Summary
Vi indfører en kirurgisk metode til at inducere eksperimentel iskæmi / reperfusion (/ R) skader simulere myokardieinfarkt (MI) i muse-modeller, der giver mulighed for mere klarhed i positionering af ligering på venstre forreste nedadgående arterie (LAD) for at forbedre reproducerbarheden af MI eksperimenter i mus.
Abstract
Akut eller kronisk myokardieinfarkt (MI), er kardiovaskulære hændelser resulterer i høj sygelighed og dødelighed. Etablering de patologiske mekanismer på arbejde i løbet MI og udvikling af effektive terapeutiske tilgange kræver metode til reproducerbart simulere den kliniske forekomst og afspejler de patofysiologiske ændringer i forbindelse med MI. Her beskriver vi en kirurgisk metode til at inducere MI i musemodeller, der kan bruges til kortvarig iskæmireperfusion (I / R) skade samt permanent ligatur. Den største fordel ved denne fremgangsmåde er at lette placeringen af den venstre forreste nedadgående arterie (LAD) for at muliggøre nøjagtig ligering af denne arterie at inducere iskæmi i den venstre ventrikel af musen hjerte. Præcis positionering af ligatur på LAD øger reproducerbarhed infarktstørrelse og frembringer således mere pålidelige resultater. Større præcision i anbringelsen af ligatur vil forbedre standard kirurgiske metoder til at simulere MI i mus, thus at reducere antallet af forsøgsdyr er nødvendige for statistisk relevante undersøgelser og forbedre vores forståelse af de mekanismer, der producerer hjertedysfunktion efter MI. Denne musemodel af MI er også nyttigt for den prækliniske afprøvning af behandlinger rettet mod myokardie skade efter MI.
Introduction
Dyremodeller for myokardieinfarkt (MI) er vigtige i forskning af den komplekse patofysiologi iskæmisk hjertesygdom 1. Iskæmireperfusion (I / R) skader er en stor bidragyder myokardiets skader, der genereres i løbet af MI. Den oprindelige iskæmi skade produceret af okklusion af koronar cirkulation kan minimeres i MI patienter ved brug af ballonudvidelse at genoprette perfusion i tide. Mens dette indgreb i høj grad har reduceret antallet af dødsfald som følge af akut MI, restaurering af blodgennemstrømningen i de iskæmiske område resultater i I / R skade, der fører til død cardiomyocytes. Dette tab af myokardiemasse bidrager til nedsat minutvolumen og progression i retning af hjertesvigt. Således undersøgelse af de mekanismer, der resulterer i cardiomyocyte død fra I / R skade er en vigtig linje undersøgelsesudvalg i kardiovaskulær forskning. Kirurgisk koronar ligatur er en nyttig eksperimentel teknik til at fremkalde modeller af MI i forskellige animalske typer, including rotte, hund og gris. Publikationer i forskellige laboratorier har indført forskellige metoder på etableringen af musene hjerte model af I / R skade 2,3. For at få indblik i disse mekanismer, skal vi have adgang til pålidelige dyremodeller, der kan gengive flere aspekter af MI patologi. Udvikling af sådanne modeller er også afgørende for at teste terapeutiske tilgange til behandling af MI og tilhørende I / R skade.
