डायाफ्राम खोलें. <ली> दिल को बेनकाब और फिर एक ही स्थान में लाड फिर से ligate. इसलिए 10% Phthalo ब्लू धीरे धीरे nonischemic क्षेत्र 10 से इस्कीमिक क्षेत्र के चित्रण के लिए दिल दाग महाधमनी में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता महाधमनी cannulate.
- तेजी से दिल उत्पाद शुल्क और दिल की धड़कन बंद और अधिक सुसंगत सेक्शनिंग के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिमी KCl (पोटेशियम क्लोराइड समाधान) में इसे धो लो. -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए दिल रुक और युक्ति 11 सेक्शनिंग एक दिल मैट्रिक्स का उपयोग 1 मिमी की स्लाइस में दिल काटा.
- 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2% टीटीसी के साथ दिल स्लाइस सेते हैं. व्यवहार्य ऊतक लाल रंग के धब्बे, जबकि रोधगलितांश क्षेत्र एक सफेद क्षेत्र के रूप में सीमांकन है.
- रोधगलितांश क्षेत्र और सामान्य ऊतकों के बीच विपरीत बढ़ाने में मदद मिलेगी, जो रातोंरात 10% formaldehyde के साथ दाग स्लाइस को ठीक करें. स्लाइस तस्वीर और जोखिम पर क्षेत्र (एएआर), nonischemic क्षेत्र और ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रोधगलितांश क्षेत्र की गणना.
पोर्टल शिरा से रक्त प्राप्त करने और फिर centrifugation द्वारा सीरम अलग से चूहों के सीरम में मैं (cTnI) के स्तर हृदय troponin उपाय. सीरम cTnI का स्तर तो एक मात्रात्मक तेजी cTnI परख 12 के साथ निर्धारित कर रहे हैं.
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Representative Results
Reperfusion, रोधगलितांश आकार और क्षेत्र में जोखिम (एएआर), phthalo नीले रंग की डाई और triphenyl tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) द्वारा, बालक की बंधाव सिवनी दौरे ऊतक बाहर की blanching देख कर इस बात की पुष्टि की जा सकती है के विश्लेषण के 24 घंटे के बाद साथ ही साथ पूर्वकाल दीवार की शिथिलता. Reperfusion दौरे ऊतक और पूर्वकाल दीवार गति से कुछ वसूली का प्रदर्शन करने के लिए लाल रंग की वापसी से सत्यापित किया जा सकता है.
रोधगलितांश क्षेत्रों (सफेद) जोखिम (लाल) में क्षेत्रों से अलग पहचाना जा सकता है और क्षेत्र नहीं जोखिम (नीला) में करना चाहिए. Phthalo नीले रंग की डाई (चित्रा 1 ए) के आवेदन बालक की आड़, नीले रंग के साथ दाग नहीं कर रहे हैं कि दिल ही रोधगलितांश के क्षेत्र (चित्रा 1 बी) दिखा सकते हैं जबकि जहां दिल के क्षेत्र के संकल्प के लिए अनुमति देता है. रोधगलितांश आकार ischemia की अवधि पर निर्भर हैं. महत्वपूर्ण बात है, हृदय troponin मैं (cTnI) के स्तर सब लिया है कि नकली संचालित पशुओं में कम कर रहे हैं(चित्रा 2) रोधगलन लिया जो जानवरों की तुलना में ischemia और reperfusion छोड़कर सर्जिकल प्रक्रियाओं. इस ischemia / reperfusion चोट एमआई के लिए यह व्यापक रूप से इस्तेमाल biomarker की ऊंचाई निर्माण करने के लिए पर्याप्त था, जबकि नकली सर्जरी महत्वपूर्ण हृदय विकृति का उत्पादन नहीं किया इंगित करता है.
