Summary
Vi innfører en kirurgisk metode for å indusere eksperimentell ischemi / reperfusjon (I / R) skade å simulere myokardinfarkt (MI) i musemodeller som gir mulighet for større klarhet i posisjonering av ligering av den venstre fremre nedstigende arterie (LAD) for å bedre reproduserbarhet av MI eksperimenter på mus.
Abstract
Akutt eller kronisk hjerteinfarkt (MI) er kardiovaskulære hendelser som resulterer i høy sykelighet og dødelighet. Hvis du definerer de patologiske mekanismer på jobb i løpet av MI og utvikle effektive terapeutiske tilnærminger metodikk for å reproduserbart simulere klinisk forekomst og reflektere de patofysiologiske endringer knyttet til MI. Her beskriver vi en kirurgisk metode for å indusere MI i musemodeller som kan brukes for kortsiktig iskemi-reperfusjon (I / R) skader samt permanent ligation. Den store fordelen med denne fremgangsmåten er for å lette plasseringen av den venstre fremre nedstigende arterie (LAD) for å muliggjøre korrekt ligering av denne arterie for å indusere iskemi i den venstre ventrikkel i hjertet mus. Nøyaktig plassering av ligaturen på LAD øker reproduserbarheten av infarktstørrelsen og dermed gir mer pålitelige resultater. Større nøyaktighet i plassering av ligaturen vil forbedre de vanlige kirurgiske tilnærminger for å simulere MI i mus, thus redusere antall forsøksdyr er nødvendige for statistisk relevante studier og forbedre vår forståelse av mekanismene som produserer hjerteproblemer etter MI. Denne musen modell av MI er også nyttig for preklinisk testing av behandlinger rettet mot hjerteinfarkt skader etter MI.
Introduction
Dyremodeller av myokardinfarkt (MI) er viktige i undersøkelser av komplekset patofysiologien for iskemisk hjertesykdom 1.. Iskemi-reperfusjon (I / R) skade er en stor bidragsyter til hjerteinfarkt skader genereres under MI. Den innledende iskemi skade produsert ved okklusjon av koronarsirkulasjonen kan minimeres i MI pasienter ved bruk av angioplastikk for å gjenopprette perfusjon i tide. Mens denne intervensjonen har sterkt redusert antall dødsfall som følge av akutt MI, restaurering av blodstrømmen inn i iskemiske området resulterer i I / R skade som fører til døden av kardiomyocytter. Dette tapet av myocardial masse bidrar til redusert blodsirkulasjon og progresjon mot hjertesvikt. Dermed er studier av de mekanismer som resulterer i cardiomyocyte døden fra I / R skade en viktig linje med forespørsel i kardiovaskulær forskning. Kirurgisk koronar ligation er en nyttig eksperimentell teknikk for å fremkalle modeller av MI i ulike dyretyper, including rotte, hund og gris. Har Publikasjoner i forskjellige laboratorier lansert ulike metoder for opprettelse av musene hjertemodell av I / R-skade 2,3. For å få innsikt i disse mekanismene må vi ha tilgang til pålitelige dyremodeller som kan gjengi flere aspekter av MI patologi. Utvikling av slike modeller er også avgjørende for å teste terapeutiske tilnærminger for behandling av MI og tilhørende I / R skade.