De fleste af de aktuelt tilgængelige kirurgiske teknikker til at simulere MI hos forsøgsdyr involverer kirurgisk dissektion ind i brysthulen at eksponere venstre forreste nedadgående arterie (LAD), som derefter tillukkes af en ligatur for fastsat periode tid til at producere den iskæmiske begivenhed. Så at ligatur kan fjernes for at give mulighed for reperfusion af det iskæmiske område og generering af I / R-skade. En væsentlig begrænsning ved denne metode i, at positionen af litteraturen om LAD ikke altid nøjagtigt gengivet, somkan føre til variation i sværhedsgraden af MI induceres af denne fremgangsmåde. De fleste tilgængelige teknik kun beskrevet generelt den omtrentlige placering af LAD i den forreste væg af hjertet. Som forgreningen og retning af LAD kan variere i individuelle dyr placeringen ikke altid fast og let kan forveksles 4,5, hvilket fører til potentielle komplikationer under operationen 6. Følgerne af forkert placering af ligatur kan køre fra variation i størrelsen af infarkt induceret i den venstre ventrikel til helt at kompromittere specificiteten af modellen. Her præsenterer vi en modificeret metode til myokardie I / R og permanent ligation i mus, der giver mulighed for forbedret nøjagtighed af placering af ligatur på LAD. Ved at anvende specifikke strategier for den indledende incision og intern dissektion, samt brugen af manipulationer at løfte forkamre at muliggøre en bedre forståelse af LAD og stedet, hvor det tappes fra aorta. Etablering afposition på LAD og dets oprindelse giver mulighed for at ligere LAD på en reproducerbar måde. Denne model af myocardial I / R og permanent ligering ikke kun nedsætter variationen i infarktstørrelse efter kirurgi, kan det også mindske forekomsten af kraftig blødning under operationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette dyr protokol blev godkendt af og er i overensstemmelse med de retningslinjer og regler fastsat af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på The Ohio State University. Alle politikker, der er udviklet af den lokale IACUC er i overensstemmelse med dyreforsøg Guide er udviklet af Office of Laboratory Animal Welfare på National Institutes of Health.
1.. Anæstesi og endotracheal
- Autoklavér alle instrumenter og kirurgiske forsyninger før brug. Bær sterile engangsfiltre kirurgiske handsker hele proceduren. Oprethold et sterilt felt under hele proceduren. Anvendelse af et sterilt afdækningsstykke er foreslået, men ikke vist i videoen at give mulighed for bedre visualisering af anatomiske kendetegn på musen.
- Placer hver mus enkeltvis i en induktion kammer og giver anæstesi ved anvendelse af 5% isofluran og oxygen med en strømningshastighed på 0,4 l / min, indtil tab af stabilitetsrefleks og derefter opretholde the dyr med 2% isofluran i 100% oxygen med et flow på 0,4 l / min ved hjælp af en næsekeglens rør forbundet til anæstesi apparatet indtil trakeale rør er på plads. Den isofluran anæstesi maskine, der anvendes, bør være passende ventileret og udstyret med kulfiltre for at minimere eksponeringen af kirurgen at isofluran dampe under proceduren. Næsekeglen er bemærket, men ikke vist i videoen for at muliggøre visualisering af manipulationer intubationstid musen.
- Barbere dyrets bryst med et dyr hårklipper et andet sted end operationen platform til at undgå forurening af kirurgi placering.
- Anbring musen i liggende stilling på operation platform for efterfølgende intubation. En simpel lille polystyrenskum platform kan tjene som et operativsystem platform. Dæk platform med en præ-steriliseret afdækningsstykke til at tilvejebringe en steril overflade. Placer en varmepude mellem platformen og drapere at opretholde kroppens temperatur musene i surgical procedurer.
- Vedhæft en længde på 2-0 silkesutur på mindst 10 cm til platformen med tape og derefter loop sutur omkring den forreste øverste fortænder. Placer keglen i umiddelbar nærhed (2-3 cm) på kanten af platformen over næsen på musen. Træk musen stram og fastgør den til platformen i halen med et stykke tape.
- At fastgøre benene til siderne af kroppen med dele af båndet. Det er vigtigt, forlemmerne ikke over-strakt, da dette kan kompromittere åndedræt.
- Forbered den barberede kirurgiske sites med Betadine og alkohol før hals og bryst snit er lavet.
- Placer platform med musen hovedet pegende i retning af operatøren. Skær en 0,5 cm median livmoderhalskræft hudincision. Adskil lapper i skjoldbruskkirtlen på deres isthmus at eksponere sternohyoideus muskel, hvor luftrøret kan ses under musklen.
- Fjern den indre nål af en 18 gauge trokar, så det kan bruges som en intubtion røret. Nålespidsen kan tjene som en holder og 1 cm fra det ydre rør kan tjene som den trachealtube.
- Hold tungen af musen med buede pincet i den ene hånd og flytte det lidt opad. Se luftrøret gennem cervikal incision i huden. Med den anden hånd til forsigtigt at indsætte intubationsrøret indtil røret ses inde i luftrøret.