चित्रा 1:. लाड रोड़ा सर्जरी के बाद रोधगलितांश की हद तक की मात्रा (ए) 45 मिनट ischemia और 24 घंटे reperfusion के अधीन जानवरों से जंगली प्रकार माउस दिल वर्गों के प्रतिनिधि छवि. नीले रंग की डाई इंजेक्शन एक रोधगलितांश के लिए खतरा नहीं है कि दिल की गैर इस्कीमिक क्षेत्र के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. नीले रंग की डाई इंजेक्शन नहीं है, जहां एक दिल का (बी) के एक प्रतिनिधि छविसफेद दिखाई देता है जो लाल दिखाई देता है, जो क्षेत्र में जोखिम (एएआर),, और रोधगलितांश क्षेत्र, पर जोर देना. प्रत्येक क्षेत्र के क्षेत्रों में कुल बाएं वेंट्रिकल कि टुकड़ा के कुल वजन से गुणा (एल.वी.) क्षेत्र के प्रतिशत के रूप में गणना कर रहे हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2:. हृदय रोधगलितांश की हद तक की एक माप के रूप में हृदय troponin स्तर का प्रयोग हृदय troponin की एक पट्टी चार्ट 24 घंटे (आई / आर) या नकली सर्जरी के लिए 45 मिनट ischemia और reperfusion के अधीन चूहों में मैं (CTnl) का स्तर एक नियंत्रण के रूप में. रक्त प्रत्येक समूह के लिए तीन जानवरों से सर्जरी के बाद 24 घंटे में पोर्टल शिरा से एकत्र किया गया था. cTnI के स्तर में काफी में बुलंद कर रहे हैंनकली नियंत्रण जानवरों (1.195 ± 0.06651) की तुलना में मैं / आर चोट (9.195 ± 0.07146) निम्नलिखित जानवरों. डाटा ± SEM मतलब है के रूप में प्रस्तुत किया है और *** पी इंगित करता है <0.0001 दिखावा नियंत्रण की तुलना करने और टी परीक्षण द्वारा मैं / आर समूहों. है बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
माउस दौरे ischemia-reperfusion मॉडल नैदानिक तीव्र या जीर्ण हृदय रोग 13,14 अनुकरण करने के लिए हृदय अनुसंधान के लिए एक प्रभावी तरीका है. महत्वपूर्ण प्रयास इस्कीमिक घटनाओं और कई अलग जानवर प्रकार के दिलों में reperfusion क्षति का उत्पादन है कि शल्य दृष्टिकोण को विकसित और परिष्कृत करने के लिए लागू किया गया है. विभिन्न जानवरों सिस्टम का उपयोग करने के लिए विशेष रूप से लाभ कर रहे हैं, यह माउस माउस दिल में दौरे मैं / आर के उत्पादन में व्यापक हित के लिए मार्ग प्रशस्त किया है कि लक्षण है. प्रमुख कारणों में से एक माउस प्रणाली की आनुवंशिक शिक्षणीयता है. उपलब्ध आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं, और नए मॉडल विशिष्ट सवालों का पता करने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है जिसके द्वारा रिश्तेदार आसानी के व्यापक चयन, अन्य पशु मॉडल प्रणाली में कोई मुकाबला नहीं है. हृदय अध्ययन में चूहों के बढ़ते उपयोग के लिए एक अन्य कारण यह शल्य चिकित्सा उपकरण और विशिष्ट अन्य प्रयोगात्मक उपकरणों की बढ़ती उपलब्धता हैसहयोगी चूहों में इस्तेमाल के लिए बनाया गया है. माउस मॉडल की अपेक्षाकृत कम लागत में भी पढ़ाई में उनके उपयोग के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान है. preclinical अध्ययन में कठोरता के लिए बढ़ाने की जरूरत कम संसाधनों पशुओं की उचित संख्या में शामिल करने के लिए आवश्यक हैं जब अधिक यथार्थवादी हो सकता है, जो अतिरिक्त जानवरों का उपयोग जरूरी है. माउस मॉडल का उपयोग कई फायदे हैं जबकि माउस और मानव हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के विभिन्न पहलुओं पर विचार विशेष रूप से जब नुकसान के रूप में अच्छी तरह से कर रहे हैं. ऐसे कुत्ते और सुअर के रूप में कई बड़े पशु मॉडल, और अधिक बारीकी से माउस से मानव हृदय शरीर विज्ञान की सबसे पहलुओं की नकल. एक और नुकसान यह माउस में छोटे दिल का माउस, जोड़ - तोड़ का आकार विशेष रूप से लाड लगाने और reproducibly यह बाएं वेंट्रिकल में लगातार रोधगलितांश क्षेत्र का निर्माण करने के ligating में, शल्य चिकित्सा कौशल के एक उच्च डिग्री की आवश्यकता है. यहाँ प्रस्तुत विधि पहचान एक में एक महत्वपूर्ण सुधार प्रदान कर सकते हैंबालक की एन डी बंधाव. दिल (चित्रा 2) से cTnI रिहाई की राशि में हमारे अनुरूप परिणाम हम reproducibly एक समान आकार और cardiomyocytes मौत के स्तर का रोधगलितांश उत्पन्न कर सकते हैं सुझाव देते हैं.