De fleste av de tilgjengelige kirurgiske teknikker for å simulere MI i forsøksdyr bære kirurgisk disseksjon inn i brysthulen for å eksponere venstre fremre nedstigende arterie (LAD) som deretter occluded av en ligatur for definert periode i tid å produsere den iskemisk hendelse. Da ligaturen som kan fjernes for å muliggjøre reperfusjon av iskemisk området og generering av I / R-skade. En viktig begrensning av disse metodene ved at posisjonen til litteratur om LAD ikke alltid gjengis nøyaktig, noekan føre til variasjoner i graden av MI indusert av denne tilnærming. De fleste tilgjengelige teknikker bare generelt beskrevet den omtrentlige plasseringen av LAD i fremre vegg av hjertet. Som forgrening og retning av LAD kan variere i enkelte dyr plasseringen er ikke alltid fast og kan lett forveksles 4,5, som fører til potensielle komplikasjoner under operasjonen seks. Konsekvensene av uriktig plassering av ligaturen kan løpe fra variasjon i størrelsen på infarktet indusert i den venstre ventrikkel for å fullstendig å kompromittere spesifisiteten av modellen. Her presenterer vi en modifisert metode for hjerteinfarkt I / R og permanent ligation i mus som gir forbedret presisjon av plassering av ligaturen på LAD. Ved å anvende spesifikke fremgangsmåter for innledende snitt og indre disseksjon, så vel som anvendelse av manipuleringer for å løfte atria for å tillate bedre forståelse av LAD og stedet hvor den kommer ut fra aorta. Etablering avstilling på LAD og dens opprinnelse gir anledning til å ligere LAD på en reproduserbar måte. Denne modellen av myocardial I / R og permanent ligering ikke bare reduserer variasjonen i infarktstørrelsen etter kirurgi, kan det også redusere forekomsten av overdreven blødning under operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette dyret protokollen ble godkjent av og er i samsvar med de retningslinjer og bestemmelser fastsatt av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Ohio State University. Alle som er utarbeidet av den lokale IACUC er i samsvar med forsøk med dyr Guide utviklet av Office of Laboratory Animal Welfare ved National Institutes of Health.
En. Anestesi og endotrakeal intubasjon
- Autoklaver alle instrumenter og kirurgiske forsyninger før bruk. Slitasje sterile, engangs-operasjonshansker gjennom hele prosedyren. Opprettholde et sterilt felt gjennom hele prosedyren. Bruk av steril tildekking er foreslått, men ikke vist i videoen for å tillate for bedre visualisering av anatomiske landemerker på musen.
- Plasser hver mus hver for seg i en induksjonskammeret og gi anestesi ved anvendelse av 5% isofluran og oksygen med en strømningshastighet på 0,4 l / min helt til tap av stabiliseringsrefleks og deretter opprettholde the dyr med 2% isofluran i 100% oksygen, med en strøm på 0,4 l / min ved hjelp av en nosecone rør som er koblet til anestesiapparat inntil trakealtuben er på plass. Den isofluran anestesi maskin som brukes bør være tilstrekkelig utluftet og utstyrt med kullfilter for å hindre eksponering for kirurgen å isofluran midler ved fremgangsmåten. Den nosecone er kjent, men ikke vist i videoen for å tillate visualisering av manipulasjoner for å intubere musen.
- Barbere dyrets brystet med et dyr hårklipperen på et annet sted enn operasjonen plattform for å unngå forurensning av kirurgi plassering.
- Plasser musen i liggende stilling på kirurgi plattform for senere intubering. En enkel liten polystyren skum plattform kan tjene som en driftsplattform. Dekk til plattformen med en pre-sterilisert drape å tilveiebringe en steril overflate. Plasser en varmepute mellom plattformen og draperingen for å holde kroppstemperaturen på musene i surgicaprosedyrer l.
- Fest en lengde på 2-0 silke sutur på minst 10 cm til plattformen med tape og deretter sløyfe sutur rundt de fremre øvre fortenner. Plasser kjegle i umiddelbar nærhet (2-3 cm) til kanten av plattformen over nesen til mus. Dra muse stram og fest den til plattformen ved halen med et stykke tape.
- Sikre benene på sidene av kroppen med tråder av tape. Det er viktig at de fremre lemmer er ikke over-strukket så dette kan kompromittere åndedrett.
- Forbered barbert kirurgiske områder med Betadine og alkohol før halsen og brystet snittene blir lagt.
- Plasser plattformen med musehodet peker i retning av operatøren. Skjær en 0,5 cm median livmorhals hud innsnitt. Separer fliker av skjoldbruskkjertelen på deres eidet å eksponere sternohyoideus muskel hvor luftrøret kan sees under muskelen.
- Fjern den indre nålen av en 18 gauge trokar slik at den kan brukes som et intubasjon tube. Nålen punkt kan tjene som en holder og en cm av det ytre rør kan tjene som trakealtuben.
- Hold tungen på mus med buede tang i den ene hånden og flytte den litt oppover. Se luftrøret gjennom livmorhals huden innsnitt. Bruk den andre hånden til å forsiktig sette inn intubasjon røret før røret er sett inne i luftrøret.