- Så snart røret er i trakeal, bevæge buede pincet i anden hånd mod røret og hurtigt at fjerne den indre nål. Hvis røret ikke kan indsættes i trakeal bør røret trækkes ud for at undgå at producere åndedrætsproblemer. Det er vigtigt at påpege spidsen af røret, når det er tæt på halsen for at undgå at indsætte røret i spiserøret i stedet for luftrøret.
2.. Ventilation og fiksering
- Giv kunstig ventilation med et dyr respirator udluftning 2% isofluran i oxygen med et flow på 0,4 l / min. Brug en modificeret Y-shape-stik til at forbinde intubationsrøret med ventilatoren. Den korrekte positionering af trachealtube kan bekræftes ved at vurdere den symmetriske brystet ekspansion.
- Indstil tidalvolumen på 260 ul / slagtilfælde og ventilation rate er 130 slag i minuttet, som kan justeres efter legemsvægt af en bestemt mus, hvis nødvendigt.
- Fjern tapen på halen, og drej musen forsigtigt at placere den i en ret lateral decubitus position for den efterfølgende operation. Med tape for at sikre hale og ben til platformen igen.
- Sæt rektal sonde til at overvåge kropstemperaturen og justere varmepude til at holde temperaturen omkring 37 ° C.
- Fastgør sonden til platform ved hjælp af tape. Sprøjt bupivacain subkutant på incisionssted at dulme området, før snittet er lavet.
3. Torakotomi
- Lav en skrå snit, der er ca 1 cm lang på et site 2 mm væk fra venstreribbenskant i retning af, hvor forreste venstre ben møder kroppen (ca. 1-2 mm nedenfor, hvor ben og krop deltage). Den overfladiske thorax vene er i nærheden af dette websted, og snittet skal foretages således, at den laterale ende af snittet går op til, men ikke skåret i, venen.
- Skær selv bryst muskler til at afsløre ribbenene nedenunder. Under dette trin undgå uheld af fartøjet. Hvis der opstår blødning, brug bomuld applikatorer til at stoppe blødning, før du går videre til næste trin 7.
- Visualiser ribbenene og oppumpning lunge gennem den tynde og semitransparent brystvæggen. Åbn brysthulen hjælp kirurgiske sakse til at lave en 6-8 mm snit i tredje interkostale mellemrum. Dette snit bør være mindst 2 mm fra brystbenet grænse, hvor den interne thorax arterie er placeret. Skader på arterien vil frembringe kraftig blødning, der er vanskelig at kontrollere.
- Indsæt de præ-steriliserede hjemmelavet bryst retraktorer into snittet og træk forsigtigt tilbage for at åbne snittet, så det er omkring 8-10 mm bred og samtidig være omhyggelig med at undgå lungen. Retraktorerne skal fastgøres til den kirurgiske platform med stifter.
- På dette punkt i hjertet skal være synlig, vil imidlertid lungen stadig dække en del af hjertet. Saml hjertesækken forsigtigt med buede pincet, trække det fra hinanden, og skub vævet bag retraktorer. Under denne manipulation lungen vil løfte op og væk fra hjertet.
4.. Positionering LAD
- Find LAD på overfladen af hjertet gennem et dissektionsmikroskop. LAD løber ned gennem midten af hjertet væg fra nær toppunktet af hjertet ned gennem den venstre ventrikel. LAD vises lyse rødt og vil kraftigt blive pulsere. Venen her er undertiden forveksles med LAD dog ordentlig belysning kan hjælpe med at skelne mellem de to skibe. Hvis lyset er for lyst kan det være svært at værdsætte farvenforskelle mellem fartøjer.
- Brug en steril vatkugle fragmentet med en diameter på ca 1-2 mm for at forberede LAD til ligering. Placer bomuld mellem venstre forkammer og venstre ventrikel, hvilket vil løfte venstre forkammer og hjælpe udsætte LAD og præcisere sin holdning. Hvis LAD ikke kan lokaliseres, kan fragmentet yderligere skydes så venstre atrium løftes endnu højere for at afsløre aorta hvor LAD stammer.