प्रयोगात्मक दौरे रोधगलितांश प्रेरित करने के लिए सर्जरी का एक महत्वपूर्ण पहलू बालक की स्पष्ट पहचान और बंधाव है. यहाँ विस्तृत हमारे दृष्टिकोण में हम पोत पर बंधाव से अधिक सुसंगत स्थिति के लिए अनुमति देता है, बालक की पहचान करने और उपयोग करने की कार्यप्रणाली में सुधार हुआ है. सर्जरी के दौरान, हम बालक की स्थिति स्पष्ट करते हैं और बालक की बंधाव जो सुविधा लाड, बेनकाब ऊपर और पूरी तरह से बाएं आलिंद उठाने के लिए बाँझ कपास का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करें. अन्य तरीकों से तकनीक और एक भेदभाव बिंदु के लिए यह एक महत्वपूर्ण कदम है. लाड बंधाव के लिए इन संशोधनों की शुरूआत माउस मॉडल में एमआई के अनुकरण के दौरान अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए अनुमति चाहिए. जबकि जगह में सुधार परिशुद्धतासंयुक्ताक्षर के बयान रोधगलितांश के आकार में निरंतरता यह Phthalo नीले रंग का छिड़काव का उपयोग कर जोखिम क्षेत्र में मापने के लिए अब भी महत्वपूर्ण है उत्पन्न में सुधार करना चाहिए. इस जीन की अभिव्यक्ति के हेरफेर बंधाव को दिल की रक्त वाहिकाओं के जवाब में परिवर्तन में परिणाम कर सकते हैं, जहां आनुवंशिक संशोधन माउस लाइनों का उपयोग करने के दौरान विशेष रूप से सच है.
कि ischemia की पुष्टि में बंधाव दौरान एक अन्य महत्वपूर्ण कदम प्रभावी ढंग से बालक की बंधाव द्वारा उत्पन्न किया गया है. जोखिम के क्षेत्र में एक अलग, तेजी से रंग बदलने के अवलोकन से इस्कीमिक शर्तों मायोकार्डियम के लक्षित अनुभाग में निर्मित किया गया है कि कुछ किया जाना जरूरी है. लाड प्रभावी ढंग से occluded है अगर मायोकार्डियम के रंग में परिवर्तन कुछ सेकंड के भीतर देखा जाना चाहिए. प्रयोगात्मक endpoints मापा जाता से पहले की प्रक्रिया में अन्य महत्वपूर्ण कदम इस्कीमिक अवधि की अवधि और reperfusion के लिए अनुमति दी समय शामिल है. जनसंपर्क में उल्लेख किया हैotocol, इस्कीमिक अवधि की लंबाई दिल को इस्कीमिक नुकसान के विभिन्न डिग्री के उत्पादन के लिए अलग किया जा सकता है. आम तौर पर ischemia की एक लंबी अवधि के जोखिम के क्षेत्र में और अधिक व्यापक myocyte मौत में परिणाम देगा. reperfusion की लंबाई दिल में fibrotic घावों की उपस्थिति के साथ ही कार्डियक आउटपुट और electrophysiological परिवर्तन के स्थिरीकरण सहित हृदय विकृति विज्ञान के विकास पर प्रभाव पड़ सकता है. इस प्रकार, इन प्रयोगात्मक चरणों की विशिष्ट लंबाई अध्ययन में जांच की विशिष्ट सवालों के पते के अनुरूप होना चाहिए. प्रयोगात्मक endpoints भी ischemia और reperfusion इस्तेमाल किया उस समय और प्रयोग में संबोधित करने की विशिष्ट सवालों की लंबाई के आधार पर चुना जाना चाहिए. हम endpoints के हृदय नुकसान की हद तक का आकलन करने के रूप में रोधगलितांश आकार और सीरम CTnI स्तरों की एलिसा माप को मापने के लिए टीटीसी धुंधला का उपयोग उपस्थित थे. ये endpoints reperfusion के किसी भी लम्बाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि वे विशेष रूप से usef हैंउल कम reperfusion की अवधि (24 घंटे) के लिए कार्यात्मक दोष अभी तक स्थिर नहीं हो सकता है. हम ऐसे डॉपलर इकोकार्डियोग्राफी 15 और कोरोनरी रक्त प्रवाह 16 microsphere माप के रूप में कार्डियक आउटपुट के कार्यात्मक माप, पर यहां विस्तार में जाने नहीं है, इन तरीकों में इस तरह की पुरानी रोड़ा के रूप में लंबी अवधि के प्रयोगों के दौरान हृदय समारोह में परिवर्तन को समझने के लिए उपयोगी होते हैं लाड.