- Så snart røret er i luftrør, beveger de buede tang i annen side mot røret, og raskt å fjerne den indre nålen. Dersom røret ikke kan settes inn i tracheal, bør røret trekkes ut for å unngå produksjon av pusteproblemer. Det er viktig å påpeke at spissen av røret når det er i nærheten av halsen for å unngå å sette røret inn i øsofagus i stedet for trakea.
2. Ventilasjon og fiksering
- Kunstig ventilasjon med en respirator dyr lufting 2% isofluran i oksygen med en strømningshastighet på 0,4 L / min. Bruk en modifisert Y-shape-kontakt for å koble intubasjon røret med ventilator. Den korrekte posisjonering av trakealtuben kan bekreftes ved å bedømme den symmetriske brystutvidelse.
- Sett tidevolum på 260 pl / slag-og ventilasjonsraten er 130 slag per minutt, som kan justeres til det kroppsvekt av et bestemt muse om nødvendig.
- Fjern tapen på halen og slå musen forsiktig for å plassere den i en høyre lateral decubitus posisjon for den påfølgende operasjonen. Bruk tape for å feste hale og ben til plattformen på nytt.
- Sett rektal probe for å overvåke kroppstemperatur og justerer varmepute for å holde temperaturen rundt 37 ° C.
- Sikre sonden til plattformen ved hjelp av tape. Injisere bupivacaine subkutant ved innsnitt området til nummen området før snittet er gjort.
Tre. Torakotomi
- Gjør en skrå snitt som er ca 1 cm lang på et område 2 mm fra venstresternalrand i retningen hvor den venstre foran leg møter legemet (ca. 1-2 mm under der ben og kropp delta). Den overfladiske thorax vein er i nærheten av dette området, og snittet bør gjøres slik at den laterale slutten av snittet går opp til, men ikke skjære i, venen.
- Skjær om brystmuskelen å eksponere ribbeina under. Under dette trinn unngår utilsiktet skade på fartøyet. Hvis blødningen ikke forekomme, bruke bomull applikatorer å stoppe blødninger før du går videre til neste trinn 7.
- Visual ribbeina og blåse lunge gjennom den tynne og semitransparent brystveggen. Åpne brysthulen ved hjelp av kirurgisk saks for å lage en 6-8 mm snitt i tredje interkostalrom. Dette snittet skal være minimum 2 mm fra sternalrand hvor den interne thorax arterie ligger. Skade på arterien vil produsere kraftige blødninger som er vanskelig å kontrollere.
- Sett de pre-steriliserte hjemmelagde bryst haker into innsnitt og forsiktig trekke tilbake for å åpne innsnitt, slik at det er omtrent 8-10 mm bred samtidig er forsiktig for å unngå lungen. De haker skal være knyttet til den kirurgiske plattform med pinner.
- På dette punktet hjertet skal være synlig, vil imidlertid lungen fremdeles dekke en del av hjertet. Plukk opp hjerteposen forsiktig med buede tang, trekke det fra hverandre, og skyv vevet bak haker. I løpet av denne manipulasjon lungen vil løftes opp og vekk fra hjertet.
4. Posisjonering LAD
- Lokaliser LAD på overflaten av hjertet gjennom en disseksjon mikroskop. Den LAD renner ned på midten av hjerteveggen fra i nærheten av toppen av hjertet ned gjennom den venstre ventrikkel. Den LAD vises lyse rødt, og vil være pulserende sterkt. Venen her er noen ganger forveksles med LAD, men riktig belysning kan bidra til å skille de to fartøyene. Hvis belysningen er for lys kan det være vanskelig å sette pris på den fargeforskjeller mellom fartøyene.
- Bruk av en steril bomullsdott fragment med en diameter av omtrent 1-2 mm for å forberede LAD for ligering. Plasser bomull mellom venstre atrium og venstre ventrikkel, som vil løfte venstre atrium og hjelpe utsett LAD og avklare sin posisjon. Hvis LAD ikke kan lokaliseres, kan fragmentet skyves ytterligere i så venstre atrium er løftet enda høyere for å avsløre aorta der LAD stammer.