5.. LAD æggelederne
- Den ideelle placering for ligatur er cirka 2 mm lavere end spidsen af venstre forkammer. Truncus kan anvendes som en markør til at identificere venstre forkammer. Alternativt kan ligering position visualiseres som et punkt 1-2 mm væk fra forgreningen af den venstre circumflexa. Brug buede pincet til forsigtigt at lægge pres på et sted umiddelbart under den tilsigtede ligeringspunktet. Dette vil gøre det lettere at se arterie og vil også hjælpe med at holde hjertet i stedetog forenkle binde ligatur. Må ikke lægge pres med pincet for mere end 5 sekunder ad gangen og undgå kompression af hjertet, der kan ændre pumpning.
- Brug en tilspidset nål til at passere en 6-0 silkesutur under LAD under iagttagelse med et dissektionsmikroskop. Sæt nålen under arterien med præcision som nålen vil komme ind i venstre hjertekammer kammer, hvis de placeres for dybt eller beskadige LAD hvis nålen er for lavvandet. Hvis LAD er skadet fjernes kanylen og suturere LAD at kontrollere blødning, men hvis blødningen ikke kan kontrolleres det at foretrække at aflive dyret.
- Lav en løs dobbelt knude med sutur, efterlader en diameter løkke 2-3 mm, hvorigennem et 2-3 mm langt stykke PE-10 rør er placeret 8.
- Stram løkken omkring arterien og slanger fastgør derefter sløjfen ved at binde en ekstra Slipknot, pas på ikke at beskadige ventrikel væg. Til permanent ligering direkte binde LAD med enknude 9. Bekræft okklusion af LAD ved at kontrollere for forekomsten af en blegere farve i den forreste væg af LV, der skal vises inden for et par sekunder efter ligatur.
- Fjern retractor og lukke såret midlertidigt ved at klemme huden sammen med en bulldog klemme. Længden af tid, iskæmi opretholdes afhænger af forsøget design, men er ofte 20, 30, 45 eller 60 min. Musen forbliver på ventilatoren for varigheden af LAD arterieokklusion.
6.. Reperfusion
- Efter iskæmi periode fjerne bulldog klip og indsæt brystet retraktorer at eksponere ligatur. Løsne knuden og fjern PE-10 rør. Bekræft reperfusion ved at observere et afkast på den pink-røde farve af den forreste væg af LV efter 15-20 sek.
- Lad suturen på plads, hvis 2% triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), og blåfarvning vil blive udført efter reperfusion. Hvis farvningen er ikke nødvendigt, kan suturen be fjernes.
- Reperfusion vil afhænge af eksperimentet design, sædvanligvis spænder fra 1 time til 24 timer.
7.. Bryst Lukning og Postoperativ pleje
- Luk brysthulen ved syning lukke snittet i 3. interkostalrum med 4-0 silke sutur. Det er vigtigt, at lungerne er klart af suturen og ikke bliver fanget som den 3. og 4. ribber er syet sammen. Mens binde sutur knob er det nyttigt at anvende et let tryk på brystet med nåleholderen at minimere ethvert rum luft, der kan være fanget i brysthulen.
- Luk alle lag af muskler med kontinuerlige suturer hjælp 4-0 silke. Brug nylonsuturer at lukke huden med en kontinuert sutur. Alternativt kan huden lukkes med afbrudt sutur.
- Når suturering er fuldstændig ophøre strømmen af isofluran mens ilt fortsætter med at flyde. Når musen bevæger sine whiskers eller hale det, skuldred begynde at gøre forsøg på at trække vejret spontant. Fjern musen fra ventilatoren med intubationsrøret stadig holdt i luftrøret.
- Overhold dyret forsigtigt, indtil musen genoptager en normal vejrtrækning mønster og derefter extubate musen. Røret bør fjernes langsomt for at undgå aspiration i mundhule sekreter.
- Bekræft musen ikke er i nogen åndedrætsbesvær ved at observere det for en anden 3-5 min før den returneres til et bur. Ved tegn på dehydrering observeres efter operationen, give op til 0,5 ml sterilt saltvand ved intraperitoneal injektion.