एमआई के माउस मॉडल का उपयोग महान लाभ है जबकि दिल में मैं / आर चोट के अध्ययन के लिए इन तरीकों को सीमाओं वहाँ अब भी कर रहे हैं. प्रमुख शल्य चीरों छाती गुहा में किया जाना चाहिए चूंकि परिणामस्वरूप ऊतक अवरोधों और जुड़े सूजन एमआई प्रभाव को दिल की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं. इन चिंताओं को आंशिक रूप से सभी शल्य कदम के चारों ओर संयुक्ताक्षर की कस के अपवाद के साथ आयोजित की जाती हैं, जहां नकली शल्य चूहों पर नियंत्रण के उपयोग के माध्यम से संबोधित किया जा सकता हैलाड. सर्जरी के आक्रामक प्रकृति द्वारा निर्मित है कि एक और मुद्दा प्रक्रिया के दौरान और बाद होता है कि दर्द और पीड़ा का प्रबंधन करने की जरूरत है. वर्तमान सर्वोत्तम प्रथाओं के अनुरूप है कि दर्द प्रबंधन दृष्टिकोण इस प्रक्रिया में विस्तृत और प्रयोगात्मक जानवरों की पीड़ा को रोकने के लिए आवश्यक हैं. यह anesthetics और दर्दनाशक दवाओं के विभिन्न प्रकार के उपयोग के उनके आवेदन निम्नलिखित cardioprotective प्रभाव हो सकता है कि जानकारी होना जरूरी है. इस प्रकार, यह प्रायोगिक परिणामों की व्याख्या करने के लिए किसी भी जटिलताओं से बचने के लिए, नियंत्रण चूहों, दिखावा सर्जरी के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं, यहां तक कि किसी भी चूहों पर नियंत्रण करने के लिए इन एजेंटों को लागू करने के लिए उपयुक्त. इस दृष्टिकोण के लिए एक और सीमा यह मानव एमआई के साथ जुड़े विकृति का एक सही अनुकरण प्रदान नहीं करता है. अक्सर इस तरह के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल माउस मॉडल कोरोनरी संवहनी रोग, मधुमेह और उच्च रक्तचाप के रूप में मानव में एमआई आबाद कि सह morbidities, से ग्रस्त नहीं है. ऐसामाउस मॉडल में मौजूद नहीं हैं कि जटिलताओं एक विशेष रूप से प्रयोग में अध्ययन किया जा रहा है और परिणाम की व्याख्या करते हैं, इसलिए माना जाना चाहिए रास्ते पर प्रभाव पड़ सकता है. इन मामलों में, इन अंतर्निहित विकृतियों के कुछ प्रदर्शित कि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग अधिक प्रभावी ढंग से यह मानव रोगियों में मौजूद होता है के रूप में रोग मॉडल उपयुक्त हो सकता है. भविष्य में, इस दृष्टिकोण के अन्य पहलुओं अधिक सही मानव एमआई विकृति विज्ञान के अतिरिक्त पहलुओं अनुकरण करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
इन सीमाओं के बावजूद, यहां वर्णित विधि मानव रोगियों में एमआई के वैकृत प्रभाव के ज्यादा simulates कि माउस में स्थानीयकृत मैं / आर चोट का उत्पादन करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं. हमारी तकनीक को और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए नेतृत्व और सर्जरी को आसान बनाने में कर सकते हैं कि बालक की आसान हेरफेर के लिए अनुमति देता है. हालांकि, इस तकनीक के माहिर अभी भी केवल अभ्यास के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है कि महत्वपूर्ण शल्य कौशल की आवश्यकताप्रक्रिया. सर्जरी का आयोजन करते हैं, विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल में विख्यात है जहां स्थानों पर पर्याप्त ध्यान रखते जानवरों के जीवित रहने की दर के रूप में अच्छी तरह से और प्रयोगात्मक परिणामों के reproducibility में सुधार होगा. शल्य दृष्टिकोण में महारत हासिल हो जाने के बाद, इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से एक माउस मॉडल पर उपचारात्मक उपायों की प्रभावकारिता परीक्षण में रुचि रखने वालों के रूप में हृदय शरीर क्रिया विज्ञान पर एमआई के प्रभाव का अध्ययन जांचकर्ताओं के लिए काफी उपयोगी साबित होगा.
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Disclosures
डॉ. नूह Weisleder ट्रिम edicine, इंक में एक संस्थापक और मुख्य वैज्ञानिक अधिकारी है
Acknowledgments
इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान गठिया और Musculoskeletal के राष्ट्रीय संस्थान और त्वचा रोग, पुरस्कार संख्या R01-AR063084 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान का हिस्सा है, द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corp | PS-RT | |
| Light source | Zeiss | KL 1500 LCD | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Miller | HSMS001-1 | |
| Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) | Fine Science Tools | 6100A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Buprenorphine (Buprenex Injectable) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1163-01 | |
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| Betadine Soultion | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA | Kamiya Biomedical Company | KT-58997 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Slim Elongated Needle Holder | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Round Handled Needle Holders | Fine Science Tools | 12075-12 | |
| Omano Trinocular Stereoscope | Microscope.com | OM99-V6 | |
| SB2 Boom Stand with Universal Arm | Microscope.com | V6 | |
| Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y | Kent Scientific Corp | RSP05T16 | |
| Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals | VetEquip, Inc | 901807 | |
| 4-0 silk taper suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk taper suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N |
References
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