5. LAD Ligation
- Den ideelle plasseringen for ligaturen er ca 2 mm lavere enn tuppen av venstre aurikkel. Den pulmonale stammen kan anvendes som en markør for å identifisere venstre øremuslingen. Alternativt kan ligeringsposisjonen bli visualisert som et punkt på 1-2 mm fra forgrening av den venstre cirkumflekse. Bruk buet pinsett for å forsiktig press på et sted umiddelbart under den tiltenkte ligeringspunktet. Dette vil gjøre det lettere å se arterien, og vil også bidra til å holde hjertet på plassog forenkle binde ligaturen. Ikke trykk med pinsett for mer enn fem sekunder av gangen og unngå kompresjon av hjertet som kan endre pumping.
- Bruk en konisk nål til å passere en 6-0 silke sutur under LAD mens observere med en dissekere mikroskop. Sett nålen under arterie med presisjon som nålen vil gå inn i venstre ventrikkel kammeret hvis den plasseres for dypt eller skade LAD hvis nålen er for grunt. Hvis LAD er skadet fjerne nålen og sy igjen LAD å kontrollere blødning, men hvis blødningen ikke kan kontrolleres er det best å avlive dyret.
- Lag en løs dobbel knute med sutur, etterlot seg en 2-3 mm diameter sløyfe gjennom som en 2-3 mm lang bit av PE-10 rør er plassert åtte.
- Stram sløyfe rundt arterien og rør deretter feste løkken ved å knytte en ekstra slipknot, tar seg ikke å skade ventrikkel veggen. For permanent ligation, direkte knytte LAD med enknute ni. Bekreft okklusjon av LAD ved å sjekke for utseendet til en lysere farge i fremre vegg av venstre ventrikkel som skal vises i løpet av få sekunder etter ligering.
- Ta rullen og lukke såret midlertidig ved å klemme huden sammen med en klypen. Lengden av tid som iskemi opprettholdes er avhengig av eksperimentet, men er ofte 20, 30, 45 eller 60 min. Musen forblir på ventilator for varigheten av LAD arterieokklusjon.
6. Reperfusjon
- Etter iskemi periode fjerne bulldog klipp og sette inn bryst haker å utsette ligaturen. Løse knuten og fjerner PE-10 rør. Bekreft reperfusjon ved å observere en avkastning på den rosa-rød farge av fremre vegg av venstre ventrikkel etter 15-20 sek.
- La suturen på plass, hvis 2% trifenyl tetrazolium-klorid (TTC) og blå flekker vil bli utført etter reperfusjon. Ved farging ikke er nødvendig, kan sutur be fjernet.
- Den reperfusjon tid vil være avhengig av eksperimentet, vanligvis omfatter fra 1 time til 24 timer.
7. Chest Closure og Postoperativ Care
- Lukk brysthulen ved sy stenge snittet i 3. interkostalrom med 4-0 silke sutur. Det er viktig at lungene er klare for sutur og ikke bli fanget som den 3. og 4 th ribbeina er sys sammen. Mens binde sutur knop det er nyttig å legge litt press på brystet med nålholderen å minimere alle rom luft som kan være fanget i brysthulen.
- Lukk alle lag av muskler med kontinuerlige sting bruker 4-0 silke. Bruk nylon sting for å lukke huden med en kontinuerlig sutur. Alternativt, kan huden være lukket med avbrutte sutur.
- Når suturering er fullført opphører strømmen av isofluran mens oksygen fortsetter å flyte. Når musen beveger sine værhår eller hale det, skuldd begynne å gjøre forsøk på å puste spontant. Fjern musen fra ventilator med intubasjon røret fortsatt holdt i luftrøret.
- Observere dyret nøye før musen gjenopptar et normalt pustemønster og deretter extubate musen. Røret bør fjernes sakte for å unngå aspirasjon av munnhulen sekret.
- Bekreft musen er ikke på noen åndenød ved å observere det for en annen 3-5 minutter før du returnerer det til et bur. Ved tegn på dehydrering er observert etter operasjonen, gir opp til 0,5 ml sterilt saltvann ved intraperitoneal injeksjon.