- Til post-operativ analgesi, administrere et opioidanalgetikum (buprenorphin, 0,1 mg / kg) subkutant (SC), inden dyret er ambulant, og derefter give en ekstra dosis hver 4-6 time i den næste 24 timer. Kontroller animalske tegn på lidelse på 12 timer efter operationen. Simulering af myokardieinfarkt hjælp overlevelse kirurgi kræver vurdering af smerte og lidelse efter genvinding fra surgery. Den nuværende accepteret bedste praksis er at give analgesi for første 24 timer efter en invasiv procedure med ekstra doser givet som berettiget på grund af vægttab eller tegn på smerte. Til permanent ligatur bør kropsvægt spores dagligt for at hjælpe til at måle dyrets opsving.
- Ibuprofen (Motrin), en non-steroide anti-inflammatorisk lægemiddel (NSAID) med anti-inflammatorisk, analgesi og antipyretisk aktivitet, eller andre NSAID, kan leveres i dyrets drikkevand som en løsning 0,2 mg / ml i to dage før operationen og op til 7 dage efter operationen i sammen med buprenorphin til at håndtere enhver yderligere smerte / lidelse.
8.. Måling af hjerteinfarkt Størrelse
- Bedøver og intubere musen i slutningen af ønsket reperfusion tid. Skær brystet huden i midterlinjen til xyphoid. Åbn maven og membranen under brystkassen og fra begge sider af medioklavikulærlinje. <li> Expose hjertet og derefter re-ligere LAD på samme sted. Cannulate aorta så 10% phthaloblå langsomt kan sprøjtes direkte ind i aorta til farvning hjertet til afgrænsning af den iskæmiske zone fra iskæmiske zone 10.
- Hurtigt udskære hjertet og vaske det i 30 mM KCl (kaliumchlorid opløsning) at ophøre med hjertets slag og give mulighed for mere konsekvent sektionering. Frys hjertet mindst 4 timer ved -20 ° C og skæres hjertet i skiver på 1 mm ved hjælp af en hjerte matrix sektionering anordning 11.
- Inkuber hjerte skiver med 2% TTC ved 37 ° C i 40 min. Det infarkt Området er afgrænset som et hvidt område, mens levedygtigt væv pletter rødt.
- Fastgør de farvede skiver med 10% formaldehyd natten, hvilket vil bidrage til at øge kontrasten mellem infarkt område og det normale væv. Fotografere skiver og beregne arealet i fare (AAR), den ikke-iskæmiske zone og infarkt område ved hjælp ImageJ software.
Måle cardiac troponin I (cTnI) niveauer i serum fra mus ved at opnå blod fra portåren og derefter isolering af serum ved centrifugering. Serum cTnI niveauer bestemmes derefter med en kvantitativ hurtig cTnI assay 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter 24 timer reperfusion, analyse af infarktstørrelsen og området-at-risk (AAR), ved phthaloblå farvestof og triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), ligering af LAD kan bekræftes ved at observere blanchering af myokardie væv distalt for sutur samt dysfunktion af den forreste væg. Reperfusion kan verificeres ved tilbagelevering af rød farve til myokardie væv og demonstration af en vis bedring af forreste væg bevægelse.
Infarkt områder (hvid), bør kunne skelnes fra områder med risiko (rød) og området ikke er i fare (blå). Anvendelse af phthaloblå farvestof (fig. 1A) tillader opløsning af området af hjertet, hvor okklusion af LAD, mens hjerter, som ikke er farvet med blåt farvestof kan kun vise området infarkt (figur 1B). Infarkt størrelser er afhængige af varigheden af iskæmi. Vigtigere er det, kardial troponin I (cTnI) er lavt i skinopererede dyr, der undergik allekirurgiske procedurer bortset fra iskæmi og reperfusion sammenlignet med dyr, der undergik myokardieinfarkt (figur 2). Dette indikerer simuleret operation gav ikke signifikant hjerte-patologi, mens iskæmi / reperfusion skade var tilstrækkelig til at frembringe elevation af denne udbredte biomarkør for MI.