- For post-operativ analgesi, gi et opioid smertestillende middel (buprenorfin, 0,1 mg / kg) subkutant (SC) før dyret er oppegående, og deretter gi en ekstra dose hver 4 til 6 time for de neste 24 timer. Sjekk dyret tegn på stress på 12 timer etter operasjonen. Simulering av hjerteinfarkt ved bruk av overlevelses kirurgi krever vurdering av smerte og nød etter utvinning fra surgery. Den nåværende aksepterte beste praksis er å gi analgesi for den første 24 timer etter en invasiv prosedyre med flere doser gitt som garantert på grunn av vekttap eller tegn på smerte. For permanent ligering, bør kroppsvekt spores daglig for å bidra til å måle dyrets utvinning.
- Ibuprofen (Motrin), et ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament (NSAID) med anti-inflammatorisk, smertestillende og antipyretisk aktivitet, eller andre steroide antiinflammatoriske midler, kan være anordnet i dyrets drikkevann som en 0,2 mg / ml oppløsning i to dager før operasjonen, og opp til en 7 dager etter operasjonen i sammen med buprenorfin til å håndtere noen ekstra smerter / ubehag.
8. Måling av hjerteinfarkt Size
- Anesthetize og intubere musen på slutten av ønsket reperfusjon tid. Skjær brystet huden i midtlinjen til xyphoid. Åpne magen og mellomgulvet under brystkassen og fra begge sider av medioklavikularlinje. <li> blottlegge hjertet, og deretter re-ligere LAD på samme sted. Cannulate aorta så 10% PHTHALO Blå kan sakte injiseres direkte inn i aorta å flekke hjertet for avgrensning av iskemisk sonen fra nonischemic sone 10.
- Raskt avgiftsdirektoratet hjertet og vaske den i 30 mM KCl (kaliumklorid løsning) for å stanse hjerteslag og gir mulighet for mer konsekvent snitting. Fryse hjertet i minst 4 timer ved -20 ° C og kuttet midt i skiver på 1 mm ved hjelp av en hjertematrise snittenhet 11..
- Inkuber hjertestykker med 2% TTC ved 37 ° C i 40 min. Infarktet området er avgrenset som et hvitt område mens levedyktig vev flekker rødt.
- Fest farget skiver med 10% formaldehyd over natten, noe som vil bidra til å øke kontrasten mellom infarktområdet og normalt vev. Fotografere skiver og beregne arealet i fare (AAR), den nonischemic sone og infarktområdet ved hjelp ImageJ programvare.
Mål kardial troponin I (cTnI) nivåer i serum hos mus ved å skaffe blod fra portvenen, og deretter isolere serum ved sentrifugering. Serum cTnI nivåene er så bestemt med en kvantitativ hurtig cTnI assay 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter 24 timer etter reperfusjon, analyse av infarktstørrelsen og området-på-risk (AAR), ved PHTHALO blått fargestoff og trifenyl tetrazolium-klorid (TTC), ligering av LAD kan bekreftes ved å observere blanchering av myokardialt vev distalt for suturen så vel som dysfunksjon av den fremre vegg. Reperfusjon kan verifiseres ved tilbakeføring av rød farge til myokardialt vev og demonstrasjon av noen bedring i fremre vegg bevegelse.
Infarkt områder (hvit) skal kunne skilles fra områder med høy risiko (rød) og området ikke er i fare (blå). Anvendelse av PHTHALO blå fargestoff (figur 1A) gir mulighet for løsning av den delen av hjertet der okklusjon av LAD, mens hjerter som ikke er farget med blått fargestoff kan bare viser det området av infarktet (figur 1B). Infarktstørrelse er avhengig av varigheten av ischemi. Viktigere, hjerte troponin I (cTnI) nivåene er lave i humbug opererte dyr som gjennomgikk allekirurgiske prosedyrer med unntak av iskemi og reperfusjon, sammenlignet med dyr som gjennomgikk hjerteinfarkt (figur 2). Dette indikerer sham kirurgi ga ikke signifikant kardial patologi mens iskemi / reperfusjonsskade var tilstrekkelig til å gi heving av dette mye brukt biomarkør for MI.
Figur 1:. Kvantifisering av omfanget av infarktet etter LAD okklusjon kirurgi (A) Representative bilde av villtype mus hjertesnitt fra dyr underkastet 45 minutters ischemi og 24 timers reperfusjon. Injeksjon av blått fargestoff muliggjør vurdering av de ikke-ischemiske sonen av hjertet som ikke er utsatt for et infarkt. (B) Et representativt bilde av et hjerte, hvor blått fargestoff injisereså understreke området-at-risk (AAR), som vises røde, og infarktområdet, som er hvit. Områdene av hver region er beregnet som prosentandeler av den totale venstre ventrikkel (LV) området multiplisert med den totale vekt av den skive. for å vise større bilde.
Figur 2:. Anvendelse av kardiale troponin nivåer som et mål på graden av hjerteinfarkt Et stolpediagram av hjerte troponin I (CTnl) nivåer hos mus underkastet 45 minutters ischemi og reperfusjon i 24 timer (I / R) eller simulert operasjon som en kontroll. Blod ble oppsamlet fra portvenen ved 24 timer etter operasjonen fra tre dyr i hver gruppe. Nivåene av cTnI er signifikant forhøyet idyr følgende I / R skade (9,195 ± 0,07146) sammenlignet med sham kontroll dyr (1.195 ± 0,06651). Data blir presentert som betyr ± SEM og *** angir P <0,0001 sammenligne humbug kontroll og I / R-grupper av t-test. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muse myokardiskemi-reperfusjon modeller er en effektiv metode for kardiovaskulær forskning for å simulere klinisk akutt eller kronisk hjertesykdom 13,14. Betydelig innsats har blitt brukt til å utvikle og foredle kirurgiske tilnærminger som produserer iskemiske hendelser og reperfusjon skade i hjertene til flere forskjellige typer dyr. Mens det er spesielle fordeler til bruk av ulike dyr systemer, har musen egenskaper som har ført til omfattende interesse for å produsere hjerteinfarkt I / R i mus hjerte. En av de viktigste grunnene er den genetiske tractability av musen system. Den omfattende utvalg av genmodifiserte dyr som er tilgjengelige, og det er relativt enkelt etter som nye modeller kan genereres for å løse spesifikke spørsmål, har ingen match i andre dyremodell systemer. En annen årsak til den økende bruken av mus i kardiovaskulære studier er økt tilgjengelighet av kirurgisk utstyr og andre eksperimentelle verktøy spesifikkeally utformet for bruk i mus. Den relativt lave prisen på musemodeller er også en viktig bidragsyter til deres anvendelse i studiene. Det økende behov for fasthet i prekliniske studier nødvendiggjør bruk av flere dyr, som kan være mer realistisk når færre ressurser som er nødvendige for å inkludere et passende antall dyr. Mens bruken av musemodellen har flere fordeler er det ulemper også, særlig når man vurderer de divergerende sider av mus-og human sirkulasjonsfysiologi. Mange større dyremodeller, som for eksempel hund og gris, nærmere etterligne de fleste aspekter av menneskets sirkulasjonsfysiologi enn musa. En annen ulempe er at størrelsen på mus, manipulering av den mindre hjertet hos mus krever en høyere grad av kirurgisk dyktighet, spesielt i å finne den LAD og reproduserbart ligering av den til å produsere en enhetlig infarkt-området i den venstre ventrikkel. Fremgangsmåten presentert her, kan tilveiebringe en betydelig forbedring i identifikasjons ennd ligation av LAD. Våre konsistente resultater i mengden av cTnI frigjøring fra hjertet (Figur 2) viser at vi reproduserbart kan generere infarkt av tilsvarende størrelse og grad av kardiomyocytter død.