Figur 1:. Kvantificering af omfanget af infarkt efter LAD okklusion kirurgi (A) repræsentant billede af vildtypemusen Hjertesektioners fra dyr udsat for 45 minutter iskæmi og 24 timers reperfusion. Injektion af blåt farvestof giver mulighed for vurdering af ikke-iskæmiske zone af hjertet, der ikke er i fare for en infarkt. (B) Et repræsentativt billede af et hjerte, hvor blåt farvestof ikke injiceresat understrege området-at-risk (AAR), som synes rødt og infarkt område, som forekommer hvidt. De områder i hver region beregnes som procentdele af den samlede venstre ventrikel (LV) areal ganget med den samlede vægt af denne skive. Klik her for at se større billede.
Figur 2:. Anvendelse af hjerte-troponin niveauer, som en måling af omfanget af hjerteinfarkt Et søjlediagram af kardial troponin I (CTnl) niveauer i mus udsat til 45 minutter iskæmi og reperfusion i 24 timer (I / R) eller simuleret operation som en kontrol. Blod blev opsamlet fra portvenen 24 timer efter kirurgi fra tre dyr i hver gruppe. Niveauerne af cTnI er signifikant forhøjet idyr efter I / R skade (9,195 ± 0,07146) sammenlignet med sham kontroldyr (1.195 ± 0,06651). Data er præsenteret som betyder ± SEM og *** angiver p <0,0001 sammenligne humbug kontrol og I / R-grupperne ved t-test. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus myocardiale iskæmi-reperfusion modeller er en effektiv metode til kardiovaskulære forskning for at simulere klinisk akut eller kronisk hjertesygdom 13,14. Betydelig indsats er blevet anvendt til at udvikle og forfine kirurgiske metoder, der producerer iskæmiske hændelser og reperfusion skade i hjerterne hos flere forskellige dyr typer. Mens der er særlige fordele ved brug af forskellige dyr systemer, musen har karakteristika, der har ført til en omfattende interesse i at producere myokardie I / R i mus hjerte. En af de vigtigste grunde er det genetiske spores musesystemet. Det omfattende udvalg af genmodificerede dyr til rådighed, og den relative lethed, hvormed nye modeller kan genereres til at behandle specifikke spørgsmål, har ingen match i andre dyremodelsystemer. En anden årsag til den stigende brug af mus i hjerte-kar-studier er den øgede tilgængelighed af kirurgisk udstyr og andre eksperimentelle værktøjer specifikkeallierede konstrueret til brug i mus. Den relativt lave omkostninger musemodeller er også en vigtig bidragyder til deres anvendelse i studier. Det stigende behov for stringens i prækliniske studier nødvendiggør brugen af yderligere dyr, som kan være mere realistiske, når færre ressourcer er nødvendigt at medtage et passende antal dyr. Mens brugen af musemodellen har flere fordele der er ulemper samt, især når man tager de forskellige aspekter af muse og human kardiovaskulær fysiologi. Mange større dyremodeller, såsom hund og svin, mere nøje efterligner de fleste aspekter af human kardiovaskulær fysiologi end musen. En anden ulempe er størrelsen af musen, manipulation af mindre hjertet i mus kræver en højere grad af kirurgisk dygtighed, især lokalisere LAD og reproducerbart at ligere det til at producere en ensartet infarktområde i den venstre ventrikel. Den præsenteres her metode kan give en betydelig forbedring i identifikationen ennd ligering af LAD. Vores konsistente resultater i mængden af cTnI frigivelse fra hjertet (fig. 2) foreslår, at vi reproducerbart kan generere infarkt af lignende størrelse og niveau af cardiomyocytter død.
Et centralt aspekt af kirurgi for at fremkalde eksperimentel myokardieinfarkt er den klar identificering og ligatur af LAD. I vores tilgang beskrevet her, har vi forbedret metode til at identificere og få adgang til LAD, der giver mulighed for en mere konsekvent positionering af ligatur på fartøjet. Under operationen, gør vi brug af et lille stykke steril bomuld til at løfte venstre atrium op og fuldt udsætte LAD, som tydeliggør position LAD og letter ligeringen af LAD. Dette er et afgørende skridt for teknik og en differentiering point fra andre tilgange. Indførelsen af disse ændringer for LAD ligatur bør give mulighed for mere reproducerbare resultater under simulering af MI i musemodeller. Mens forbedret præcision i stedetling af ligatur bør forbedre sammenhængen i størrelsen af infarkt genereret er det stadig vigtigt at måle risiko zone ved hjælp af perfusion af phthaloblå farvestof. Dette gælder især under anvendelse af genetiske modifikation muselinjer hvor manipulation af genekspression kan resultere i ændringer i respons blodkarrene i hjertet til ligatur.