En sentral del av operasjoner for å indusere eksperimentelt hjerteinfarkt er den klar identifikasjon og ligering av LAD. I vår tilnærming detaljert her har vi forbedret metode for å identifisere og få tilgang til LAD, noe som åpner for mer konsekvent plassering av ligation på fartøyet. Under operasjonen, gjør vi bruk av et lite stykke steril bomull for å løfte venstre atrium opp og fullt utsett LAD, som klargjør stilling LAD og forenkler ligation av LAD. Dette er et kritisk trinn for teknikken, og en differensieringspunkt fra andre metoder. Innføringen av disse endringene for LAD ligation bør tillate mer reproduserbare resultater under simulering av MI i musemodeller. Mens forbedret presisjon i stedetform av ligaturen skal forbedre konsistensen i størrelsen på infarktet genereres det fremdeles er viktig å måle i fare-sonen ved hjelp av perfusjon av PHTHALO blå fargestoff. Dette gjelder særlig ved bruk av genmodifisering mus linjer der manipulering av genuttrykk kan medføre endringer i responsen av blodårene i hjertet ligering.
Et annet kritisk punkt ved ligering i bekrefter at ischemia har blitt effektivt generert av ligering av LAD. Observasjon av en distinkt, hurtig fargeendring i området av risikoen er viktig for å være sikker på at ischemiske tilstander har blitt produsert i det målrettede delen av hjertemuskelen. Endringen i farge av myokard bør sees i løpet av noen få sekunder hvis LAD er effektivt okkludert. Andre kritiske trinn i fremgangsmåten innebære at varigheten av den ischemiske perioden, og den tid som tillates for reperfusjon før forsøkspunktene måles. Som nevnt i protocol, kan lengden av den ischemiske perioden varieres for å gi forskjellige grader av iskemisk skade på hjertet. Vanligvis er en lengre periode med ischemi vil resultere i mer omfattende myocyte død i løpet av risikosonen. Lengden av reperfusjon kan ha effekter på utviklingen av hjerte-patologien, inklusive forekomsten av fibrotiske lesjoner i hjertet, så vel som stabilisering av hjertets minuttvolum og elektrofysiologiske endringer. Dermed må den spesifikke lengden av de eksperimentelle trinnene tilpasses for å møte de spesifikke spørsmål undersøkt i studien. De eksperimentelle endepunktene bør også velges basert på lengden av iskemi og reperfusjon perioder som benyttes og de spesifikke spørsmål for å tas opp i eksperimentet. Vi presenterer anvendelse av TTC farging for å måle infarktstørrelsen og ELISA-målinger av serum CTnI nivåer som endepunkter for å vurdere graden av skade på hjertet. Disse endepunkter kan brukes i lengre reperfusjon, men de er spesielt useful for kortere reperfusjons perioder (24 timer) hvor funksjonelle defekter kan ikke ha stabilisert seg ennå. Selv om vi ikke gå i detalj her på funksjonelle målinger av minuttvolumet, som Doppler ekkokardiografi 15 og mikrosfære målinger av koronar blodstrøm 16, disse tilnærmingene er nyttige for å forstå endringene i hjertefunksjonen under lengre sikt eksperimenter, som for eksempel kronisk okklusjon av LAD.
Mens bruk av musemodeller av MI har store fordeler for studiet av I / R skade i hjertet er det fortsatt begrensninger i disse tilnærmingene. Ettersom store kirurgiske inngrep må skje inn i brysthulen den resulterende vev forstyrrelser og inflammasjon assosiert kan påvirke responsen av hjertet til MI effekter. Disse problemer kan delvis løses ved bruk av simulert kirurgisk kontroll-mus, hvor alle former for kirurgiske fremgangsmåten er alle utført med unntak av at tilstramming av ligatur rundtLAD. Et annet problem som er produsert av invasiv kirurgi er behovet for å håndtere smerte og lidelse som oppstår under og etter inngrepet. Smerte ledelse tilnærminger som er i samsvar med gjeldende beste praksis er beskrevet i denne prosedyren, og er nødvendig for å hindre lidelse av forsøksdyr. Det er viktig å være klar over at bruk av mange forskjellige typer anestesi og analgetika kan ha av hjertet etter sin søknad. Dermed det riktig å anvende disse midlene til kontroll mus, selv noen kontroll mus som ikke brukes for humbug operasjoner, for å unngå eventuelle komplikasjoner til tolkning av eksperimentelle resultater. En annen begrensning for denne tilnærmingen er at den ikke gir et perfekt simulering av patologi forbundet med menneskelig MI. Ofte musemodeller som brukes for slike eksperimenter ikke lider av andre sykdommer som ligger til grunn for MI hos mennesker, for eksempel koronar karsykdom, diabetes og hypertensjon. Sliktkomplikasjoner som ikke finnes i mus modell kunne ha effekter på de banene som blir studert i et bestemt eksperiment, og bør derfor vurderes når man tolker resultatene. I slike tilfeller, kan bruken av genetisk modifiserte mus som viser noen av disse underliggende patologi være hensiktsmessig for mer effektivt å modellere sykdommen slik den ville presentere i humane pasienter. I fremtiden, kan andre aspekter ved denne tilnærmingen endres til mer nøyaktig simulere flere aspekter av menneskets MI patologi.
Til tross for disse begrensninger, metodene beskrevet her for å representere en effektiv metode for å produsere lokal I / R-skade hos mus som simulerer deler av de patologiske effekter av MI i humane pasienter. Vår teknikk gjør det mulig for enklere manipulering av LAD som kan føre til mer reproduserbare resultater og forenkle operasjonen. Men å mestre denne teknikken krever fortsatt betydelig kirurgisk ferdighet som bare kan oppnås gjennom praktisering avfremgangsmåten. Tar tilstrekkelig hensyn når du gjennomfører operasjonen, spesielt på steder der dette er angitt i protokollen, vil forbedre overlevelsen av dyr også, og reproduserbarhet av de eksperimentelle resultatene. Når kirurgisk tilnærming er mestret, vil denne protokollen være ganske nyttig for etterforskerne som studerer effekten av MI på kardiovaskulær fysiologi, samt de som er interessert i å teste effekten av terapeutiske intervensjoner på en musemodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Noah Weisleder er grunnlegger og Chief Scientific Officer ved TRIM-edicine, Inc.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of leddgikt og muskel-og hudsykdommer, en del av National Institutes of Health, i henhold Award Antall R01-AR063084. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corp | PS-RT | |
| Light source | Zeiss | KL 1500 LCD | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Miller | HSMS001-1 | |
| Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) | Fine Science Tools | 6100A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Buprenorphine (Buprenex Injectable) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1163-01 | |
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| Betadine Soultion | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA | Kamiya Biomedical Company | KT-58997 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Slim Elongated Needle Holder | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Round Handled Needle Holders | Fine Science Tools | 12075-12 | |
| Omano Trinocular Stereoscope | Microscope.com | OM99-V6 | |
| SB2 Boom Stand with Universal Arm | Microscope.com | V6 | |
| Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y | Kent Scientific Corp | RSP05T16 | |
| Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals | VetEquip, Inc | 901807 | |
| 4-0 silk taper suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk taper suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N |
References
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. J Surg Res. 162, 239-249 (2010).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107, 1445-1453 (2010).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. , (2011).
- Salto-Tellez, M., et al. Myocardial infarction in the C57BL/6J mouse: a quantifiable and highly reproducible experimental model. Cardiovasc Pathol. 13, 91-97 (2004).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16, 41-44 (2005).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Exp Physiol. 89, 497-505 (2004).
- Shao, Y., Redfors, B., Omerovic, E. Modified technique for coronary artery ligation in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).
- Nossuli, T. O., et al. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, 1049-1055 (2000).
- Cozzi, E., et al. Ultrafine particulate matter exposure augments ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, 894-903 (2006).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. J Vis Exp. , 3896 (2012).
- Nagarajan, V., Hernandez, A. V., Tang, W. H. Prognostic value of cardiac troponin in chronic stable heart failure: a systematic review. Heart. 98, 1778-1786 (2012).
- Borst, O., et al. Methods employed for induction and analysis of experimental myocardial infarction in mice. Cell Physiol Biochem. 28, 1-12 (2011).
- Diepenhorst, G. M., van Gulik, T. M., Hack, C. E. Complement-mediated ischemia-reperfusion injury: lessons learned from animal and clinical studies. Ann Surg. 249, 889-899 (2009).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7, 41691 (2012).
- Bamberg, F., et al. Accuracy of dynamic computed tomography adenosine stress myocardial perfusion imaging in estimating myocardial blood flow at various degrees of coronary artery stenosis using a porcine animal model. Invest Radiol. 47, 71-77 (2012).