Et andet afgørende trin under ligering i bekræfter, at iskæmi reelt er blevet genereret ved ligering af LAD. Observation af en særskilt, hurtig farveændring i risikoområdet er vigtigt at være sikker på, at iskæmiske tilstande er blevet produceret i en målrettet del af myokardiet. Ændringen i farve af myokardiet skal ses inden for et par sekunder, hvis LAD okkluderes effektivt. Andre kritiske trin i proceduren indebærer varigheden af den iskæmiske periode, og fristen for reperfusion før eksperimentelle endpoints måles. Som nævnt i PRotocol, kan længden af den iskæmiske periode varieres til at give forskellige grader af iskæmisk beskadigelse af hjertet. Generelt en længere periode iskæmi vil resultere i mere omfattende myocyt dødsfald i hele risikozonen. Længden af reperfusion kan have effekter på udviklingen af hjerte-patologi, herunder forekomsten af fibrotiske læsioner i hjertet samt stabiliseringen af minutvolumen og elektrofysiologiske forandringer. Således skal bestemt længde af disse eksperimentelle trin være skræddersyet til at tage de undersøgte i undersøgelsen konkrete spørgsmål. Skal også vælges De eksperimentelle endpoints baseret på længden af iskæmi og reperfusion perioder anvendes, og de specifikke spørgsmål, der skal behandles i eksperimentet. Vi præsenterer anvendelse af TTC-farvning til at måle infarktstørrelse og ELISA-målinger af serum cTnI niveauer, som endepunkter for at vurdere omfanget af skade på hjertet. Disse endepunkter kan bruges i længere reperfusion, men de er særligt useful kortere reperfusion perioder (24 timer), hvor funktionelle defekter måske ikke har stabiliseret sig endnu. Selvom vi ikke gå i detaljer her på funktionelle målinger af hjertets minutvolumen, såsom Doppler-ekkokardiografi 15 og mikrokugle målinger af koronare blodgennemstrømning 16, er nyttige til at forstå de ændringer i hjertets funktion under langsigtede eksperimenter, såsom kronisk okklusion af disse metoder LAD.
Mens brugen af musemodeller af MI har store fordele for studiet af I / R skade i hjertet er der stadig begrænsninger til disse fremgangsmåder. Da større kirurgiske snit skal foretages i brysthulen de resulterende væv forstyrrelser og associeret inflammation kan påvirke responset af hjertet til MI-effekter. Disse bekymringer kan delvist løses gennem brug af skinkirurgisk kontrol mus, hvor alle de kirurgiske trin er alle gennemført med undtagelse af en stramning af ligatur omkringLAD. Et andet problem, der er produceret af den invasive karakter af operationen er behovet for at styre smerte og lidelser, der opstår under og efter proceduren. Tilgange smertebehandling, der opfylder nuværende bedste praksis er beskrevet i denne procedure, og er nødvendige for at forhindre lidelser for forsøgsdyrene. Det er vigtigt at være opmærksom på, at brugen af mange forskellige typer af anæstetika og analgetika kan have hjertebeskyttende virkninger efter deres ansøgning. Således er det hensigtsmæssigt at anvende disse midler til kontrol mus, engang nogen kontrol mus, der ikke anvendes til fingeret operationer, for at undgå eventuelle komplikationer til fortolkning af eksperimentelle resultater. En anden begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at det ikke giver en perfekt simulering af patologi forbundet med menneske MI. Ofte de musemodeller anvendes til sådanne eksperimenter ikke lider co-morbiditet der ligger til grund for MI i mennesker, såsom koronar vaskulær sygdom, diabetes og forhøjet blodtryk. Sådannekomplikationer, der ikke er til stede i musemodel kunne have effekter på veje blive undersøgt i en bestemt eksperiment og bør derfor overvejes, når fortolke resultaterne. I disse tilfælde kan anvendelse af genetisk modificerede mus, der viser nogle af disse underliggende patologier være hensigtsmæssigt at mere effektivt at modellere sygdommen, da det ville præsentere i menneskelige patienter. I fremtiden kunne andre aspekter af denne tilgang blive ændret til mere præcist at simulere flere aspekter af den menneskelige MI patologi.
På trods af disse begrænsninger, de metoder, der er beskrevet her repræsenterer en effektiv metode til at producere lokaliseret I / R skade i mus, der simulerer mange af de patologiske virkninger af MI i humane patienter. Vor teknik giver mulighed for lettere manipulation af LAD, som kan føre til mere reproducerbare resultater og forenkle operationen. Men mestrer denne teknik kræver stadig en betydelig kirurgisk færdighed, som kun kan opnås gennem praksisproceduren. Tage tilstrækkelig omhu, når der udføres kirurgi, især på steder, hvor dette er noteret i protokollen, vil forbedre overlevelsen af dyr samt og reproducerbarhed af de eksperimentelle resultater. Når den kirurgiske metode er mestret, vil dette protokol vise sig ganske nyttigt at efterforskere studerer effekten af MI på kardiovaskulær fysiologi såvel som dem interesseret i at teste effekten af terapeutiske interventioner på en musemodel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Noah Weisleder er en grundlægger og Chief Scientific Officer hos TRIM-edicine, Inc.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of Arthritis og bevægeapparatet og hudsygdomme, en del af National Institutes of Health, under Award Number R01-AR063084. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming | Kent Scientific Corp | PS-RT | |
| Light source | Zeiss | KL 1500 LCD | |
| Mouse Heart Slicer Matrix | Zivic Miller | HSMS001-1 | |
| Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75) | Fine Science Tools | 6100A | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Buprenorphine (Buprenex Injectable) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| bupivacaine | Hospira | NDC 0409-1163-01 | |
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| Betadine Soultion | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA | Kamiya Biomedical Company | KT-58997 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Slim Elongated Needle Holder | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Round Handled Needle Holders | Fine Science Tools | 12075-12 | |
| Omano Trinocular Stereoscope | Microscope.com | OM99-V6 | |
| SB2 Boom Stand with Universal Arm | Microscope.com | V6 | |
| Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y | Kent Scientific Corp | RSP05T16 | |
| Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals | VetEquip, Inc | 901807 | |
| 4-0 silk taper suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk taper suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N |
References
- Abarbanell, A. M., et al. Animal models of myocardial and vascular injury. J Surg Res. 162, 239-249 (2010).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107, 1445-1453 (2010).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. , (2011).
- Salto-Tellez, M., et al. Myocardial infarction in the C57BL/6J mouse: a quantifiable and highly reproducible experimental model. Cardiovasc Pathol. 13, 91-97 (2004).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16, 41-44 (2005).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Exp Physiol. 89, 497-505 (2004).
- Shao, Y., Redfors, B., Omerovic, E. Modified technique for coronary artery ligation in mice. J Vis Exp. , (2013).
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).
- Nossuli, T. O., et al. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, 1049-1055 (2000).
- Cozzi, E., et al. Ultrafine particulate matter exposure augments ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, 894-903 (2006).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. J Vis Exp. , 3896 (2012).
- Nagarajan, V., Hernandez, A. V., Tang, W. H. Prognostic value of cardiac troponin in chronic stable heart failure: a systematic review. Heart. 98, 1778-1786 (2012).
- Borst, O., et al. Methods employed for induction and analysis of experimental myocardial infarction in mice. Cell Physiol Biochem. 28, 1-12 (2011).
- Diepenhorst, G. M., van Gulik, T. M., Hack, C. E. Complement-mediated ischemia-reperfusion injury: lessons learned from animal and clinical studies. Ann Surg. 249, 889-899 (2009).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7, 41691 (2012).
- Bamberg, F., et al. Accuracy of dynamic computed tomography adenosine stress myocardial perfusion imaging in estimating myocardial blood flow at various degrees of coronary artery stenosis using a porcine animal model. Invest Radiol. 47, 71-77 (2012).
